《芯片原理与技术》课件第二章 基因芯片

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-09-16,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-09-16,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-09-16,#,张彦婷,郑州大学生命科学学院,生物芯片原理及技术,第二章 基因芯片,基因芯片简介,基因芯片操作流程,cDNA,与寡核苷酸芯片,表达谱芯片,生物芯片,基因芯片,寡核苷酸微阵列,cDNA,微阵列,蛋白质芯片,芯片实验室,细胞芯片、组织芯片、糖芯片、其他芯片,基因芯片简介,基因芯片技术的产生和发展,DNA,体外聚合,重组,DNA,技术,PCR,（聚合酶链反应）技术,DNA,杂交技术,基因芯片简介,核酸分子固相杂交方法,菌落原位杂交（,Colony in situ hybridization,）,Southern,印迹杂交（,Southern blot,）,Northern,印迹杂交（,Northern blot,）,斑点杂交（,Dot blot,）,组织原位杂交（,Tissue in situ hybridization,）,反向杂交，基因芯片的前身,基因芯片简介,基因芯片（,gene chip,），,又称,DNA,微阵列（,DNA microarray,），,就是将大量已知,DNA,探针,整齐、高密度地,固定,在一块类似邮票大小的固体（如玻璃片、硅片或尼龙布等）支持物上；用标记好的核酸,样品进行杂交,，进而通过,检测,杂交后标记信号的强弱来判断样品中与探针对应的靶序列是否存在，数量。,基因芯片的基本原理,:,碱基互补匹配,。,基因芯片简介,8,提出问题,芯片设计,芯片制作,点样方法,在片合成,试样处理,芯片杂交,杂交检测,数据分析,实际应用,PCR,扩增,靶基因标记,表达差异分析,多态性分析,测序,生物信息学,数学优化,数据库,基因芯片的相关技术示意图,第二章 基因芯片,基因芯片简介,基因芯片操作流程,cDNA,与寡核苷酸芯片,表达谱芯片,基 因 芯 片 流 程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,一,.,芯片的制备,准备,点阵设计（芯片上核酸探针序列的选择以及排布）,固相支持物（即芯片片基）,生物分子,样品,在,芯片上的固定,制作芯片的仪器,芯 片 制 备,1.,点阵,的设计,基本方阵标记,空白点,对照,看家基因对照,探针基因,每种,2,或,4,点,芯 片 制 备,探针的设计：如何选择芯片上的探针,确定芯片所要检测的目标对象,查询生物分子数据库,取得相应的,DNA,序列数据,序列对比分析,找出特征序列，作为芯片设计的参照序列,数据库搜索,得到关于序列突变的信息及其它信息,芯 片 制 备,1.,点阵,的设计,即载体，用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为载体,载体表面必须有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联,单位载体上结合的生物分子达到最佳容量,载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学稳定性,载体具有良好的生物相容性,通常要有良好的光学性质，能适应投射或反射光的测量,芯 片 制 备,2.,固相支持物的种类和预处理,载体活化：,通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体表面键合上活性基团，以便与配基共价结合，形成具有不同的生物特异性的亲和载体，用来固定生物活性分子。,芯 片 制 备,2.,固相支持物的种类和预处理,刚性支持物：玻片、硅片、瓷片,膜性支持物：尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜,膜结合玻片、,FAST Slides,等,原位合成法的支持物：衍生出羟基等活性基团,直接点样法的支持物：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸,芯 片 制 备,2.,固相支持物的种类和预处理,（,1,）原位合成（,in situ synthesis,）适用于：寡核苷酸,原位光蚀刻,合成,原位,喷印合成,（,2,）合成后微点,样法适用于：大片段,DNA,、寡核苷酸、,mRNA,接触式点样（针式打印）,非接触式点样（喷墨打印,）,3.,生物样品的固定,芯 片 制 备,原位合成法（,in situ synthesis,):,采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的,芯片,。,适用于寡核苷酸,，多使,用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。,美国,Affymetrix,公司专利,芯 片 制 备,1.,光蚀刻,DNA,合成法：,由,Affymetrix,公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的,5,羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个,5,端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。,芯 片 制 备,光敏保护基团；光蚀刻掩膜（或蔽光膜）,芯 片 制 备,21,Probe Synthesis,array probes,A 3,3 array,CG,A,C,G,A,C,A,CG,A,G,CG,A,G,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,A, Mask 1,A,A,A,A,A,22,Probe Synthesis,array probes,A 3,3 array,C,G,A,C,G,A,C,A,C,G,A,G,C,G,A,G,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,C, Mask 2,C,C,C,C,C,C,A,A,A,A,A,23,Probe Synthesis,array probes,A 3,3 array,C,G,AC,G,AC,AC,G,A,G,C,G,A,G,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,G, Mask 3,C,C,C,C,C,C,A,A,A,A,A,G,G,G,G,G,G,A,Nucleotide Deposition,Sequence,defines the order of nucleotide deposition,A,Probe Embedding,specifies the steps it uses in the nucleotide sequence to get synthesized,芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的,DNA,固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。,2.,原位喷印合成法,芯 片 制 备,合成后微点样技术：,将,预先制备的,DNA,片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。,探针,的制备,已克隆的基因片段,PCR,，,RT-PCR,扩增的基因片段,人工合成的,DNA,片段,单,链、双链、,DNA,或,RNA,均可作为探针,芯 片 制 备,用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为,5nl,，大规模,cDNA,芯片多采用这种方法。,芯 片 制 备,2.,打印,针式打印（接触式点样,）,喷墨,打印（非接触式点样,）,芯 片 制 备,点接触法（,针式打印,）,优点：实验样机容易设计制作，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在,3.6cm,2,的面积内点,10000,个,cDNA,； 具有更强的亲和性和特异性杂交,缺点：每个样品必须是合成好的、经过纯化的、事先保存的,芯 片 制 备,针式打印法（接触式点样）,Best!,芯 片 制 备,喷墨法：,以定滴供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从最小的喷嘴内把生物样品喷射到载体上,与点接触法的差别在于喷嘴不与芯片接触,优点：,定量准确，重现性好，使用寿命,长,缺点,：,斑点大，探针密度低,芯 片 制 备,喷墨打印技术,芯 片 制 备,Cartesian,- PixSys Series,芯 片 制 备,SpotBot,TM,个人化全自动芯片点样仪,探针,的,固化,打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定,芯 片 制 备,基 因 芯 片 流 程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,1.,待检测样品中,mRNA,或,DNA,的提取及纯化,RNA,的稳定性,液氮或干冰,;,立即抽提,RNA,保护剂,纯化,2. RT-PCR,或,PCR,扩增靶片段,固相,PCR,系统,样 品 制,备,3.,样品的标记,标记物,荧光染料，如,Cy3,、,Cy5,生物素、地高辛,放射性核素，如,32,P,、,33,P,化学发光,金属离子,Au,和,Ag(,纳米金属,微粒,探针,),伴随,RT or PCR,过程,随机引物法、缺口平移法等,双,/,多色荧光标记,标记产物纯化,样 品 制,备,基 因 芯 片 流 程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,样品与,DNA,芯片上的探针阵列进行杂交,。,与,经典分子杂交的区别：,杂交时间短，,30,分钟内完成,可同时平行检测许多基因序列,影响杂交反应的因素：,盐浓度、温度、反应时间、,DNA,二级结构,分 子 杂 交,42,Example immobilized DNA probes showing hybridization,of unknown (target) to specific probe.,分 子 杂 交,基 因 芯 片 流 程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,激光共聚焦显微镜,激光,激发,使含荧光标记的,DNA,片段发射荧光,激光扫描仪或激光共聚焦显微镜,采集,各杂交点的信号,软件,进行,图象分析和数据处理,信 号 检 测,磷感屏成像系统,荧光芯片扫描仪,图像分析和数据处理软件,基于,光电倍增管（,PMT,）的检测,系统,-CCD,摄像,信 号 检 测,2. CCD,摄像,6400,点的基因芯片,（面积,12X14 mm),A successful microarray,experiment,:,Relatively low,background and,high and,uniform signals in,this image,provide a basis,for,comparison of,the microarrays,.,High background,检 测 分 析,Irregular spot morphology,Comet tails,检 测 分 析,Streaks,Low signal,检 测 分 析,1,、预制的基因芯片,2,、芯片滚动杂交仪,3,、全自动芯片 洗涤工作站,4,、芯片扫描仪,5,、分析系统,1,2,3,4,5,检 测 分 析,基 因 芯 片 流 程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,图像处理,与,数据,分析,单,通道基因芯片,white (v,ery,high),red (high),Yellow,(a little high),green,(medium),blue (low),black,(no),栅格化：确定点的位置,图象分割,(Segmentation),：将点从背景中分离出来。,抽提亮度：各个像素亮度的平均值,(mean),或中位数,(median),背景校正：局部或全局,图像处理,图像处理,与,数据分析,对于每个点，可以计算,Red intensity = R,fg,- R,bg,fg = foreground, bg = background, and,Green intensity = G,fg,- G,bg,and combine them in the log (base 2) ratio,Log,2,(,Red intensity,/,Green intensity,),Green intensity,(medium): 1,基因表达量的定量,图像处理与数据分析,运用哪些基因进行标准化,处理,芯片上大部分基因,(,假设芯片上大部分基因在不同条件下表达量相同,),不同条件间稳定表达的基因,(,如持家基因,),图像处理与数据分析,图像处理与数据分析,(1),差异表达基因的分析,(2),基因共表达分析,(3),基因表达数据的聚类,(4),Map to GO,(5),Gene regulatory network,(1),差异表达基因的分析,差异表达基因的分析,:,寻找处理前后表达上调或者下调的基因,Are the treatments different?,使用标准的统计学方法检验,(t-test or f-test),，发现统计显著性差异表达的基因，,如果处理本身并不显著，则结果无意义,图像处理与数据分析,(2),基因共表达分析,在,N,个不同的条件下,(,时间序列的芯片数据,),，考察基因,X,和,Y,的表达是否相似。,Gene 1#,是否与,Gene 2#,、,Gene 3#,和,Gene 4#,共表达？,共表达：,正相关：相似的表达谱，可能存在正关联,负相关：相反的表达谱，可能存在负调控,Gene Name,T1,T2,T3,T4,T5,T6,Gene 1#,1,2,3,4,5,6,Gene 2#,100,200,300,400,550,610,Gene 3#,660,540,430,320,210,101,Gene 4#,1504,215,357,2545,1670,998,图像处理与数据分析,DNA,芯片技术操作流程图,芯片的制作,直接购买商品化芯片,自行设计并向厂方定做,购买芯片点样仪、玻璃片基或膜；,购买,/,合成,Oligo DNA,或大规模,PCR,扩增目的片段；,点样及固定；,自制芯片,样品的制备和标记,待测样品核酸提取与纯化,标记,标记靶片段纯化,分子杂交,图像采集和软件分析,反转录标记,/PCR,标记,/,随机引物标记等,第二章 基因芯片,基因芯片简介,基因芯片操作流程,cDNA,与,寡核苷酸芯,片,表达谱芯片,cDNA,芯片,:,采用由,mRNA,反转录生成的,cDNA,作为探针制成的微阵列。,所用探针：,来源于,cDNA,文库或,EST,文库,制备方法：,合成后微点样,cDNA,芯片,cDNA,芯片的特点,优点,结合敏感性强；,信号强度大；,费用低；,可以根据需求快速制备；,缺点,探针长短差异造成退火温度差异大；,长探针存在非特异性交叉杂交；,只能同基因两两比较，不能多样本同时分析；,cDNA,芯片的缺陷：,由于,探针要来源于获得的,cDNA,克隆，因此全部实验下来周期很长，工作量,很大。,更,由于探针的长短大小不一，杂交条件也不同，因此由于实验体系本身导致信号强弱的变化甚至已经超过了待检测的样品，可靠性和,重复性差。,cDNA,芯片,寡核苷酸芯片,寡核苷酸芯片,:,将事先设计并合成好的,几个至几十个碱基的寡核苷酸,通过点样仪固定到载体上，或者通过原位合成技术固定在载体上制成的微阵列。,代表产品，,Affymetrix,公司的,Genechip,。其采用受专利保护的探针合成技术，通量高，灵敏度高，商品化程度高。,原位合成寡核苷酸探针,Affymetrix,公司专利：,光蚀刻原位合成技术,PM-MM,探针组,Affymetrix,设计出了一种独特的,PM-MM,探针方案,:,芯片上的每一个基因或,EST,都是由一个或几个探针组,(probe set),组成,;,每组探针组又由,11-20,对,25mer,的探针对,(probe pair),组成,;,每探针对包括两个探针池,(probe cell),，其中一个是完全匹配（,Perfect-Match,，,PM,）的，另外一个是序列中间有一个碱基错配的,(Mis-match, MM),。,Affymetrix,的,原位合成技术可制作的点阵密度高,达,10,6,10,10,/,cm,2,PM-MM,探针组,PM-MM,探针设计的优势,特异性好,灵敏度高,定量精确、重复性好,提供样品质,控,PM-MM,探针组,PM-MM,探针组,两次制备的同一样本，不同批次的芯片,寡核苷酸芯片的特点,优点：,探针长度小，减少二级结构形成；,减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；,原位合成，无需扩增，防止扩增错误影响实验；,杂交温度均一，提高杂交效率；,缺点：,费用较高；,种类更新慢，不能随意根据客户需求快速设计；,寡核苷酸芯片与,cDNA,芯片对比,类别,需要序列,种类交叉,点样密度,DNA,长度,摩尔比率,杂交速率,交叉杂交,质量控制,适应性,寡核苷酸,是,无,高,固定,均衡,快,低,容易,高,cDNA,否,有,低,多样,多样,慢,高,困难,低,寡核苷酸的应用,一、,DNA,测序、基因突变及多态性分析,1.,叠瓦式（,T,iling,）阵列,又称砌砖式阵列，是非常适合全基因组分析的针对所有转录本的,DNA,微阵列,2.,杂交,测序（,SBH,）寡核苷酸阵列,（,1,）测序,杂交,测序方法,，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的,方法,任何线性,DNA,或,RNA,单链均可分解为一系列碱基数固定、错落重叠的寡核苷酸,片段，或,称为,亚,序列,被标记的靶序列与芯片进行杂交后，芯片上所有杂交信号的位点组成一个,“,杂交模式,”,，该,“,杂交模式,”,实际上反应的是靶序列的所有,n,体亚序列信息，计算机通过对该,“,杂交模式,”,的分析就可以确定靶核酸的序列。,寡核苷酸的应用,以,8,个碱基的序列为例,寡核苷酸的应用,75,采用,SBH,技术，用含,65,536,个,8,聚寡核苷酸的微阵列，可测定,200bp,长,DNA,序列，采用,67,108,864,个,13,聚寡核苷酸探针的微阵列，可对数千个碱基长的,DNA,测序。,寡核苷酸的应用,2.,可用于发现新的基因突变或多态性位点,例：测,GTATCAGCATXGCCATCGTGC,中,X,位点的基因突变或多态性,可设计序列,AGTCGTA,A,CGGTAGC,AGTCGTA,C,CGGTAGC,AGTCGTA,G,CGGTAGC,AGTCGTA,T,CGGTAGC,寡核苷酸的应用,3.,邻堆杂交阵列,邻堆杂交阵列（,contiguous stacking hybridization, CSH,）阵列,检测原理,是，较短的寡核苷酸（,5bp,）不能与样品核酸形成稳定的双链，但是将一条较长的寡核苷酸与一条较短的寡核苷酸同时与样品核酸序列杂交，且两条寡核苷酸相邻，由于邻近碱基的堆积作用，则会形成稳定双链。,寡核苷酸的应用,二、基因差异表达分析和基因鉴定,主要分析两组,来源不同的,mRNA,转录丰度的差异,寡核苷酸芯片最广泛最常见的应用,两组,mRNA(,正常对照和待测样本,),分别反转录成,cDNA,，并分别搀入可分辨的不同荧光素标记,两者同比例混合并同时与寡核苷酸芯片杂交,通过计算机计算两组样本杂交信号的比值，确定表达差异,寡核苷酸的应用,79,R,R,R,R,G,G,:,A,B,:,A,=,B,:,A,B,S,a,m,p,l,e,A,S,a,m,p,l,e,B,p,r,e,p,a,r,a,t,i,o,n,o,f,m,R,N,A,l,a,b,e,l,e,d,c,D,N,A,m,i,x,i,n,g,h,y,b,r,i,d,i,z,a,t,i,o,n,p,r,e,p,a,r,a,t,i,o,n,o,f,m,R,N,A,l,a,b,e,l,e,d,c,D,N,A,基因表达分析示意图,三、肿瘤发生机理、肿瘤分型和诊断,肿瘤的发生和发展往往涉及多种异常基因,通过检测肿瘤相关基因表达水平的变化，可以提示肿瘤的发生机理和作为临床诊断的标准,寡核苷酸的应用,Affymetrix,公司已制造,出检测,p53,抑癌基因突变芯片，还开发了检测,HIV,转录酶基因、乳腺癌相关基因,BRCA1/BRCA2,基因和细胞色素,P450,基因等突变的芯片,寡核苷酸的应用,四,.,疾病诊断,将许多特定的寡核苷酸固定在载体上，检测病原,cDNA,或,DNA,是否存在、存在量多少。,寡核苷酸的应用,五、药物筛选和指导合理用药,两大领域,药物筛选,直接检测化合物对生物大分子的结合作用,检测化合物作用于细胞后基因表达的变化,指导临床用药,检测用药前后组织基因表达差异、评估药物的毒性、代谢特点及治疗效果等,寡核苷酸的应用,第二章 基因芯片,基因芯片简介,基因芯片操作流程,cDNA,与寡核苷酸芯片,表达谱芯片,基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在,mRNA,表达水平的变化。,双,色荧光系统,单色荧光系统,表达谱芯片,双色荧光系统,cDNA,芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片,实验组及对照组两种组织的,mRNA,在反转录成,cDNA,的过程中分别标记上,Cy3,和,Cy5,两种荧光，制备成探针，竞争性地与芯片上的核酸片段进行杂交,两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量，通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中基因表达是否有变化。,数据分析,、,寻找差异表达的基因,Cy3,标记的,A,组织,mRNA,Cy5,标记的,B,组织,mRNA,混合探针,以两种波长的激光扫描,Cy3-532nm,Cy5-635nm,杂交,双荧光系统芯片的原理及流程图,单色荧光系统,较短的寡核苷酸芯片如,Affymatrix,芯片；载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用，如,Illumina,芯片,实验组和对照组分别用同样的荧光物质标记（或生物素,biotin,），分别与芯片杂交，即一张芯片只杂交一个样本,根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个片段结合，通过与对照组的比较转化成基因表达的改变,数据分析,、,寻找差异表达的基因,探针,A,：,biotin,标记,扫描,杂交,探针,B,：,biotin,标记,两张芯片上相同位点信号比,单荧光系统芯片的原理及流程图,单通道和双通道的比较,单通道实验结果重复性更好，使得比较不同样品之间各种基因表达的相对比例是可靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的比较时，只需在多个样本中设置对照。由于点样的是寡核苷酸，探针无法检测。,双通道（点样,cDNA,）重复性相对较差，但是探针可以测序验证。双色法需在每次杂交检测中设置对照，只能进行两个样品之间的比较，芯片之间的比较并不可靠,Using cDNA Microarrays to Measure mRNA Levels,ACCTG.G,ACCTG.G,ACCTG.G,TTCTG.A,TTCTG.A,TTCTG.A,GGCTT.C,GGCTT.C,GGCTT.C,ATCTA.A,ATCTA.A,ATCTA.A,ACGGG.T,ACGGG.T,ACGGG.T,CGATA.G,CGATA.G,CGATA.G,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,Sample 1,Sample 2,Microarray Slide,Spots,(Probes),Unknown,mRNA,Sequences,(Target),Extract mRNA,ACCTG.G,ACCTG.G,ACCTG.G,TTCTG.A,TTCTG.A,TTCTG.A,GGCTT.C,GGCTT.C,GGCTT.C,ATCTA.A,ATCTA.A,ATCTA.A,ACGGG.T,ACGGG.T,ACGGG.T,CGATA.G,CGATA.G,CGATA.G,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,Sample 1,Sample 2,Convert to cDNA and Label with Fluorescent Dyes,ACCTG.G,ACCTG.G,ACCTG.G,TTCTG.A,TTCTG.A,TTCTG.A,GGCTT.C,GGCTT.C,GGCTT.C,ATCTA.A,ATCTA.A,ATCTA.A,ACGGG.T,ACGGG.T,ACGGG.T,CGATA.G,CGATA.G,CGATA.G,Sample 1,Sample 2,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,Sample 1,Sample 2,Mix Labeled cDNA,ACCTG.G,ACCTG.G,ACCTG.G,TTCTG.A,TTCTG.A,TTCTG.A,GGCTT.C,GGCTT.C,GGCTT.C,ATCTA.A,ATCTA.A,ATCTA.A,ACGGG.T,ACGGG.T,ACGGG.T,CGATA.G,CGATA.G,CGATA.G,Sample 1,Sample 2,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,ACCTG.G,ACCTG.G,ACCTG.G,TTCTG.A,TTCTG.A,TTCTG.A,GGCTT.C,GGCTT.C,GGCTT.C,ATCTA.A,ATCTA.A,ATCTA.A,ACGGG.T,ACGGG.T,ACGGG.T,CGATA.G,CGATA.G,CGATA.G,Sample 1,Sample 2,Hybridize cDNA to the Slide,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,ACCTG.G,ACCTG.G,ACCTG.G,TTCTG.A,TTCTG.A,TTCTG.A,GGCTT.C,GGCTT.C,GGCTT.C,ATCTA.A,ATCTA.A,ATCTA.A,ACGGG.T,ACGGG.T,ACGGG.T,CGATA.G,CGATA.G,CGATA.G,Sample 1,Sample 2,Excite Dyes with Laser,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,ACCTG.G,ACCTG.G,ACCTG.G,TTCTG.A,TTCTG.A,TTCTG.A,GGCTT.C,GGCTT.C,GGCTT.C,ATCTA.A,ATCTA.A,ATCTA.A,ACGGG.T,ACGGG.T,ACGGG.T,CGATA.G,CGATA.G,CGATA.G,Sample 1,Sample 2,Scan,?,?,?,?,?,?,?,?,?,?,Quantify Signals,ACCTG.G,7652,138,TTCTG.A,5708,4388,GGCTT.C,8566,765,ATCTA.A,1208,13442,ACGGG.T,6784,9762,CGATA.G,67,239,Sample 1,Sample 2,Reverse Transcriptase,in vitro transcription,mRNA,cDNA,Fragmentation of cRNA,cRNA,GeneChip Hybridization,标记,Affymetrix Expression Analysis,实验过程,样本制备,样本标记,预杂交,杂交,洗涤,染色（如生物素标记）,扫描,数据分析,Oligonucleotide chips,Hybridization process of GeneChip,L,L,L,Labeling cRNA fragment,L,L,Hybridization mixture,Eukaryotic,Hyb.Control,Control,Oligo B2,hybridization,（,16hour,）,Data analysis,Scan,Wash & stain,基因表达谱示意图,胶质瘤,脑组织,表达谱芯片的应用,基因表达谱芯片可以将克隆的成千上万个基因特异的探针或其,cDNA,片段固定在一块,DNA,芯片，对来源于不同的个体（正常人与患者）、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下的细胞内,mRNA,或反转录后产生的,cDNA,进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,例,1,：基因芯片技术筛选结直肠癌腹膜转移相关基因,表达谱芯片的应用,目的,:,采用,全基因组表达谱芯片,筛选结,直肠癌腹膜转移相关基因，并用,real-time PCR,验证,方法：,收集,手术切除,3,例伴有腹膜种植转移的结直肠腺癌病人原发病灶和正常黏膜的新鲜组织标本，提取总,RNA,，经逆转录合成,cDNA,后经体外扩增,合成,c,RNA,，,Cy3,荧光分子标记后和人类全基因组表达谱芯片杂交,采用经验贝叶斯方法（,P0.05,）筛选出差异表达基因，并用,RT-PCR,实验对部分差异表达基因进行验证,表达谱芯片的应用,标本收集,组织标本总,RNA,抽提,RNA,扩增及标记,芯片杂交和信号检测,生物信息学分析,基因芯片表达谱数据的筛选,选取差异表达基因,实时定量,RT-PCR,验证,表达谱芯片的应用,满足,P0.05,的基因共有,105,个,。其中和正常组织相比，在肿瘤组织表达上调的基因有,42,个，在肿瘤组织表达下调的基因有,63,个,进行基因功能的注释和基因富集分析,。初步的分析结果，富集分数最高的前四个类别分别是细胞迁移，膜界囊泡，氧化还原反应，肽酶水解酶活性。,3,条,感兴趣的基因,，它们分别是,S100P,；,PRDX1,；,SLPI,表达谱芯片的应用,表达谱芯片的应用,结论：,已出现腹膜转移的结直肠癌原发肿瘤组织和配对正常组织的全基因组,mRNA,表达水平的差异，发现许多表达差异的基因，对这些基因的进一步研究，有助于筛选和鉴定肿瘤标记物为早期诊断及判断预后奠定基础。,表达谱芯片的应用,例,2,：应用,基因表达谱芯片研究高果糖大鼠胰岛素抵抗相关基因,表达谱芯片的应用,目的：,比较正常大鼠和高果糖大鼠骨骼肌组织基因表达差异,RNA,提取,和探针标记：,用,Cy3-dUTP,标记,正常对照组,，,Cy5-dUTP,标记,高果糖,组,芯片,杂交：,大,鼠,表达谱芯片,由上海联合基因公司,制备,.,将,基因芯片和,探针分别在,95,充水浴,中,变性,5min,，,将探针加在基因,芯片,上，用盖玻片封片，,置于,42,度杂交,16h,检测与,分析：,荧光仪扫描,，,用,Gene Pix 4.0,软件分析,Cy3,和,Cy5,两种,荧光信号的,强度和比值,用,管家基因,进行,Cy3,和,Cy5,均衡,定量,RT-PCR,验证,表达谱芯片的应用,表达谱芯片的应用,如果,Cy3,信号,较强，该点,显绿色,，下调趋势,;,如果,Cy5,信号较强,，该点,显红色,，上调趋势,;,如果,强度相似，,显黄色,表达谱芯片的应用,异表达的基因,有,140,条,;,表达上调的,基因,62,条，表达,下调的,基因,78,条,表达谱芯片的应用,图像处理,与数据标准化,基因,芯片的数据分析,图像处理,与数据标准化,单,通道基因芯片,white (v,ery,high),red (high),Yellow,(a little high),green,(medium),blue (low),black,(no),栅格化：确定点的位置,图象分割,(Segmentation),：将点从背景中分离出来。,抽提亮度：各个像素亮度的平均值,(mean),或中位数,(median),背景校正：局部或全局,图像处理,图像处理,与数据标准化,对于每个点，可以计算,Red intensity = R,fg,- R,bg,fg = foreground, bg = background, and,Green intensity = G,fg,- G,bg,and combine them in the log (base 2) ratio,Log,2,(,Red intensity,/,Green intensity,),Green intensity,(medium): 1,基因表达量的定量,图像处理,与数据标准化,1.,图像分析,2.,扫描,3. DNA,杂交过程,(,温度、时间、混合均匀程度等,),4.,探针的标记,5. RNA,的抽提,6.,加样,7.,其他,Microarray:,误差的来源,图像处理,与数据标准化,运用哪些基因进行标准化,处理,芯片上大部分基因,(,假设芯片上大部分基因在不同条件下表达量相同,),不同条件间稳定表达的基因,(,如持家基因,),图像处理,与数据标准化,before,after,数据标准化,主要目的,是消除由于实验技术所导致的表达量,(Intensity),的变化，并且使各个样本,(sample),和平行实验的数据处于相同的水平，从而使我们可以得到具有生物学意义的基因表达量的变化,。,图像处理,与数据标准化,图像处理与数据标准化,基因,芯片的数据分析,基因芯片的数据分析,(1),差异表达基因的分析,(2),基因共表达分析,(3),基因表达数据的聚类,(4),Map to GO,(5),Gene regulatory network,(1),差异表达基因的分析,差异表达基因的分析,:,寻找处理前后表达上调或者下调的基因,Are the treatments different?,使用标准的统计学方法检验,(t-test or f-test),，发现统计显著性差异表达的基因，,如果处理本身并不显著，则结果无意义,基因芯片的数据分析,(2),基因共表达分析,在,N,个不同的条件下,(,时间序列的芯片数据,),，考察基因,X,和,Y,的表达是否相似。,Gene 1#,是否与,Gene 2#,、,Gene 3#,和,Gene 4#,共表达？,共表达：,正相关：相似的表达谱，可能存在正关联,负相关：相反的表达谱，可能存在负调控,Gene Name,T1,T2,T3,T4,T5,T6,Gene 1#,1,2,3,4,5,6,Gene 2#,100,200,300,400,550,610,Gene 3#,660,540,430,320,210,101,Gene 4#,1504,215,357,2545,1670,998,基因芯片的数据分析,(3),基因表达数据的聚类,将表达谱相似的基因聚类在一起,发现新的模式,聚类方法：,A. Hierarchical clustering,B.,K,-means clustering,基因芯片的数据分析,(4),Map to GO,通过基因芯片，找到了一批“,interesting,”,的,基因,生物学功能上是否存在关联？,基因本体（,Gene Ontology, GO,）：,GO,数据库把基因的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。,基因芯片的数据分析,(5),Gene regulatory network,早期观点：,表达谱相似的基因可能存在功能上的关联，可能有相互作用, (,直接作用,),。,当前的观点：,表达谱相似的基因可能具有共同的调控元件,(,基因,UTR,区域存在共同的,Promotor),能够被同一个上游因子所调控。,基因芯片的数据分析,基因芯片的发展方向,1.,减小实验误差，提高精确度,2.,基因芯片的数据处理,3.,降低成本,4.,基因芯片技术的国产化,5.,基因芯片与其他类型芯片的有机结合,6.,资源共享,