荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,荧光分光光度法测定药液维生素,B,2,的含量,实验目的,学习荧光分光光度法测定药液中维生素,B,2,的分析原理。,掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药液中维生素,B,2,的方法。,1,实验原理,荧光分析法,常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。,在稀溶液中，荧光强度,I,F,与物质的浓度,c,有以下的关系：,当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：,这是荧光光谱法定量分析的理论依据。,2,a.,与紫外,-,可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。,b.,选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。,c.,所需试样量少、操作方法简便。,荧光分析法的特点,3,激发光谱：固定测量波长,(,选最大发射波长,),，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。,发射光谱：固定激发光波长,(,选最大激发波长,),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。,固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。,荧光光谱,激发光谱,发射光谱,4,荧光分析仪器,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：,荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：,a.,荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；,b.,荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,液槽,显示器,单色器,检测器,I,0,I,I,f,光源,单色器,5,a.,光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。,b.,单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。,c.,检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。,仪器部件,6,维生素,B,2,（又叫核黄素，,VB,2,）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：,维生素,B,2,易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。,药液维生素,B,2,含量的测定,7,维生素,B,2,溶液在,430,440 nm,蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为,525 nm,。,VB,2,的荧光在,pH=6,7,时最强，在,pH=11,时消失。维生素,B,2,在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测,VB,2,的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。,光黄素,8,实验预习,预习荧光分光光度法测定维生素,B,2,的分析原理。,了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素,B,2,的方法。,9,F96,型荧光光度计（上海棱光分析仪器有限公司）,5 mL,吸量管,1,只，,2 mL,吸量管,1,只，,50 mL,容量瓶,7,只,10.0gmL,-1,VB,2,标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（,AR,），,药用,VB,2,试样,仪器与试剂,10,1.,打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。,2.,仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长,= 440 nm,（本仪器只有,356 nm,），发射波长,=540 nm,。,3.,样品测定。,4.,退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。,基本操作,11,1.,标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定,：,在六个干净的,50 mL,容量瓶中，分别吸取,0.50,、,1.00,、,1.50,，,2.00,、,2.50,和,3.00 mL VB,2,标准溶液，各加入,2.00 mL,冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。,2.,未知试样的测定,:,移取,0.1 mL,试样,用少量水溶解后转入,50 mL,容量瓶中，加,2.00 mL,冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。,实验步骤,12,1.,用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。,2.,根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中,VB,2,含量。,数据处理,13,1.,解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。,2.,维生素,B,2,在,pH,6,7,时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？,注意事项和问题,14,