课题2多聚酶链式反应扩增DNA

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题,2,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,1,自学提纲：,知识回顾：,1.DNA,分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；,2. DNA,复制过程和特点；,3.PCR,技术概念及应用。,基本概念：变性、复性、,Taq DNA,聚合酶、引物,理解,PCR,技术的原理,掌握,PCR,技术的全过程,比较,PCR,技术和体内,DNA,复制的异同点。,2,1,、,DNA,分子的,3,端与,5,端,-OH,端为,3,;,磷酸基团的末端为,5,。,2,、,DNA,分子由两条,反向平行,的脱氧核苷酸链根据,碱基互补配对原则,形成,氢键,连接而成。,3,解旋酶,DNA,母链,4,种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,引物（,RNA,）,打开,DNA,双链,模板,合成子链原料,催化子链合成,使,DNA,聚合酶能从引物,3,端开始连接脱氧核苷酸,思考：,3,、,体内,DNA,复制的条件,是什么？ 体外扩增,DNA,如何提供相似环境？,变性（,80-100,）,Taq,聚合酶（耐高温）,15,30,个核苷酸构成,DNA,或,RNA,4,DNA,双链,单链,变性（加热,80-100,）,复性（缓慢冷却）,4,、,DNA,分子的热变性原理：,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物,和引物,与两条单链的结合,5,一 、,PCR,技术的原理,利用,DNA,分子的,热变性,原理，通过控 制,温度,来控制双链的,解聚,与,结合，,从而完成,体外,DAN,分子的扩增,。,体外,DNA,复制的条件：,四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。,复制的方向：,子链的,5,端向,3,端延伸。,6,二、,PCR,的反应过程,每个循环包括：,变性,复性,延伸,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且,由引物,延伸而成的,DNA,单链会与引物,结合，进行,DNA,的延伸，,这样，,DNA,聚合酶只能特异性地复制,处于两个引物之间的,DNA,序列,，使这段固定长度的序列,呈指数扩增,。,7,三、实验步骤：,准备,好,PCR,反应体系的配方,用微量,移液,器按配方在往微量离心管中加入各组分,盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁,混合,反应液,离心,10,分钟,将离心管放入,PCR,仪上，设置好循环程序进行,反应,8,注意事项：详见操作提示,四、结果分析与评价,DNA,含量的测定：稀释,对照调零,测定计算（公式见,P63,）,波长,260nm,处读数,蒸馏水做对照,50,倍,9,PCR,技术与体内,DNA,复制的区别：,1. PCR,不需要解旋酶；体内,DNA,复制需要；,2. PCR,需要耐热的,DNA,聚合酶（常用,TaqDNA,聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；,3. PCR,一般要经历三十多次循环，而生物体内,DNA,复制需要生物体自身的复制。,10,练习巩固,1,、关于,PCR,技术的应用，错误的一项是,A,古生物学、刑侦破案、,DNA,序列测定,B,诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学,C DNA,序列测定、基因克隆、刑侦破案,D,诊断遗传疾病、合成核苷酸、,DNA,序列测定,11,2,、,DNA,的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？,3,、,PCR,技术最突出的优点是,A,原理简单,B,原料易找,C TaqDNA,聚合酶有耐热性,D,快速、高效、灵活、易于操作,12,4,、做,PCR,使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是,A,反复洗涤,B,不怕外源,DNA,污染,C,高压灭菌,D,在,20 ,储存,13,