动物基因组DNA、总RNA测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物基因组DNA、总RNA,的提取及含量测定,2009-10-15,1,目的要求,学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术；,了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点；,学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。,2,理论基础,核酸,是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；,按化学组成可以将核酸分成两大类：,含脱氧核糖核酸（DNA），,主要,存在于细胞核中；,含核糖核酸（RNA），,主要,存在于细胞质内；,在生物体中核酸以结合成,核蛋白,的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。,3,核酸分离、纯化原则, 保持核酸分子一级结构的完整性,意义：,遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式,。, 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ；, 无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应,去除RNA分子）。,4,注意：,在低温下进行操作；,减少物理因素对核酸的,机械剪切力,；,防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（,pH值5-9,），并要保持一定离子强度；,防止核酸的生物降解；,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需,高温灭菌,，提取缓冲液中需加,核酸酶抑制剂,。,进行核酸分离时最好,新鲜,生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70冰箱中。,5,1、RNA的提取与测定,RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。,常见方法（依据RNA的种类和来源）：,苯酚法（实验室最常用的方法）,去污剂法、,盐酸胍法，,苯酚法：,组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即,溶于上层,被苯酚饱,和的水相中， DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。,优点：,较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。,6,工业提取RNA的方法,酵母细胞富含RNA，是工业上提取RNA的主要原料。,工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的,浓盐法或稀碱法,。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺较简单。,7,浓盐法：使用10氯化钠的溶液，同时在90摄氏度热提取3-4小时，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。经冷却，离心后上清液由乙醇沉淀RNA。,稀碱法：使用0.2氢氧化钠裂解,酵母,，然后用酸中和，除去蛋白和菌体，上清液由乙醇沉淀RNA，或调等电点PI 2.5 沉淀。,工业提取RNA的方法,8,原理：,动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白,（DNP）,可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在,0.14mol/L氯化钠,盐溶液中溶解度,最低,，而核酸核蛋白,（RNP）,则在0.14mol/L氯化钠中溶解度,最大,，利用这一性质可将其分开。,方法：,先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用0.14mol/L 氯化钠溶液把细胞中的,RNP,提取出来，最后用酚将RNA和蛋白质分开,。,本实验提取RNA的原理及方法,9,RNA 提取,匀浆：,称取3克牛肝剪碎，加20mL 0.14mol/L氯化钠溶液10000r/min左右匀浆1分钟左右；,离心：,匀浆后溶液离心8000 r/min离心7分钟，量取上清液,毫升数,，沉淀物留做提取DNA；,除杂质：,于上清液中加入等体积,80苯酚,溶液，搅拌充分混合,10-15,分钟，置冰箱,冷却,静止,10-15,分钟，离心取含有RNA上层水相，弃下层酚相；,沉淀RNA：,取上层水相含RNA溶液，加入2倍体积95冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却(约,10-15,分钟)，至出现白色絮状物,RNA，离心8000 r/min离心7分钟，取沉淀物；,溶解：,用少量去离子水（约,20,毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。,10,RNA含量测定方法,测定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚,；,本实验用地衣酚测定,原理：,当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成,糠醛,，后者与3.5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，在Fe,3+,或Cu,2+,催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10,100g/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。,11,将样品配制成含5,50,g/mL,核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm吸收值，计算核酸浓度：,RNA浓度（,g/mL,）=,式中：,O.D,260,为260nm波长处吸收值；,L,为比色杯的厚度；0.024为每毫升溶液内含1微克RNA的光吸收值；,稀释倍数,紫外吸收法,12,在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物钼蓝。,H,3,PO,4,+12H,2,MoO,4,H,3,P(Mo,3,O,10,),4,+12H,2,O,还原剂,钼 蓝,钼蓝最大的光吸收在650-660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1-10微克磷。,定磷法,13,RNA 含量测定,取8 支试管，6 支试管按上表所添加各种试剂绘制标准曲线。另2管各加入,0.1mL、0.2mL、 0.3mL,待测液，再加,2.9mL、2.8mL,和,2.7mL,水和,3.0mL,地衣酚试剂试剂，加毕，摇匀，8 支试管统一沸水加热25 min，取出后冷水冷却，测定各管OD,670,为纵坐标，RNA 浓度为横坐标作图，并计算提出的RNA 的量。(控制RNA 浓度在10,100g/mL 之内）,14,试剂和器材,材料：牛肝,试剂：,0.14mol/L 氯化钠,标准RNA溶液：100g/mL,地衣酚（3,5-二羟基甲苯）试剂,（现用现配）,80苯酚溶液,95乙醇,器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等,15,思考题,RNA 提取方法有几种？有什么优缺点？,RNA 提取过程中应注意什么？,16,DNA的提取及含量测定,在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的,DNA,；,微生物中，面包酵母含,4%,，啤酒酵母含,6%,，大肠肝菌含,9%10%,。,本实验：,将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（,SDS,）溶液，使,DNA,与,蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到,1mol/L,，使,DNA,溶解。加氯仿,-,异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯,DNA,。最后用,95%,乙醇沉淀,DNA,。,17,去除蛋白的常用方法,变性剂法：,用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA；,苯酚法：,用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品；,氯仿法：,用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。,18,DNA的提取,溶解：,将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10,SDS溶液,，使溶液的SDS浓度达到1左右，边加边搅拌，放置60 水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；,除杂质：,加等体积,氯仿-异戊醇,混合液，充分震荡,10分钟,， 8000 r/min离心7分钟，取,上层,液量好体积，倒入烧杯中（,离心管,），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，,重复上次操作,。直至界面不出现蛋白凝胶为止；,沉淀：,准确量取上清液体积，加2倍体积95冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止,冷却,，待有白色丝状物出现，约,10-15分钟,，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；,溶解：,将沉淀物用0.1mol/L NaOH约,10,毫升溶解。,19,DNA含量测定方法,二苯胺法：,DNA,分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成,-羟基-酮基戊醛,，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（max=595nm）。DNA在40 400微克范围内，光吸收值与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。,除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样反应，其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。而蛋白质、多种糖及其芳香衍生物，羟基醛都能与二苯胺形成有色物质，干扰测定。,20,DNA含量测定,1、DNA标准曲线的制定,6支试管，依次加入0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和2.0mL DNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2mL。然后各加入4mL 二苯胺试剂，混匀。于60恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。,2、制品的测定,取2支试管，各加,0.2，0.8mL,待测液，加水至2mL（内含DNA应在标准曲线的可范围之内）和4mL 二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。,3、,根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量.,21,22,试剂和器材,试剂：,生理盐水,10SDS,氯化钠,95乙醇,氯仿-异戊醇混合液,DNA标准溶液：用0.01mol/L NaOH配成200g/mL溶液,二苯胺试剂（现用现配）,器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等,23,思考题,二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什么？,除杂质常用那些方法？,24,工 艺 图,3g肝脏 + 20mL0.14mol/,L 氯化钠,匀浆, 1min,离心 8000r/min, 7min,等体积80苯酚,搅拌10-20min，冰箱静置30min,8000rn/min，7min,上清RNA、多糖,沉淀D,NA、蛋白,加2倍体积95冷乙醇,冰箱至出现白色沉淀,离心,沉 淀,离心,冰箱至出现白色沉淀,加2倍体积95冷乙醇,等体积氯仿/异戊醇，震荡10min/离心,加氯化钠至1mol/L，搅拌10min,4ml 10SDS，60，10min,30ml生理盐水溶解,上 清,DNA,RNA,25,