细胞培养基础知识

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,WALVAX Introduction,玉溪嘉和生物药业有限公司,1,细胞培养基础知识,王建清,内容,单抗基本知识,细胞基本知识,设备与器材准备、溶液配制,无菌技术,细胞培养,细胞,计数,冻,存、复苏,2,抗体,基本概念及抗体,结构,抗体,基本,概念,B,细胞接受抗原刺激后增殖分化成浆细胞产生的,糖蛋白,抗体的,结构,四条肽链通过链间二硫键组成,H,2,L,2,重链：五类,(isotype:,a,、,g,、,m,、,d,、,e,),轻链：两型,(,k,、,l,),3,抗体,基本概念及抗体,结构,抗体的三个功能区,可变区,(Variable region, V,H,/V,L, Fv),：结合抗原,VH,和,VL,：重链可变区与轻链可变区,高变区,HVR,抗原结合部位,互补决定区,CDR,骨架区,FR,1,4,恒定区,(Constant region, CH/CL),绞链区,(Hinge region),4,抗体,基本概念及抗体,结构,免疫球蛋白的,类型,类型,(,Class):,重链,C,区,抗原性,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgD,、,IgE,亚类,(Subclass):,重链抗原性,/,二硫键数目位置,IgG,1-4,5,单克隆抗体和基因工程,单抗,6,单克隆抗体和基因工程,单抗,人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。,7,鼠单克隆,V,区人源化（,CDR,移植）,CDR,序列,CDR,序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,单克隆抗体和基因工程单抗,8,鼠抗体 嵌合抗体,66%,人源化抗体,90%,全人抗体,100%,单克隆抗体和基因工程单抗,9,单抗基本知识,细胞基本知识,设备与器材准备、溶液配制,无菌技术,细胞培养,细胞,计数,冻,存、复苏,10,细胞基础知识,细胞学的由来,细胞及细胞学说的提出：,1665,年英国学者,Robert hooke,，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文,Cella,（小室）这个词称呼他们看到的类似于蜂巢的极小的封闭小室。德国植物学家施莱登（,1838.M.J S chleiden,）,动物学家施旺（,1839,，,T.schwann,）提出动植物都是细胞的集合物。使细胞及其功能有了一个较为明确的定义，确立了“细胞学说”的基本原则。这时“细胞学说”主要内容是,：（,1,）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（,2,）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的,“生命”（,3,）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。,11,细胞基本知识,细胞的基础知识,1,、,细胞是生命活动的基本单位：,细胞是生命活动的基本单位，一切机体均由细胞构成（病毒是非细胞形态的生命）。细胞不仅是机体的基本形态机构单位，也是机体的基本功能单位，机体的生长、发育、繁殖和进化都是以细胞为基础。细胞同时也是机体发生疾病的基础。,2,、,细胞的基本共性：,构成细胞的基本化学因素只,O,、,C,、,H,、,N,、,P,、,S,、,Ca,、,K,、,Fe,、,Na,、,Cl,、,Mg,等，他们构成细胞功能与结构所需的许多无极化合物和各种生物分子。构成细胞结构的基本生物大分子是：核酸、蛋白质、脂肪和糖类。这些大分子一般以符合分子形成如核蛋白、脂蛋白、糖蛋白或糖脂等组成细胞的重要结构。,12,3,、,细胞的基本结构,在亚显微结构水平上，细胞基本结构大体可以分成三种体系：主要由脂蛋白构成的生物膜系统，如细胞膜、核膜及一系列重要细胞器如：线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体和液泡等的封闭膜；第二类主要由核酸蛋白成分构成的颗粒与显微结构系统，如染色质与核仁基质，核蛋白体等；第三类有蛋白质构成的细胞骨架（主要是微丝与微管），中心体、纺锤体、纤毛、鞭毛等专门结构。,细胞基本知识,1.,核仁,2,.,细胞核,3,.,核糖体,4,.,囊泡,5.,粗面内质网,6,.,高尔基体,7,.,细胞骨架,8,.,滑面内质网,9,.,线粒体,10,.,液泡,11,.,细胞质,12,.,溶酶体,13,.,中心粒,13,4,、,细胞作为生命活动的基本单位的共同特点：,首先所有细胞表面均有一层脂蛋白成分的生物膜，使细胞能与周围环境保持相对独立性：其次所有细胞都有两种核酸，即,DNA,和,RNA,作为遗传信息的复制和转录的物质基础；第三作作为蛋白质合成的“机器”,-,核蛋白，是一切细胞不可缺少的基本结构；第四所有细胞都是以一分为二的分裂方式增值。第五细胞具有多样性，形状、大小、悬殊很大，结构复杂程度也很不一样。,5,、,原核细胞与真核细胞：,这两种细胞是根据进化程度与结构的复杂程度来划分的。原核细胞（,Procarytic cell,）它没有典型的核结构，没有核膜，只有一个比较集中的核区，其中分布着环装,DNA,丝，细胞内缺少重要细胞器，但有时有核蛋白体及游离的质粒（,plasmid,），原核细胞的繁殖以直接分裂（无丝分裂）为主，,DNA,复制、,RNA,转录与蛋白质合成同时连续进行。,细胞基本知识,14,6,、,从进化角度真核细胞与原核细胞有两点区别，,第一细胞膜系统的分化与演变不同。真核细胞以膜系统的分化为基础，分化成各种重要的细胞器；第二遗传信息与遗传装置的扩增与复杂化程度不一。真核细胞（,Eucaryotic cell,）进化程度高，结构相当复杂。,细胞基本知识,15,细胞周期（细胞分裂周期）,即单个细胞的生长过程，指母细胞分裂后形成的细胞到下一次再分裂成两个子细胞之间的时期。细胞的增殖是生物最根本的特征，细胞是借助分裂来进行增殖的。通过细胞分裂即可将复制的遗传物质平均地分配到两个子细胞中。,我们进行体外细胞培养，实际是在细胞群体和个体的情况下考查细胞行为的。大部分细胞群体都由,分裂和不分裂两部细胞混合组成,。而不分裂细胞又可分为两类：即保持再进入细胞周期能力的,G0,期细胞（或叫静置细胞或休止细胞）及不分裂最终注定要死亡的终止分化细胞（或称之终端分化细胞），他们不能再进入周期。进入周期内的细胞可以分为两个期：间期（,G1+S+G2,），,M,期（有丝分裂期），整个细胞周期组成是,G0+G1+S+G2+M,。,16,细胞基本知识,间期,G1,期：,DNA,合成前期或细胞分裂后期。这一期细胞,代谢比较活跃，,RNA,，蛋白质合成旺盛,，为,S,期的,DNA,合成做好准备，此期,后阶段，中心体会进行分裂,。这一期从细胞生理变化上有一个矫正点（,R,点），由于各种内外因素的影响，它可能控制,G1,期的延续时间变化，因此,G1,期的长短变化极大,。,S,期,：,DNA,合成期,，此期结束,DNA,会加倍,。早期复制的,DNA,富有,G-C,碱基，晚期复制的,DNA,富有,A-T,碱基。此期,DNA,合成的同时，也有组蛋白的合成。,G2,期,：,DNA,合成后期，,分裂前期,。有活跃的,RNA,蛋白质合成，,DNA,含量已加倍，有,微管的合成,，为,M,期纺锤丝微管组装提供原料。,17,M,期,前期,：此期的主要特征是,染色质浓缩，确定分裂极，核仁解体，核膜消失,。,DNA,分子螺旋化和折叠，双螺旋缩短，形成染色单体，进而变成双结构，中间有着丝粒相连。此时中心粒出现，周围有微管形成的星体，逐渐分离，到相对应位置形成细胞两极。中心粒间的微管延长，形成纺锤体，染色体界于赤道部。,中期,：进入中期的,染色体高度浓缩,，形成典型中期染色体，部分纺锤体开始附着着丝粒上，染色体在赤道面上形成赤道板。,后期,：,染色体开始一分为二,，几乎所有的染色体同时分离，染色体被染色体丝拉向两极，细胞也向两极方向延长呈椭圆形，最后在赤道部凹下形成,哑铃状,。,末,期,：染色体达到细胞两极，开始解螺旋，并,形成染色质，核膜逐渐形成，核仁出现,，胞体逐渐分离，形成两个子细胞，两个子细胞进入,G1,期。,18,单抗基本知识,细胞基本知识,设备与器材准备、溶液配制,无菌技术,细胞培养,细胞,计数,冻,存、复苏,19,20,一、,细胞常用设备和器材,二氧化塔摇床,超净工作台,设备与器材准备、溶液配制,21,倒置显微镜,电动助吸器,程序降温盒,22,不锈钢柱式滤器,23,液氮罐,细胞培养板,24,培养基储存瓶,细胞培养瓶,25,器材的清洗和灭菌,不要让污染了的器皿变干！,清洗的重要性,除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等,使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。,灭菌的重要性,除去微生物污染,酸液配方,26,新,的玻璃器皿的清洗灭菌,自来水刷洗，除去灰尘。,烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入,5%,稀盐酸中,12,小时以除去脏物、铅、砷等物。,刷洗、烘干：泡酸,12,小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲洗干净后用烤箱烘干。,泡酸、清洗：用酸浸泡,12,小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗,10,次，最后蒸馏水冲洗,3-5,次。,烘干、包装：移液管和滴管的尾端要塞入棉花。,高压灭菌。,烘干备用。,27,使用后的玻璃器皿的清洗灭菌,刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净。,自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净，烘干。,泡酸、清洗：烘干后泡入盐酸，,12,小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗,10,次（避免蛋白质干后粘附于玻璃上难以清洗），过蒸馏水,3,次。,烘干、包装,高压灭菌,烘干备用,28,金属器皿的清洗灭菌,金属器皿不能泡酸，清洗时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用,75%,酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制和内包装好。高压灭菌，再烘干备用。,橡胶和塑料器皿的清洗灭菌,刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净。,自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干。,泡,入,5%,盐酸过夜。,自来水冲洗,10,次，过蒸馏水,3,次。,烘干,高压蒸汽灭菌,烘干备用,滴管胶头可用,75%,酒精浸泡,5,分钟，紫外线照射,消毒,29,二、,细胞常用的培养液和试剂,培养用液是维持组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。,设备与器材准备、溶液配制,30,（,1,）,平衡盐溶液（,BSS,）,BSS,又称生理盐水或盐溶液，主要由无机盐和葡萄糖组成。本身具有维持渗透压，调控酸、碱度平衡的作用，同时能共给细胞生存所需的能量和无机离子成分；用作洗涤组织、细胞及配制各种培养用液的基础溶液。,几种常用的平衡盐溶液：,Ringer,、,PBS,、,Tyrode,、,Earle,、,Hank,s,、,Dulbecco,（都有相应配方）,最简单的,BSS,是,Ringer,。,D-Hank,s,与,Hank,s,的主要区别在于前者不含有,Ca,2+,、,Mg,2+,，因此,D-Hank,s,常用于配制胰酶溶液。,配制平衡盐溶液也应当用新鲜的三蒸水。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温高压灭菌。,有浑浊或沉淀时，应重新配制,。,D-Hank,s,31,（,2,）,培养基,培养基就是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，他是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。,天然,培养基,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,优点,：营养成分丰富，培养效果好。,缺点,：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。,合成培养基,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。,优点,：,标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。,缺点,：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,32,五,大常用培养基,RPMI 1640,Dulbeccos Modified Eagles Medium,（,DMEM,）,Minimum Essential Medium,（,MEM,）,Iscoves Modified Dulbeccos Medium,（,IMDM,）,Medium,199,GBM05,：,21,种氨基酸，,8,种无机盐，,18,种微量元素，,12,种维生素，,11,种其它营养物组成。,33,34,（,3,）,其它培养用液,消化液 胰酶溶液,：浓度一般为,0.1%-0.25%,，配制时要用不含,Ca,2+,、,Mg,2+,及血清的平衡盐溶液。,EDTA,溶液,：一种化学螯合剂，对细胞有一定离散作用，毒性小，使用方便，浓度为,0.02%,。可与胰酶混合使用。可,4,冰箱保存。使用,EDTA,处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的,EDTA,会影响细胞生长。,胶原酶溶液,：使用浓度,0.1-0.3mg/L,或,200000U/L,，作用最佳,pH6.5,。胶原酶不受,Ca,2+,、,Mg,2+,及,血清的抑制。胶原酶作用温和，不易对细胞产生损伤，但价格昂贵。,谷氨酰胺补充液,：合成培养基中的必须成分，但容易降解，所以都是在使用前添加。一般配制成,100,倍浓缩液,-20,pH,调整液,NaHCO3,溶液,：保证培养基在,5%CO2,环境下,PH,达到设计标准。,HEPES,：一种弱酸，羟乙基哌嗪乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要是,防止培养基,pH,迅速变化。使用浓度,0.01-0.05mol/L,。,抗生素溶液,：在培养液内加入适量抗生素，以抑制可能存在的细菌生长。青霉素,100u/mL,、链霉素,100ug/mL,。,35,培养基储存,液体培养基分装后不可在,-20,下保存；因为培养基中的盐容易析出，而再次融化后，有的盐可能无法重新溶解，从而导致培养基营养成分和渗透压改变，培养细胞时，容易细胞破裂而死亡。,培养基开瓶后尽快用完，不宜长时间保存，因为时间过长会导致液体培养基中盐分的析出和,pH,的改变。,36,碳酸氢钠的作用及含量,与,CO2,一起形成缓冲系统，保持培养基,pH,值稳定；,不同的培养基要求添加,NaHCO3,的量不一样，如,DMEM,要求添加,3.7g/L,，为了保持,pH,值稳定，必须用高浓度的,CO,2,平衡，一般不低于,8%,，而,1640,等要求添加,NaHCO,3,2.2g/L,还有些培养基要求添加更少，那么这些培养基就要求较低,CO,2,的浓度平衡，一般是,5%,。,HEPES,的作用及含量,培养基中最常用的,Buffer system,是碳酸氢钠，它可以提供营养，但,却,在生理,pH,值条件下会降低缓冲能力。而,HEPES,是一种很强的,Buffer,，加入,HEPES,能使细胞培养基在,pH7.2-7.6,条件下缓冲能力增强；,HEPES,在培养基中的终浓度通常为,35mmol,；非必须，根据实验要求进行添加；,37,丙酮酸钠的作用,丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源。但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。,保证细胞更好地生长，但非必须成分。,谷氨酰胺的作用,几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。谷氨酰胺脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和能量代谢。在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。但同时,L-,谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性；,谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的液体培养基,4,冰箱储存,两周,以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺；,单抗基本知识,细胞基本知识,设备与器材准备、溶液配制,无菌技术,细胞培养,细胞计数,冻,存、复苏,38,39,无菌技术,微生物污染一直是细胞培养的主要问题。,40,细胞污染的种类,细胞污染的种类可分成,细菌,、,真菌、支原体,和,病毒,。,污染源,无菌操作技术不当,操作室环境不佳,污染之血清,污染之细胞,细菌和真菌的污染和,鉴别,肉眼直接观察法,培养检查法,显微镜观察法,41,细菌污染,细胞培养常见的污染,最,常见的有：大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、白色葡萄球菌。,培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变浑浊，,pH,改变。,污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死,亡。,真菌,污染,真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,42,支原体的污染和鉴别,造成支原体高污染的原因：,支原体大小,0.1-0.8um,，无细胞壁，可透过一般过滤膜（,0.22-0.45um,）,支,原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化,过去缺乏简单、快捷且可靠的检测方式,细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染,研究和操作人员忽略污染问题,已受污染的细胞,已受污染的培养基、血清,43,支原体的鉴别方法,相差显微镜观察法,Hayflick,培养基直接培养法,DNA,荧光染色法,PCR,方法,44,病毒的污染和鉴别,细胞的直接观察,动物接种检查,电子显微镜检查,免疫学检查,PCR,技术,45,无菌操作总则：,任何时候都要毫不动摇的在每一个操作环节都坚持高标准的无菌技术！,预防为主！,不要让无菌程度低的物品沾染无菌程度高的物品！,46,培养,室的灭菌,定期打扫培养室：每周打扫一次，用纯化水拖地、擦桌子、超净工作台，然后用消毒剂擦拭消毒。,CO2,摇床：先用,0.3%,新洁尔灭擦拭，然后用,75%,酒精擦拭或,0.5%,过氧乙酸，再用紫外灯照射。保持培养箱内空气干净，定期消毒。,实验,前：用,75%,酒精（,0.3%,新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。,操作人员的无菌准备：,肥皂洗手。,穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、穿好拖鞋,戴乳胶手套，,75%,酒精擦手。,47,工作面无菌原则：,保持工作面干净。,使用,前用,75%,乙醇充分擦洗工作面，打开紫外灯照射,30,分钟。,尽量少放物品：带入必须的，移走不必要的。,工作台面物品整齐有序。,实验完毕后移走所有物品，并彻底擦洗工作面，开紫外灯照射,30,分钟。,凡是带入超净工作台内的物品表面要用消毒剂进行外表面消毒。,靠近酒精灯火焰操作。,玻璃,器皿使用前必须过火灭菌。,打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近。,无菌级别高的物品不能触碰无菌级别低的物品。手不能从敞开的瓶口上方经过。,各种操作靠近酒精灯灯，动作轻、准确，不能乱碰。,吸取两种以上的溶液时要注意更换吸管，防止交叉污染,。,48,无菌操作,49,手握试管、移液管时尽量远离工作端。,尽可能减少开盖,时间,随时擦去任何溢出物。,任何,时候都不要把液体从一个无菌容器倒入另一个无菌容器。,倾倒废液时防止溅起和瓶口回流。,在视野范围内工作。,无菌思想贯穿到细胞培养的任何操作步骤。,单抗基本知识,细胞基本知识,设备与器材准备、溶液配制,无菌技术,细胞培养,细胞,计数,冻,存、复苏,50,细胞培养基本概念,细胞培养技术：,从体内组织取出细胞模拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。,原代培养：,从体内取出组织或细胞的第一次培养，应该定义为首次成功地传代培养之前的培养为原代培养。,传代：,无论是稀释，将细胞从一个培养皿中转移或移植到另一个培养皿中的继续培养即称为传代或传代培养，也称再培养。,单层培养：,培养细胞在底物上分裂增殖，平铺长成单层细胞。一方面细胞可能长满培养空间，另一方面细胞之间相互接触而发生接触抑制，细胞的生长速度逐渐减慢甚至停止。,细胞培养,51,悬浮培养：,细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖，这些细胞无依赖于贴附底物或支持物上生长的性质,。,细胞系：,原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。由原细胞系分离出具有与原细胞系不同性状的细胞系称为亚系。,细胞株,：,通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物为细胞株。,细胞密度,：,细胞制备成细胞悬液或细胞在体外悬浮培养时，在没毫升悬液中所含细胞数。,代或世代,：,从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代，作为群体细胞要经游离期、对数期与停止期等三个阶段。,52,培养细胞的生物学特点,培养细胞的生长方式及类型,贴壁生长型细胞：,必须依附支持物的表面生存的一类细胞，这类细胞在体内时多有一个依附的环境，形态附着方式也是多态性。常见有上皮型细胞、成纤维型细胞、游走型细胞、多形型细胞。贴壁是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式，细胞被放到体外环境中以后，同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，,因而属于贴壁型细胞。,（,1,）上皮型细胞（,2,）成纤维型细胞（,3,）游走型细胞（,4,）多形型细胞,53,悬浮生长型细胞：,来源于血液、脾脏、或骨髓细胞，不依附任何支持物，悬浮于培养液中的单个或小的细胞团形式生长,54,培养细胞的生物学特点,培养细胞生长特点,上皮型细胞：易相连,成片,；想靠,-,紧密相连,-,成薄层,-,铺路石状；,生长时呈,膜状,移动,，很少,脱离细胞群而,单个活动,成纤维型细胞：排列成,放射状,，漩涡状,并不紧靠连成片,；细胞,-,细胞接触易断开而,单独行动,；游离的单独的成纤维样细胞；常有几个,伸长的细胞突起。,55,多行型细胞：多形型细胞是一些,形态上不规则,的细胞。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样规则。,体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是,神经元和神经胶质细胞。,游走型细胞：本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。,56,悬浮型细胞,：培养时不贴附底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长。在,悬浮中生长良好,细胞,圆形,，单个或小细胞团。,优点：,生存空间大，,提供数量大，传代方便,（不需要消化），,易于收获,缺点：观察,不方便，,纯化,不方便，不能通过离心将死活细胞分离,57,细胞系生长,过程,原代（初代）培养期,：从机体取下组织培养到第一次传代。此代细胞种类较多，维持时间因细胞种类不同，一般,1-4,周。,传代培养期,：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。一般二倍体细胞，不加附加条件，可传代,30-50,代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之,有限细胞系,。有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称,无线细胞系。,细胞系生长过程,衰退期,：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐渐停止，进而发生衰退、死亡。这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人胚胎成纤维细胞可以进行,60,代增殖，而,80,岁老人的肺成纤维细胞仅传代了,16,代后便死亡。,培养细胞生长过程,58,细胞传代生长过程,潜伏期,：细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为,6-24,小时。,对数生长期,：,细胞数随时间变化成倍增长,，活力最佳，最适合进行实验研究,停滞,期（平台期）,：细胞长满瓶壁（一定细胞密度）后，细胞虽有活力但不再分裂,机制：接触抑制、密度限制,59,细胞生长条件与环境,一、细胞生长的营养需要,1,、,基本营养物质,：,（,1,）,氨基酸,：氨基酸是蛋白质的基本单位。细胞培养常需,12,种氨基酸,+,谷氨酰胺,：异亮氨酸、亮氨酸、胱氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、颉氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸,（,2,）维生素：烟氨酸、叶酸、核黄素、,B12,、泛酸、吡哆醇、维生素,C,等,（,3,）碳水化合物：提供细胞能源主要是葡萄糖。,（,4,）无机离子：钠、钾、镁、钙、磷,2,、促细胞生长因子：种类很多，多因特殊细胞生长，或一定目的而加入不同促细胞生长因子。,3,、血清：是细胞培养的主要营养成分，除含多种细胞生长所必须的成分，血清的作用机制商在探索。也不应忽视血清中对某些细胞的有害成分，因此，实验室的血清要经过筛选。,60,61,二、细胞的生存环境,1,、,温度,：一般的细胞培养最适温度为,35-37,。不同动物种的细胞，或经过处理的细胞也可能由不同的要求。,2,、,气相及,pH,：体外细胞培养需要一定的气相环境，一般为,95%,空气加,5%,二氧化碳。,大多数细胞所需,pH,在,7.2 - 7.4,。但是，细胞培养最适,pH,值随培养的细胞种类不同而不同。成纤维细胞喜欢较高,pH (7.4 - 7.7),而传代转化细胞系则需要,偏低,pH,(7.0 - 7.4),。,体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力。,3,、,渗透压,：培养细胞对,渗透压有一定的适应范围细胞通常可耐,260mOsm/kg,320 mOsm/kg,四、无污染和无毒,1,、细胞培养中的污染问题,（,1,）,微生物,（细菌，霉菌，支原体）污染防治,（,2,）,实验室中细胞交叉污染,2,、无毒：,凡与细胞接触的器材、培养基均应保持无任何细胞毒性。,细胞生长条件与环境,单抗基本知识,细胞基本知识,设备与器材准备、溶液配制,无菌技术,细胞培养,细胞,计数,冻存、复苏,62,63,细胞计数方法,1,、设备仪器自动计数法,设备计数速度快，准确度高，偏差小等特点,2,、细胞计数版计数法,细胞计数版计数速度慢，准确度低，偏差大，误差大。,64,细胞计数操作,1,、制备单细胞悬液，取一小部分（,500ul,）至,1.5ml,取样管中，加入等体积,0.4%,台盼蓝染液。,2,、,75%,酒精清洗计数版表面，注意不要划伤计数表面。,将已染色待细胞悬液吹打均匀，然后用移液器吸取,20ul,细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，液体刚好流到计数版凹槽边缘。注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。,3,、将计数版平放在显微镜载物台上计数。,65,统计角上四个大格的活细胞数。,对于压线细胞的处理：,数上不数下，数左不数右,，细胞团按照一个细胞计。,计算,结果：,（细胞悬液的细胞数）,/ml=,（四个大格子细胞数之和,/4,）*,10,4,*,2,66,细胞计数的注意事项,1,、制备单细胞悬液。不可有较多成团细胞。,2,、取样均匀。多次取样计数取平均值。,3,、细胞密度：每,mm,2,细胞数大于,100,，一般,100-300.,若需精确定量，则应在,500-1000,个。如细胞浓度不足，则离心后重悬于更小体积培养基中在重行计数。,4,、计数时注意稀释倍数。,5,、避免样品在枪头中停留时间过长。,6,、将细胞注入计数池中时，注入的量不可过多，不可过少，不可产生气泡。,7,、台盼蓝染色时间不可超过,30,分钟。,单抗基本知识,细胞基本知识,设备与器材准备、溶液配制,无菌技术,细胞培养,细胞,计数,冻存、复苏,67,68,细胞冻存和复苏,1,、细胞低温保存的基本原理是：在,-80,以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。,2,、当细胞降温到零度以下，细胞内部产生变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。,3,、如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,4,、所以细胞冻存和复苏的原则是：,慢冻快融,69,细胞保护剂,DMSO,常用的低温保护剂是二甲基亚砜（,DMSO,），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,有毒！强渗透性，可以渗入乳胶手套。,使用浓度：,5%-10%,，一般用,10%,。,如果进出细胞过快，会对细胞产生渗透性损伤。所以冻存和复苏时要尽量降低细胞内外,DMSO,的浓度差。,DMSO,与细胞混合后室温下不能放置超过,30,分钟。溶于水时产热,70,将,冻存管放于程序将温盒中。,将程序降温盒置于,4,冰箱,30,分钟。,将程序降温盒,置于,-80,超低温冰箱放置过夜。,置于液氮罐中长期保存。,冻存程序,71,细胞复苏方法,从液氮中取出冷冻管，迅速放入,37-38,水浴中，轻微摇动，使其融化（,2,分钟左右），水面不可没过盖子，防止水污染细胞。注意，冻存管可能爆炸！,从,37,水浴中取出冻存管，用,75%,酒精表面消毒后，在超净台里拧开冻存管，用无菌移液管吸出细胞悬液，放入已装有,1mL,培养基的,15mL,离心,管中，摇匀。,3060,秒后，补加,2mL,培养基，摇匀。再过,3060,秒，补加,4mL,培养基，摇匀。等待,3060,秒，将离心管以,700rpm,离心,5min,。弃上清。放入已装有上述培养基的细胞培养瓶中，摇匀。取,0.3-0.5mL,细胞悬液进行细胞计数,。,细胞培养，什么最难？,做一件好事不难，难的是做一辈子好事。,培养一两代细胞不难，难的是持续稳定的培养几代，几十代细胞，难的是持续稳定的培养几个月、几年细胞。,72,Together we can do better!,73,