实验二 食品中总氮的测定

,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,1、测定原理、测定方法、注意事项。,1、蛋白质的性质和测定意义；,2、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；,3、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。,2.,重点,1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。,3.,难点,3.,1.,基本知识点,实验二 食品中总氮的测定,学习目标,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,一、概述,凯氏,（,Kjeldah,）,定氮法是目前普遍采用的测定有机,N,总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也是,GB/T 5009.5-2003,食品中蛋白质的测定,第一法，由于该法是丹麦人道尔（,J.Kjeldah）,于1883年提出用于测定研究蛋白质而得名。,凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总,N,量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含,N,物质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含,N,物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为,粗蛋白质。,对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的,pro,的元素组成百分比。,一般来说，,pro,的平均含氮量为16%，即1份,N,素相当于6.25份蛋白质，所以在用凯氏定氮法定量,pro,时，将测得的总氮%乘上,pro,的换称参数,K=6.25,即为该物质的,pro,含量。,蛋白质含,N,量的倒数称为蛋白质换算系数。,元素,C,H,O,N,S,P,百分比,50,7,23,16,0,3,0,3,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,一、概述,但是我们必须要知道，食品种类不同，蛋白质的组成也不一样，其,N,量也不相同，蛋白质换算系数差别很大，我们在测定,pro,时，应该是不同的食品采用不同的换算等数。如：玉米、荞麦为6.25， 花生：5.46；大米：5.95；大豆及其制品：5.71；面粉：5.70；乳制品：6.38；,凯氏定氮法,（,Kjeldahl determination,）,有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添量不同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。,有些样品中含有难以分解的含,N,化合物，如：蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作催化剂，18小时或更长时间也难经分解，单独用汞化合物， 在短时间内即可，但它有毒性。,下面主要介绍,微量凯氏定氮法。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,二、原理,蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。,凯氏定氮法,（化学）,反机理如下：,1、,2,CH,3,CH,COOH+13H,2,SO,4,=,（,NH,4,）,2,SO,4,+6CO,2,+12SO,2,+16H,2,O,NH,2,2,、（,NH,4,）,2,SO,4,+2NaOH=2NH,3,+Na,2,SO,4,+2H,2,O,3,、,2NH,3,+2H,3,BO,3,=(NH,4,),2,B,4,O,7,+5H,2,O,4,、,(NH,4,),2,B,4,O,7,+HCL+5H,2,O=2NH,4,CL+4H,3,BO,3,反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。,为了加速消化，可以加入,CuSO,4,作催化剂，,K,2,SO,4,以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,三、方法摘要,Kjeldahl determination,测定蛋白质含量主要分三个步骤：,（一）消化,样品中的有机物和含,N,有机化合物，经浓,H,2,SO,4,加热消化，,H,2,SO,4,使有机物脱水，炭化为碳；碳将,H,2,SO,4,还原为,SO,2,，而本身则变为,CO,2,；SO,2,使,N,还原为,NH,3,，而本身则氧化为,SO,3,，而消化过程中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在反应中生成物,CO,2,、H,2,O,和,SO,2,、SO,3,逸去，而,NH,3,与,H,2,SO,4,结合生成（,NH,4,）,2,SO,4,留在消化液中。,蛋白质,+,H,2,SO,4,C,C+ H,2,SO,4,SO,2,+CO,2,SO,2,+N,NH,3,+SO,3,NH,3,+ H,2,SO,4,（,NH,4,）,2,SO,4,2CH,3,CH,COOH+13H,2,SO,4,=,（,NH,4,）,2,SO,4,+6CO,2,+12SO,2,+16H,2,O,NH,2,脱水,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,三、方法摘要,（二）碱化、蒸馏,（,NH,4,）,2,SO,4,在碱性条件下，加热蒸馏，释放出氨。,（,NH,4,）,2,SO,4,+2NaOH=2NH,3,+Na,2,SO,4,+2H,2,O,（,三）吸收、滴定,蒸馏过程中所放出的,NH,3,，可用一定量的标准硼酸溶液吸收，再用标准盐酸溶液直接滴定。,2,NH,3,+2H,3,BO,3,=(NH,4,),2,B,4,O,7,+5H,2,O,(NH,4,),2,B,4,O,7,+HCL+5H,2,O=2NH,4,CL+4H,3,BO,3,硼酸溶液仅呈极微弱的酸性，在此反应中并不影响所加的指示剂的变色反应，但具有吸收氨的作用，所以采用之作吸收剂。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,四、仪器,1、,凯氏烧瓶,500mL,或,250mL,2、龙科,A,凯氏定氮仪,3、扭力天平,4、分析天平,5、5,mL,移液管,6、温度可以控制的电炉,7、小漏斗,8、滴定管,9、250,mL,锥形瓶,10、玻璃珠,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,四、仪器,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,四、仪器,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,五、试剂,1,、硫酸铜 (,CuSO,4,5H,2,O)。,2,、硫酸钾。,3,、浓硫酸 (密度为1.8419,g/L)。,4,、硼酸溶液 (20,g/L)。,5,、氢氧化钠溶液 (,350g/L)。,6,、,盐酸标准滴定溶液,c(HCl)=0.01mol/L,或,硫酸标准滴定溶液,c(1/2H,2,SO,4,)=0.0500mol/L,。,7,、混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 (1,g/L),与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1,g/L),临用时混合。,(,也可用2份甲基红乙醇溶液,(1,g/L),与1份次甲基蓝乙醇溶液(1,g/L),临用时混合)。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,六、分析步骤,（一）,试样处理,1,、称样,(,约相当氮,30mg,40mg),（,1,）,固体试样：称取,0.10g,1.00g,（,2,）,半固体试样,：,称取,1.00g,5.00g,（,3,）,液体试样：吸取,10.00mL,25.00mL,2,、消化准备,将试样移入洗净、烘干、容积为,100mL,或,500mL,的凯氏烧瓶内 ，加入硫酸铜、硫酸钾及,8-10mL,硫酸，加入,2,粒,3,粒玻璃珠，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以,45,角斜支于有小孔的石棉网上。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,六、分析步骤,（一）,试样处理,3,、消化,将准备好的凯氏烧瓶以,45,斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），待内容物全部炭化,泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力,并保持瓶内液体微沸,（为加快消化速度,可分数次加入,10mL30%,过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）,经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，,再继续加热,0.5h,1h,。然后取下并使之冷却。,（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。,4,、,定容,将消化好并冷却至室温的样品消化液加入,20mL,蒸馏水摇匀放冷，小心转移到,100mL,容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，,直至烧瓶洗至中性,，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，,静置至室温,，加水至刻度线定容，混匀备用。,同样条件下做一试剂空白试验。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,六、分析步骤,（一）,试样处理,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,六、分析步骤,（二）,蒸馏,1,、水蒸汽发生器的准备：,按要求安装好定氮装置，保证管路密闭不漏气。于水蒸气发生瓶内装水至,2/3,处，加,甲基红指示剂,3,滴及,3mL,5mL,硫酸,，以保持水呈酸性（防止水中含有,N,，加硫酸使成为（,NH,4,）,2,SO,4,形式固定下来，蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。,2,、清洗凯氏定氮仪：,打开进气口，关闭废液出口，接通冷凝水，空蒸,5 min,10min,，冲冼定,N,仪、样杯、碱杯和内室。分别关闭进气口（注意不要同时关闭所有进气口！），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少量水，冲冼再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞开。,3,、吸收液准备：,在,250mL,锥形瓶中加入,10mL(20g/L),硼酸溶液和,1,滴,3,滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,六、分析步骤,）,（二）,蒸馏,4,、蒸馏准备：,准确吸取,10mL,试样处理液,，由样杯（小漏斗）流入定氮仪内室（反应室），并用,10mL,水冲洗样杯（小漏斗）使流入定氮仪内室（反应室内）,【,但内室中溶液总体积不超过内室的,2/3,（约,50mL,）,】,，塞紧棒状玻塞，加水至杯口,1cm,2cm,，以防漏气，关闭排液口，迅速由碱杯缓缓加入,10mL,氢氧化钠溶液,(400g/L),，夹紧螺旋夹，通入蒸汽开始蒸馏。,5,、蒸馏：,关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），,NH,3,通过冷凝管进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏,5 min,，移开接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏,1min,，然后，用少量水冲冼冷凝管下端外部，洗液一并聚集于硼酸溶液中。,6,、收尾：,关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室，待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲冼内室，待洗液全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。,按上述步骤，换下一试样蒸馏,。,同时准确吸取,10mL,试剂空白消化液按以上操作作空白试验。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,六、分析步骤,（三）,滴定,取下接收瓶,，,以硫酸或盐酸标准滴定溶液,(0.05mol/L),滴定至,灰色或蓝紫色,为终点。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,六、结果计算,试样中蛋白质的含量按下式进行计算,：,式中：,X,试样中蛋白质的含量，,g/100g,或,g/100mL；,V,1,试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，,mL；,V,2,试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，,mL；,c,硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，,mol/L；,0.0140,1.0mL,硫酸 ,c(1/2H,2,SO,4,)=1.000mol/L,或盐酸,c(HCl)=1.000mol/L,标准滴定溶液相当的氮的质量，,g；,m,样品的质量或体积，,g,或,mL；,F,氮换算为蛋白质的系数。,一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。,计算结果保留三位有效数字。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,七、说明,1、本法适用于食品中蛋白质的测定。,不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。,2、,所用试剂要用无氨蒸馏水配制。,3、样品消化应在毒橱内进行。消化过程中应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝的酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。,4、样品消化时，如泡沫太多，可加少量辛醇或液体石醋去泡，防止样品溢出。,5、样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入过氧化氢2,mL,3,mL,后再加热。,6、为了加速氧化分解，常用催化剂是硫酸铜，有时也选用硒粉。硫酸铜也是蒸馏时样品碱化的指示剂。,7、消化时硫酸与硫酸钾作用生成硫酸氢钾，可提高沸点（硫酸沸点为330，添加硫酸钾后可达400），加快消化速度。,8、蒸馏装置要严防氨逸出。蒸馏过程中不得中途间断，以免样品液从反应室吸出。,9、操作过程中要严防酸、碱污染硼酸吸收液，否则会造成较大的测定误差。,10,、在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的,10%,。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,八、样品的分解条件,在消化过程中为了加速分解过程，缩短消化时间，常加入下列物质：,（,一,）,K,2,SO,4,或,Na,2,SO,4,1,、作用,K,2,SO,4,或,Na,2,SO,4,是常用的增温剂，提高消化液沸点。,在消化过程中温度起着重要的作用，消化温度一般控制在360,410间。,低于360，消化不易完全，特别是杂环氮化物，不易分解，使结果偏低，高于410则容易引氮的损失。,H,2,SO,4,的沸点仅为330。,K,2,SO,4,沸点：400；,在消化过程中，随着,H,2,SO,4,的不断分解，水分不断蒸发，,K,2,SO,4,浓度逐渐升高，则沸点升高，加速对有机物的分解作用。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,八、样品的分解条件,（,一,）,K,2,SO,4,或,Na,2,SO,4,2,、加入量,温度高低取决于加入的,K,2,SO,4,多少，若少（小于0.3,g/mL,K,2,SO,4,）,则消化时间长,。,H,2,SO,4,：K,2,SO,4,=1：1,时,，则可大大缩短消化时间,。,消化中若,H,2,SO,4,消耗过多，则会影响盐的浓度，一般,在凯氏瓶口插一小漏斗，以减少,H,2,SO,4,的损失,。,K,2,SO,4,+ H,2,SO,4,=2KHSO,4,2KHSO,4,=K,2,SO,4,+H,2,O+SO,3,K,2,SO,4,与,H,2,SO,4,的用量比值不宜过大，当,K,2,SO,4,超过0.8,g/mL,时，消化结束时，内容物冷却快，操作困难。同时温度过高，还会使生成的,(,NH,4,),2,SO,4,分解，放出,NH,3,，使,N,损失。,(,NH,4)2,SO,4,NH,3,+(NH,4,)HSO,4,2(NH,4,)HSO,4,2NH,3,+2SO,3,+H,2,O,因此,K,2,SO,4,浓度应控制在0.35,g/mL,0.43,g/mL,。,Na,2,SO,4,与,K,2,SO,4,作用相同,，,但效果不及之。,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,八、样品的分解条件,（,二,）,CU,2,SO,4,的作用,1,、催化剂,3,C+4Cu,2,SO,4,+2 H,2,SO,4,2Cu,2,SO,4,+4SO,2,+3CO,2,+2H,2,O,Cu,2,SO,4,+2H,2,SO,4,2CuSO,4,+2H,2,O+SO,2,2,、指示剂,在消化完全后，应呈清澈透明的兰绿色或深绿色（铁多）,，故它在消化中还起指示作用,。同时应注意，凯氏瓶刚清澈时并不表示所有的,N,均已转化为氨，因此消化液仍要加热一段时间。,3,、,Cu,2,SO4,还可在碱蒸馏时作为碱性反应的指示剂：,CuSO,4,+2NaOH,（,要充分,）,Cu(OH),2,+Na,2,SO,4,实验二 食品中总氮测定,凯氏定氮法,八、样品的分解条件,（,三,）,氧化汞和汞,是良好的催化剂,HgO+H,2,SO,4,HgSO,4,+H,2,O,Hg+2H,2,SO,4,HgSO,4,+2H,2,O+SO,2,2HgSO,4,与还原性物质共存时，生成,Hg,2,SO,4,+SO,3,+O,Hg,2,SO,4,+2H,2,SO,4,2HgSO,4,+2H,2,O+SO,2,汞是一个效能较高的催化剂，可得,N,的最佳回收率，但是汞能与氨生成汞氨化合物，在蒸馏中不易将,NH,3,全部释放出来，为此，在蒸馏时，必须添加少量锌粉或硫化物，或,Na,2,SO,3,使,NH3,游离出来。锌粉与碱作用放出氢，还原汞氨化合物。,