亚克隆ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,将某载体上的水稻,DNA,片段片段亚克隆到另一载体上,第一部分：分子克隆技术,1,2,pUC19,3,pU1301,4,pU1301+1.5KB,外源,双酶切：,BamHI+KpnI,5,两种载体的抽提,琼脂糖凝胶电泳检测,DNA,的质量,两种载体的限制性内切酶消化,目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化,载体与外源,DNA,的连接,感受态细胞的制备,连接子转化感受态细胞,重组子筛选及鉴定,亚克隆的主要步骤,6,质粒,DNA,的提取,7,是一个复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增,有,1,到多个限制内切酶的单一识别 与切割位点，便于外源基因的插入,具有选择性的遗传标记,(,如抗生素抗性标记等,),以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来,载体必备条件,8,质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或表达外源基因的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。,9,双链闭合环状,DNA,分子,，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。,质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有,1,至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝数较多，一般在细胞内有,20,个以上）,质粒的基本特点,10,碱裂解法，,主要,包括,4,个步骤：,细菌的培养：,从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期,菌体的收集和裂解：,通过离心收集菌体，,NaOH/SDS,处理裂解细胞,染色体,DNA,、,RNA,及其它杂质的去除：,碱处理后用冰冷的,KAC,缓冲液处理后离心,质粒的纯化及沉淀：,苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀,质粒的提取,11,Solution I:,Tris.HCl,（,pH 7.5,）,50 mM,EDTA 10 mM,RNase A100 g/ml,Solution II:,NaOH 0.2 M,SDS1 %,Solution III:,Final concentration,KAc 1.32 M,Using HAc to adjust pH to 4.8,TE (pH 8.0),：,Tris.HCl,（,pH 8.0,）,10 mM,EDTA,（,pH 8.0,）,1 mM,苯酚,/,氯仿,无水乙醇或异丙醇,碱裂解法用到的试剂,12,solution I,重悬细菌,solution II,，其中的,SDS,破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，,NaOH,使,DNA,变性、碱基对打开，使宿主染色体,DNA,双链分开，而闭合环状的质粒,DNA,处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开,试剂的作用（一）,13,Solution III,中和后，宿主,DNA,由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与,SDS,、蛋白质、高分子量的,RNA,等缠绕在一起沉淀下来，而质粒,DNA,由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态,。,试剂的作用（二）,14,试剂的作用（三）,苯酚,/,氯仿： 纯化质粒，去除质粒溶液中残留的蛋白质等杂质；,无水乙醇或,95%,乙醇或异丙醇：沉淀质粒,DNA,TE,或,H,2,O,：溶解质粒,DNA,15,实验材料,携带,pUC19,质粒载体的,大肠杆,菌菌液,携带含有水稻,DNA,片段的,pU1301,载体的大肠杆菌菌液。,16,操作步骤,取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的,LA,培养基上涂布或划线分离单菌落，,37,过夜培养）；,用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的,LB,培养基中，,37,摇床,250 r/min,过夜培养,17,吸取,1.5 ml,菌液，,12000 g,离心,1,分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取,1.5 ml,菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；,加入,300,l,溶液,I,振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；,加入,300,l,溶液,II,，,轻柔颠倒混匀,，放置,2-3,分钟至清亮；,加入,300,l,溶液,III,，颠倒混匀，放置于冰上,10,分钟，使杂质充分沉淀；,18,12000 g,离心,10,分钟；,吸取,800,l,上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一个,1.5ml,离心管中，加入,2/3,体积的异丙醇，混匀，室温下放置,5,分钟；,12000 g,常温离心,15,分钟；,倒尽上清，加,500,l 75,乙醇浸洗除盐，（放置片刻后离心,5,分钟，弃上清）,加,40,l,灭菌超纯水或,TE,溶解；,质粒的质量检测，,-20,保存。,19,氨苄青霉素（,ampicillin,）：,其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。,氨苄青霉素抗性基因（,amp,r,）：,合成,-,内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解,(,使用浓度,100,g/ml),卡那霉素（,Kanamycin sulfate,）,：,核糖体结合，抑制蛋白质的合成（使用浓度：,50,g/ml),RNaseA:,C,或,U,的,3,P,与相邻的,5,OH,处切开,RNA,。 配制：一般以,10mg/ml,溶于,TE,中，然后在沸水中煮,15,分钟，分装成小份储存于,20,。,试验中用到的抗生素和酶,20,DNA,纯度：,吸光值检测：检测,260nm,、,280nm,吸光值，紫外分光光度计,A,260,/A,280,=1.8,1.9,；,1.8,最佳，低于,1.6,说明有蛋白质，大于,1.9,说明有,RNA,。,质量检测：,琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附近无,DNA,带（无染色体,DNA,污染）。,质粒,DNA,质量检测,21,Hoechst33258:,可与纳克级的,DNA,结合，而几乎没有,RNA,亲和性，激发波长,365nm,，发射波长,460nm,。,0.1,g/ml Hoechst33258,适用于检测,500ng/ml,的,DNA,浓度，染料增加到,1,g/ml,，分析范围可延至,15,g/ml,，但会降低一定的灵敏度。,缺点：更易于结合,AT,丰富区，对,DNA,组成敏感。,EB:,与,DNA,组成无关，但不如,Hoechst33258,敏感，且能结合,RNA,，激发波长,302nm,，发射波长,590nm,。,3. DNA,的定量,（,1,）荧光检测仪,1 OD,50,g/ml DS-DNA,或,1 OD,40,g/ml RNA or SS,DNA,（,2.,）,分光光度计,22,琼脂糖凝胶电泳检测,将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上；,称取,0.24 g,琼脂糖于,30 ml 0.5TBE,中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；,凝胶凝固后，小心拔去梳子,23,将,5,l,DNA,样品与,1,l,上样缓冲液和,4,l,H,2,O,混合后依次加入点样孔中；,将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动,（注意点样孔在电泳槽的负极一端）,；,电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入,0.5,g/ml,的溴化乙锭（,EB,）中浸泡,10,15 min,，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。,24,质粒电泳检测：,一般有一至三条带（质粒,DNA,的三种构型）,超螺旋,开环,线型,25,质粒电泳检测,26,本科生试验图片,27,质粒载体的抽提，外源,DNA,的准备,琼脂糖凝胶电泳检测,DNA,的质量,亚克隆载体与外源,DNA,的限制性内切酶消化,(,目的片段的回收，亚克隆载体的去磷酸化,),载体与外源,DNA,的连接,感受态细胞的制备,连接子转化感受态细胞,重组子的转化及筛选、鉴定,利用质粒克隆外源,DNA,片段的主要步骤,28,外源,DNA,克隆的要求,特点,相同的突出端,线状质粒,DNA,常需用磷酸酶（,CIP,）处理,一般酶切位点常可保留,外源,DNA,会以两个方向插入,重组质粒可带有外源,DNA,的串联拷贝,不同的突出端,用两种限制酶消化后需纯化质粒以提高连接效率,一般酶切位点可保留,非重组克隆背景低,不需,CIP,处理,外源,DNA,只以一个方向插入重组质粒中,末端为平端,要求较高的,DNA,及连接酶,不同酶切的平头可连接,非重组克隆的背景高,质粒及外源,DNA,连接处的酶切位点消失（不同平端酶）,重组质粒可能带有外源,DNA,的串联拷贝,不同末端克隆的要求及特点,29,限制性内切酶,碱性磷酸酶,连接酶,几种工具酶,30,限制酶的一个活性单位（,1U,）：,原则上指在,50,l,反应体系中，,37,下，经过,1,小时的反应将,1,g,的,DNA,完全分解所需要的酶量。,限制酶的,star,活性：,限制酶在极端非标准条件下使用时对底物,DNA,的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定,DNA,序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的,star,活性。它的出现的频率与酶、底物的浓度及反应条件有关。,31,高浓度的甘油（,5,）；,酶过量（,100U/ug,）；,低离子强度（,pH8.0),；,有机溶剂（,DMSO,，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；,用其他二价阳离子代替,Mg,2+,(Mn,2+,Cu,2+,Co,2+,Zn,2+,),不同的酶对上述因素的敏感程度不同,引起星星活性的主要因素：,32,氯化镁、氯化钠,/,钾、,Tris,盐酸盐、,巯基乙醇或二硫苏糖醇（,DTT,）,牛血清白蛋白（,BSA,）,典型的限制性内切酶作用的,缓冲体系,成分包括：,33,注意,注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了,buffer,和作用的温度等,涉及到酶的操作时,一律在冰上操作,使用移液器吸取酶时，,tip,头只能刚刚插入液面吸取,如果有多个反应，酶、,buffer,、水等应配制成,mixture,再分装,各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心,34,BamH I,：,G,GATT C,C CTAA,G,Kpn I:,G GTAC,C,C,CATG G,35,含外源,DNA,片段的,载体,(M812),（,50,l,反应体系，用,1.5ml tube,，冰上操作）,质粒,DNA,30,l,BamH I (10u/,l),1,l,Kpn I,(10u/l),1,l,10buffer5,l,ddH,2,O13,l,分别取,5,l,酶切产物,用,0.8,1.2%,凝胶检测酶切效果,50,l,Total,目的 载体（,pUC19),的限制性内切酶消化,36,电泳检测,Marker,pUC19,质粒对照,pUC19,质粒酶切产物,M812,质粒对照,M812,质粒酶切产物,点样顺序：,37,2011本科生酶切图片,lane1-4, pUC19,酶切产物,Lane5 , pUC19,质粒,Lane6,，,M812,质粒,Lane7-10, M812,酶切产物,Lane11, DL-2000,marker,1,11,38,2010学生酶切图片,lane1-4, pUC,酶切产物,lane5-8, M812,酶切产物,无,marker,无质粒对照,1,2,3,4,5,6,7,8,39,造成,DNA,酶切不完全的主要原因有：,DNA,问题：不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；被甲基化；酶切后,DNA,粘末端退火；识别位点的两侧插入了影响酶切效率的序列；,操作不当：酶或,DNA,粘在管壁上，反应体系没完全混合；酶粘度大，取样不准或酶稀释不正确；,反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适,;,酶的问题：活力不够；强烈振荡使酶变性；过度稀释使酶活性降低等。,40,DNA,样品中抑制酶活的污染物主要有：,DNA,样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、,EDTA,、,SDS,、高浓度的盐等均能抑制酶切活性,解决办法：,增加酶作用的单位数（,10-20U/,g DNA),增大反应体积以稀释可能的抑制剂,延长反应时间,消化基因组,DNA,时，加入终浓度,1-2.5m mol/L,多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物。,纯化,DNA,41,酶切反应的终止,加入终农度为,12.5m mol/L,的,EDTA,以鳌合镁离子而终止酶的反应,多数酶在,65,C 10,分钟可被不可逆灭活，少数,65,C,不失活的酶在,75,C 15,分钟也能失活,若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化,42,pUC19,酶切产物的纯化：,加入,ddH,2,O 150,l,（扩大体积），加入,200,l,氯仿,/,异戊醇（,24:1,），颠倒混匀后离心,10 min,；,吸出上清，加,1/10,体积,3M NaAc,和两倍体积乙醇，,-20,放置,15,分钟以上；,12000 rpm 4,冷冻离心,15,分钟；,倒去上清，用,75,乙醇浸洗沉淀，,12000 rpm 4,冷冻离心,10,分钟,;,吹干后,DNA,溶于,10,l ddH,2,O,43,氯仿,对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。,苯酚,是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。,注意,44,当一个体系中有多种,DNA,分子，而我们只需要其中的某种,DNA,时或者反应体系中含有目的,DNA,子以外的其它分子如各种工具酶、,dNTPs,、引物及矿物油等时，可以利用凝胶电泳分离各种,DNA,，然后挖胶回收目的,DNA,带。,回收方法主要有：,1.,低熔点琼脂糖,2.,透析带电洗脱法,3.glass milk,纯化,4.,柱回收试剂盒,DNA,的回收纯化：,45,制,1,的琼脂糖凝胶,上样,2-4V/cm,的电压下电泳至目的,DNA,带与引物二聚体及其他,DNA,带分离开,紫外灯下切下目的,DNA,带（,50,100l,）放入,1.5ml,试管中,加,2,3,倍体积,6M,的,NaI,溶液,(150l,，浸没凝胶块即可,),55C,保温,5-10min,（不时上下颠倒试管以促进凝胶融化）,加,2l Glass milk 55C,放置,5,10min,12000g,离心,30,秒,1,分钟,弃上清，加,300l washing buffer,，重悬打匀,12000g,离心,30,秒,1,分钟,重复,9,10,步,弃上清，空气干燥,10,分钟左右,10l,灭菌超纯水溶解,DNA,（,5l,用于连接反应，,5l,用于检测回收效率）,利用,Glass milk,从琼脂糖凝胶中回收,DNA,片段,46,晶美,DNA,回收试剂盒从凝胶中回收,DNA,制,1,的琼脂糖凝胶（,1TAE,或,1TBE,），上样,2-4V/cm,的电压下电泳至目的,DNA,带与引物二聚体及其他,DNA,带分离开,紫外灯下切下目的,DNA,带（,50,100mg,）放入,1.5ml,试管中,加,3,体积的,Binding solution (,若用,TBE,胶，加,1/2,体积的,TBE conversion buffer,和,4.5 ,体积的,Binding solution,）,55,C 5,分钟（其间摇动管子并快速放回水浴锅）使凝胶溶化,加入,Silica Power Suspension,（,5l),， 混匀，,55C 5 -10,分钟,离心,5,秒，上清转至另一离心管中备暂时保留（,回收效率分析）,47,用,500l,冰冷的,Prepared Wash Buffer,重悬沉淀，用移液器或,振荡器,混匀，离心,3-5,秒，去上清（,若,DNA,片段,5kb,用振荡器振荡易打断,DNA,）,重复洗涤沉淀,2,次,用水或,TE,（,5l),重悬,Silica Power,/DNA,，,55C 5,分钟，离心,30,秒，小心将上清吸取到一新离心管中,(,不要吸到沉淀）,重复,2,次，合并上清,检测回收产物,48,注意,切胶时尽量减少凝胶暴露在紫外灯下的时间以避免嘧啶二聚体的形成,胶的体积：,1g,约等于,1ml,第,5,步若胶溶化不好：,胶尽量切薄一点（,2mm),时间可延长至胶溶化,4. 2,l,的,Silica Power Suspension,可以结合,1,g DNA, 0.1-2.5 g DNA,用,5l,足够了，,DNA,多于,2.5 g,时，每多,1 g,再多加,2l,的,Silica Power Suspension,49,柱式,DNA,胶回收试剂盒,操作步骤：,1.,通过琼脂糖凝胶将目的,DNA,带与载体带分开；,2.,紫外灯下用干净的刀片切下含目的,DNA,带的胶块放入,1.5ml,离心管中；,（注意：不含,DNA,的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽量缩短,DNA,暴露在紫外光下的时间）,3.,按,400,l/100mg,胶的比例加入,Binding Buffer II, 50-60,C,水浴中,10,分钟，使胶融化，,每,2-3,分钟混匀一次；,（注意若胶的浓度较大需增加,Binding Buffer II,的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）,4.,将融化的胶溶液转移到套放在,2ml,收集管内的,UNIQ-10,柱中，放置,2,分钟，,8000rpm,离心,1,分钟；,50,5.,取下,UNIQ-10,柱，倒掉收集管内的废液，将,UNIQ-10,柱放入同一个收集管内，加入,500,l Wash Solution ,8000rpm,室温离心,1,分钟；,6.,重复,5,步一次，,7.,取下,UNIQ-10,柱，倒掉收集管内的废液，将,UNIQ-10,柱放入同一个收集管内，,12000rpm,室温离心,15,秒；,8.,将,UNIQ-10,柱放入一个新的,1.5ml,离心管内，在柱子膜中央加,40,l Elution Buffer,或水（,pH7.0,），室温或,37C,放置,2,分钟；,（提高洗脱温度到,55,C-80C,有利于提高,DNA,的洗脱效率）,9. 12000rpm,室温离心,1,分钟，离心管中的溶液即为回收的,DNA,片段,51,注意,1.,首次使用前，必须在,Wash Solution,中加入,4,倍体积的无水乙醇，充分摇匀后使用，每次使用后将瓶盖拧紧，以保持,Wash Solution,中的乙醇含量。,2. Elution Buffer,为,2.0mmol/L Tris-HCl, pH8.5. 4,C,保存。也可用,PH8.0,的,TE,或,PH,7.0,的水代替。,52,载体去磷酸化,53,细菌碱性磷酸酶（,BAP,）,牛小肠碱性磷酸酶（,CIAP,）以及小虾碱性磷酸酶（,SAP,）都能催化磷酸单脂键的水解（包括,DNA,、,RNA,、,dNTP,和,NTP,上的,5,磷酸残基） ，不能催化磷酸三脂的水解。,比较而言，,CIAP,的活性比,BAP,的高,10,20,倍,CIAP,经加热处理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不论是,BAP,还是,CIAP,还需要经苯酚处理。而,SAP,经,65C,加热,15,分钟就可完全失活。,活性定义：在,37 C,、,pH9.8,的条件下，,1,分钟内水解对硝基苯磷酸盐（,-nitrophenyl phosphate),生成,1M,的对硝基苯,(-nitrophenol),所需的酶量定义为,1,个活性单位（,U,）,.,碱性磷酸酶,54,载体去磷酸化反应体系：,DNA20,l,CIAP,（,TaKaRa,）,0.5,l,10,buffer4.0,l,ddH,2,O15.5,l,37,或,50,反应,30 min,以上,Total 40,l,55,去磷酸化载体的纯化,加,0.4,l 0.5M,的,EDTA,（终浓度,5mM),，,75,水浴,10 min,使,CIAP,失活；,加入,ddH,2,O 150,l,（扩大体积），加入等体积苯酚,/,氯仿,/,异戊醇（,25:,24:1,），颠倒混匀后离心,10 min,；,吸出上清，加,1/10,体积,3M NaAc,和两倍体积乙醇，,-20,放置,15,分钟以上；,12000 rpm 4,冷冻离心,15,分钟；,倒去上清，用,75,乙醇浸洗沉淀，风干后溶于,10,l ddH,2,O,（,0.5ml tube,中）,56,载体与外源,DNA,片段的连接,57,连接酶使双链,DNA 5,P,与相邻的,3,OH,之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有,5,磷酸基团， 则可形成,4,个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成,2,个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有,2,个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。,58,大肠杆菌连接酶,T,4,噬菌体连接酶。,连接酶,59,各种连接酶特性的比较：,60,外源,DNA4,l,目的载体,DNA4,l,10,buffer1,l,T4 ligase (1U/,l)1,l,连接反应体系：,16 C,水浴保温过夜,Total 10,l,61,感受态细胞的制备及质粒的转化,转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入受体细胞中的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。,62,感受态细胞的制备,体外连接的,DNA,重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源,DNA,的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和,CaCl,2,法将外源,DNA,导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和,CaCl,2,感受态细胞。,63,将外源,DNA,导入大肠杆菌主要有两种方法：,CaCl,2,法：,利用冰冷的,CaCl,2,处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的,“,感受态,”,，易于摄取外源,DNA,。,10,6,10,7,转化子,/,g DNA,。,电转化法：,利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。,10,9,10,10,转化子,/,g DNA,；,64,所有操作均应在无菌条件和冰上进行；,所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率,。,操作注意事项,65,前夜接种受体菌（,DH5,），挑取单菌落于,LB,培养基中,37,摇床培养过夜（约,16,小时）；,取,1ml,过夜培养物于,100ml,添加有,20mM MgCl,2,的,LB,培养基中，在,37,摇床上剧烈振荡培养约,2.5-3,小时（,300rpm,）；,将,0.1M CaCl,2,溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作,吸取,1.5ml,培养好的菌液至,1.5ml,离心管中，在冰上冷却,10,分钟（每个小组需多做,2,管转化时用作对照）；,CaCl,2,感受态细胞的制备（一）,66,4,下,5000rpm,冷冻离心,8,分钟；弃去上清，再收集一次菌液，,4,下,5000rpm,冷冻离心,8,分钟；,弃去上清，加入,100,l,预冷,0.1M CaCl,2,溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置,20,分钟；,4,下,5000 rpm,冷冻离心,8,分钟；,弃去上清，加入,100,l,预冷,0.1M CaCl,2,溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；,4,下,5000 rpm,冷冻离心,8,分钟,细胞重悬,20,l,预冷,0.1M CaCl,2,溶液，可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（,15%,20%,甘油）后超低温冷冻贮存备用（,70,）。,CaCl,2,感受态细胞的制备（二）,67,操作注意事项,密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测,OD,600,来控制。,DH5,菌株,OD,600,为,0.5,时细胞密度是,510,7,/ml,）；,所有操作均应在无菌条件和冰上进行；,所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。,68,转化步骤,制备选择性培养基平板：在融化的,250 ml LA,培养基中,250,l Amp,，,250,l X-gal,，,25,l IPTG,，混匀后倒入灭菌培养皿中；,取出,n+2,管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；,感受态细胞分别加,DNA,连接产物、标准超螺旋质粒,DNA,（阳性对照）及不加入任何,DNA,（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置,30,分钟；,69,热击：将离心管放置,42,水浴，热击,90,秒，注意：勿摇动离心管；,冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置,1,2,分钟；,复苏：每管加,400,l SOC,培养基，在,37,摇床温和摇动温育,45,分钟，使细菌复苏；,70,布皿：取适当体积均匀涂布于含有,IPTG,、,X-gal,、抗生素（,Amp,）的,LA,平板；,培养：倒置培养皿，于,37,培养,12,16,小时,即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）,71,注意：,利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，,转化细胞铺平板的密度要低,（,90mm,平板上不得超过,10,5,个菌落），同时,37 ,培养不应超过,20,小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将,内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。,72,电转化感受态细胞的制备（一）,前夜接种受体菌（,DH5,），挑取单菌落于,LB,培养基中,37,摇床培养过夜（约,16,小时）；,取,1ml,过夜培养物于,100ml LB,培养基中，在,37,摇床上剧烈振荡培养约,2.5-3,小时（,300rpm,）；,将菌液迅速置于冰上，同时,10%,的甘油置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作,吸取,1.5ml,培养好的菌液至,1.5ml,离心管中，在冰上冷却,10,分钟；,4,下,3000g,低温离心,5-10,分钟；,73,电转化感受态细胞的制备（二）,弃去上清，加入,1500,l,预冷的,10,的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；,4,下,3000g,低温离心,5-10,分钟；,弃去上清，加入,750,l,预冷预冷的,10,的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；,4,下,3000g,低温离心,5-10,分钟；,弃去上清，加入,20,l,预冷预冷的,10,的甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮,超低温冷冻贮存备用（,70,）,。,74,使用的培养基最好用,NaCl,减半的,LB,培养基；,密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞,（一般通过检测,OD,600,来控制。,DH5,菌株,OD,600,为,0.5,时细胞密度是,510,7,/ml,）,；,制备感受态细胞及配制试剂所用的水应达到,18 M,即使用超纯水；化学试剂应是分子生物学级；,所使用的枪头和器皿都应是新的，干净无菌的；,无菌操作；,低温（冰上）进行。,操作注意事项,特别控制盐离子的残留,75,影响电转化效率的因素,细胞的生长状态非常重要,，快速生长的细胞最适于制备感受态细胞；,细胞转化效率与所加电场的强度和脉冲持续时间有关。,细胞上穿孔的数目和孔径大小随着所加电场的强度和脉冲持续时间的增加而增加，但超过了一定的限度，就会对细胞造成伤害。,不同的细胞最适的电压不同，从,450v/cm,（昆虫细胞）到高于,12.5 kv/ cm,（细菌细胞），同时也与所使用的电转化杯有关，对于大肠杆菌而言，,0.1cm,的杯子使用,1.8 kv,（,18 12.5 kv/ cm,），,0.2cm,的杯子使用,2.5kv,（,12.5 kv/ cm),。时间一般设置为,5,毫秒,76,外源分子的纯度。,杂质在转化过程中会转入细胞造成不可预知的影响，且常常增加细胞的死亡率；,制备感受态细胞所用的水应达到,18M,即使用,MilliQ,级的超纯水，化学试剂应是分子生物学级；,同样原因，所使用的,枪头和器皿都应是新的，干净的,;,电转化杯的质量,非常重要，随着使用次数的增加，转化效率会下降，这主要是因为铝的氧化会增加电路的电阻从而改变电场条件，另外若反复使用的转化杯没有洗干净，污染的,DNA,转入细胞从而造成假阳性克隆的生长。,77,7.,电击后，由于电解作用，细胞处于非常不利的环境中，必须,尽可能快的稀释转入合适培养基中让细胞复苏（,30,秒）。,8.,78,提高转化效率,感受态细胞的状态,质粒的质量和浓度,一定范围内，转化效率与质粒,DNA,的浓度呈正比,79,感受态细胞的转化效率：,1ng DNA,转化,100,l,感受态细胞，加,900 l SOC,培养基复苏（,1ng DNA/ml,），然后取,100 l,菌液涂平板,(0.1ng DNA),，假设每个平板上平均长出,100,个克隆，则其转化效率为：,100 cfu 0.1ng = 1000cfu /ng DNA,= 1,10,6,cfu / g DNA,80,X-gal,X-gal,-peptide when combined with the carboxyl terminus of,b,-galactosiase can make a functional,b,-galactosiase,-peptide,C-terminus of,b,-galactosiase,+,81,蓝色菌落：载体自连,白色菌落：含外源片段,82,无菌落长出,转化方面的问题，感受态细胞效率低,长出菌落很多，但白色菌落很少,感受态细胞转化效率较高，但连接反应有问题，大多数是载体自连产生的蓝色菌落,长出菌落很少，且白色菌落少,外源片段与载体的量都太少，连接子很少,外源片段与载体的比例不合适,连接缓冲液稀释倍数不对,连接时间不够长,体系中有抑制因子导致连接失败,外源片段插入了载体，但没有打破,LacZ,的阅读框，产生的菌落仍为蓝色,现象,原因,83,