电泳和色谱分离技术应用

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,制作者：黄德春,制作者：黄德春,制作者：黄德春,制作者：黄德春,制作者：黄德春,制作者：黄德春,制作者：黄德春,高等制药分离工程,第6章蒸发,电泳分离技术,1,概述过程特点,第一节电泳基本概念,1、,电泳,是指带电荷的供试品(蛋白质、核甘酸等)在惰性支持介质中(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)在电场作用下向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。,电泳技术是实验室中分析、鉴定和分离技术之一。,2,概述过程特点,第一节电泳基本概念,2、电泳分类：,3,概述过程特点,第二节 电泳分离基本原理,带电粒子在电场中产生定向迁移，引起其迁移所受力（F)与电场强度(E)和粒子所带净电荷（Z)成正比:,粒子在电场中所受力与溶液黏度、分子半径、及稳态下移动速度有关,4,各种不同分子量的蛋白质在电场内迁移速率与它的净电荷数成正比，而与其分子半径及溶液黏度成反比。,实验证明，,蛋白质,的电泳迁移速率与,蛋白质分子量的对数成线性关系,5,根据此性质，可对具有相同电荷，不同分子量的蛋白质进行分离。,6,电泳技术分类,影响电泳迁移率的因素,电场强度。电场强度是指单位长度(cm)的电位降也称电势梯度。根据电场强度不同，将电泳分为常压电泳(2-10V/cm)和高压电泳(20-200V/cm)。电场强度高，带电质点的迁移率加速，因此省时，但会产生大量热量。,7,溶液的pH值。溶液的pH值决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。,对于带有两性基团的电解质，溶液存在一pH值，此时，溶液所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，在电场中不再移动，这一pH值称为电解质的等电点（isoelectric point, PI)。,若溶液pH值处于等电点酸侧，即pHp I，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动；,若溶液pH值处于等电点碱侧，即pHpI，则蛋内质带负电荷,向正极移动。溶液的pH值离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。,8,溶液的离子强度,一方面，,电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。,带电质点吸引相反电荷的离子聚集其周围，形成一个与运动质点电荷相反的离子氛(ionic atmosphere),离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。,另一方面，,离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响,质点的带电量，改变泳动速度。,9,电渗。在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗(electroosmosis)。由于电渗的影响，质点迁移的表观速度不同于其固有速度。,因固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH,-,带负电荷，而与纸接触的水溶液因产生H,3,O,+,，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表观速度比其固有速度要快；若质点原来移向正极，表观速度比其固有速度要慢。因此应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。,10,电泳的技术问题和对策：,影响迁移速率的主要因素,（1）各组分的分子净电荷数;(2)分子量;(3)电泳系统介质的有效黏滞度。,（1）一般控制溶液pH4.5-9.5范围内。,（2）选择适当的缓冲系统。,（3）表面活性剂,（4）控制电泳系统介质的有效黏滞度,11,（5）电泳过程的产热问题,A、蛋白质变性;B、引起区带扩散，降低分辨率。,最常采用的办法是将电泳产生的热量从电泳系统中移出，保持电泳温度恒定。,12,概述过程特点,第11章 色谱分离过程,色谱法指多种成分的混合物，由于在流动相和固定相中有不同的分配，在流动过程中，经多次分配后而获得分离。,同其他传统分离纯化方法相比，色谱分离过程具有如下特点。,1、应用范围广,2、分离效率高,3、操作模式多样,4、高灵敏度在线检测,13,概述过程特点,色谱分离过程的基本原理,色谱分离过程的实质是溶质在不互溶的固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等差异而使不同的溶质分离 。即混合物中各个组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱而得到分离。,14,15,概述过程特点,固定相,色谱柱填料分为球形颗粒填料和不规则形状颗粒填料。具有较高的机械强度，不易破碎，柱的填装重视性好，并可增加样品在柱中的渗透性。,色谱分离过程常用柱填料有以下几种。,（1）硅胶衍生的固定相;（2）活性炭;（3）离子交换树脂;（4）大孔吸附树脂;（5）凝胶;（6）手性固定相.,16,概述过程特点,色谱柱及柱技术,色谱柱是色谱技术的核心， 色谱柱的性能依赖于三个因素：色谱柱填充技术、柱设计和生产。,（1）色谱柱填装方法,17,概述过程特点,（2）色谱柱设计,以使被分离物质以“面进样”而不是“点进样”的方式分布在柱头截面上，形成平整的活塞流，减少谱带扩张。,18,概述过程特点,色谱的分类,1、按两相状态分类,按流动相状态分类,气相色谱（GC); 液相色谱（LC);超临界流体色谱（SFC)。,按固定相状态分类,气-固色谱（GSC);气-液色谱（GLC),液-固色谱（LSC);液-液色谱（LLC）,19,概述过程特点,色谱的分类,2、按处理量分类,根据分离样品量的不同，以分离纯化为目的的色谱可分为：半制备（semi-preparative，微克级至克级）、大规模（Large scale，克级至千克级）、生产型 （industrial scale or process，克级至千克级）几种类型色谱。,20,概述过程特点,色谱的分类,3、按分离机制分类,分子排阻色谱或凝胶过滤色谱（size exclusion chromatography，SEC或gel,filtration chromatography，GC）。,离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）。,21,概述过程特点,色谱的分类,3、按分离机制分类,疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）。,亲和色谱（affinity chromatography，AC）。,正相/反相色谱（normal/reversed phase chromatography，N/R PC,22,概述过程特点,色谱的分类,3、按使用目的分类,分析用色谱,制备用色谱,流程用色谱,23,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,保留值、分离度和柱效应,（1）保留值,保留值通常以保留时间 及容量因子 来表示。,保留值是色谱过程的基本热力学参数之一。它也是色谱定性的基本依据。,从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间,为保留时间，与固定相和流动相的性质、柱温、流速、柱体积等因素有关。,24,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,容量因子指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间达到平衡时的质量之比。,它与柱尺寸及流速无关，而与溶质在两相间的分配性质、柱温及固定相和流动相之体积比有关。,25,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,保留值、分离度和柱效应,（1）分离度,相邻色谱峰峰顶之间的距离除以两色谱峰的平均宽度。,当R=1时，两色谱峰的分离程度可达94%；当R=1.5时，两个色谱峰已完全分离。,26,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,保留值、分离度和柱效应,（1）柱效应：用塔板高度和塔板数衡量色谱柱效应 。,有效塔板数和有效塔板高度,27,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,色谱理论模型,（1）速度方程理论,A、B、C分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数和传质阻力项系,（2）平衡色谱理论,假定在整个过程中，色谱柱中不存在传质阻力，溶质在固定相和流动相中分配平衡能瞬间完成。,28,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,即在色谱柱内任何时刻和位置，溶质在固定相和流动相中的浓度均符合等温方程,由于忽略了非理想流动及各种传质阻力的存在，这个模型是比较粗略的。,29,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,（3）塔板理论,塔板理论将色谱过程比拟为蒸馏过程，不同色谱柱看成是由一系列理论塔板所组成。在一个理论板当量高度HETP的柱高内，溶质在两相间达到一次平衡。由塔板理论可计算理论塔板数及塔板高度.但它是半经验式理论，不能揭示色谱过程本质。,30,概述过程特点,色谱分离过程基础理论,（4）轴向扩散理论,在色谱过程中，组分在流动相中的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素，而有限的传质速率对区域谱带扩张没有影响。轴向扩散理论的基本方程为,轴向扩散理论考虑了溶质在流动相和固定相间的传质速率及流动相的流动状态，当传质速率较快而轴向扩散为区域扩张的主要因素时，该理论具有较好的指导意义。,31,概述过程特点,气相色谱及其应用,气相色谱仪,以惰性气体（载气）作为流动相，以固定液或固体填充剂作为固定相的色谱设备。处理的对象是低分子量或易挥发化合物。不适宜高分子化合物及热敏性化合物的分离和分析。,32,概述过程特点,气相色谱及其应用,气相色谱仪,气路系统(气源、净化器、气流控制装置）;,进样系统(注射器、六通阀、自动进样器）;,分离系统(色谱柱、柱箱）;,检测系统和数据处理系统。,33,概述过程特点,高效液相色谱及其应用,高效液相色谱仪,以液体为流动相的色谱技术，具有以下特点：,高压、高速、高效、高灵敏度且分析使用样品量小。,组成：高压输液系统、进样系统、色谱柱分离系统、检测器和数据处理系统。,34,概述过程特点,高效液相色谱及其应用,均一洗脱和梯度洗脱,正向和反向液相色谱,35,概述过程特点,制备型超临界流体色谱,一、原理：,二、特点：,（1）流动相密度可调;,(2)被分离组分与流动相易实现分离;,(3)流动相回收简便。,三、局限：,36,