乙肝核心抗原的检测与应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HBcAg的检测与应用,检验科,胡亚远,摘要,HBcAg,存在于,Dane,颗粒的核心，是,HBV,的结构蛋白即病毒核壳蛋白，具有重要的生物学特性和临床病理意义，,HBcAg,由,HBV,基因组的,C,开放读码区（,ORF,）编码，具有高度免疫原性，对,HBcAg,的免疫应答在病毒清除中有重要作用。血清,HBcAg,阳性可提供肝内,HBV,合成的信息，是病毒存在的直接标志，,HBcAg,感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞，肝细胞溶解后,HBcAg,可直接释放入血，故能直接反映肝细胞损害和病情进展的程度。检测肝组织,HBcAg,有助于确定乙型肝炎病原学诊断和评估肝细胞坏死炎性活动的程度及病变发展的趋向，推测慢性乙型肝炎的预后。血清和肝组织,HBcAg,检测具有多种实用价值，值得推荐。,0,引言,乙型肝炎病毒（,HBV,）是嗜肝,DNA,病毒，完整的,HBV,颗粒又称,Dane,颗粒，球形，直径约,42urn,。,HBV,核心抗原（,Hepatitis B Core Antigen,，,HBcAg,）存在于,Dane,颗粒的核心，是,HBV,的结构蛋白即病毒核壳蛋白，主要存在于受感染的肝细胞核内，它反映血清中,Dane,颗粒的存在及肝内,HBV,的复制。存在于乙型肝炎患者血液和肝组织内的,HBcAg,具有重要的生物学特性和临床病理意义。,1,生物学特性 1.1一般特性,HBcAg,由,HBV,基因组的,C,开放读码区（,ORF,）编码，从第二个,ATG,（,1 901 nt,）起始翻译（终止密码子在,2 458 nt,）。,HBcAg,有保守的三维结构，可因血清型不同而有,183-185,个氨基酸残基（,aa,），相对分子质量,Mr21,000,，,180,个,HBcAg,形成,27nrn,的正,20,面体以构成核心颗粒。,HBV,核心部分含有环状双股,DNA,、,DNA,聚合酶、,HBcAg,和,e,抗原（,HBeAg,），是病毒复制的主体。,HBcAg,包装,HBV DNA,，在病毒成熟过程中起重要作用。,HBcAg,己被证明含有,HBV,特异性,DNA,聚合酶，是,HBV,复制的标志。,1.1,一般特性,HBcAg,可在受染的肝细胞核中查到，但它主要在胞质中产生，由胞核定位序列（,nuclear localization sequences,，,NLS,）介导,HBcAg,进人细胞核中。胞核定位序列位于,HBcAg,的羧基末端区（,C,端区）第,145-156,位和第,172-183,位的氨基酸序列，具有与细胞核特异性结合，并将与之相连的蛋白或,DNA,转运到细胞核中的功能。,1.2,免疫反应,HBcAg,具有高度免疫原性，在,T,细胞和,B,细胞水平上，,HBcAg,的抗原性较,HBeAg,强,100,倍，几乎所有,HBV,感染者都产生抗,-HBc,，同时有,T,细胞免疫应答。对,HBcAg,的免疫应答在病毒清除中可能有重要作用。这对,HBcAg DNA,的疫苗研究有重要的指导意义。,1.2,免疫反应,Th,细胞根据其的分泌细胞因子不同可分为,Th1,和,Th2,亚群。,Th1,细胞主要产生白介素,-2,（,IL-2,），干扰素（,IFN,）和肿瘤坏死因子（,TNF,）等促进细胞免疫反应；,Th2,细胞主要产生白介素,-6,（,IL-6,）、白介素,-4,（,IL-4,）、白介素,-10,（,IL-10,）等促进体液免疫反应。,Th1,和,Th2,细胞通过分泌的细胞因子相互下调对方的生长分化，刺激自身的增生。,1.2,免疫反应,机体的,Th1,型免疫反应可促进病原体的清除，而,Th2,型免疫反应则可加重机体的病理损害，在,HBcAg,诱导下，外周血单个核细胞（,PBMC,）产生,Th1,类细胞因子量明显增高；在,HBeAg,诱导下，,Th2,类细胞因子量明显增高。慢性,HBV,感染进行免疫调节治疗的一个目标就是使,HBeAg,特异性,T,细胞由,Th2,细胞主导型转化为,Th1,细胞型，,HBcAg,有望打破,HBeAg,诱导的免疫耐受状态而增强,Th1,细胞优势表达达到治疗的目的。慢性乙型肝炎患者和,HBV,慢性携带者体内针对,HBV,的特异性,CTL,应答明显低下，纠正这种,CTL,低反应状态，对于机体有效地清除,HBV,至关重要。,1.2,免疫反应,DNA,疫苗（基因疫苗）是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域，它作为一种全新的高效免疫方法，己在许多难治性感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防及治疗领域显示出较好的应用前景。,DNA,疫苗可刺激机体特异性,CTL,功能的特性给,HBV,慢性持续感染的治疗带来新的希望。,1.2,免疫反应,采用治疗性疫苗打破宿主对,HBV,的免疫耐受状态来治疗慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎病毒携带者是一新的有效途径。,HBV,核心抗原区,AA1-AA151,段含有多个不连续的抗原表位，对刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫均具有重要作用。,Kuhober,和,Geissier,et al,作了,HBcAg DNA,疫苗肌内注射法免疫小鼠的初步观察。该,DNA,疫苗具有良好的细胞免疫原性，确可刺激宿主产生较强的,CTL,反应。这一结果为我们进一步探索该,DNA,疫苗在治疗主要因机体,CTL,功能低下所致,HBV,慢性持续感染方面的应用前景奠定了初步的实验研究基础。,2,临床应用,2.1,血清,HBcAg,HBsAg,、,HBeAg,、抗,-HBc,等免疫学指标都是体内存在乙型肝炎病毒颗粒的间接标志，而,HBcAg,则是,HBV,存在的直接标志。所以，,HBcAg,测定更能反映,HBV,的存在及其复制程度，比其他各种免疫学指标更灵敏、更特异。,HBcAg,是乙型肝炎病毒（,HBV,）的核心成分，若在血清中检出,HBcAg,则说明有,HBV,复制。,血中的,HBcAg,是作为,Dane,颗粒内部成分存在，极少有游离的,HBcAg,，故用常规方法不易检出，在血清中不能直接检出,HBcAg,，需加用开壳剂，使,HBcAg,释放于溶液中然后进行测定。检测,HBcAg,，目前多采用间接的方法，即首先在试管内将,Dane,颗粒沉淀，再用裂解剂裂解,Dane,颗粒外壳，使,HBcAg,暴露游离，并经过多次洗涤处理后，用放免或酶免方法检测。如用,EIA,微板法检测血清,HBcAg,，被检标本不须任何处理，直接在微孔板内进行检测，应用于临床，可与乙型肝炎病毒标志物同步检测。,检测,血,HBcAg,与,HBsAg,的关系,HBcAg,出现的阳性率与,HBsAg,的出现密切相关，往往,HBcAg,（）与,HBsAg,（）同时存在，而,HBsAg,（）时不一定会出现,HBcAg,（）。抗,-HBs,的出现并不标志着,HBV,复制的中止，而是复制水平减低。不能以,HBsAg,阴性就排除,HBV,感染，临床上,HBsAg,阴性的患者，只要,HBcAg,检出阳性，说明仍有乙型肝炎病毒复制。以往认为血清中仅,HBsAg,阳性者，病毒为非复制相，无传染性，但这种患者中，也有检测出,HBcAg,、,HBV DNA,阳性者，故判断单项血清,HBsAg,阳性者的传染性时应慎重。,血,HBcAg,与,e,系统的关系,HBeAg,阳性是,HBV,持续高水平复制和传染性强的标志，其与,HBcAg,、,HBV DNA,密切相关，并具有明显的平行关系。多年来，一直认为,e,抗原是复制标记物，由于,HBeAg,是,HBcAg,的降解产物，以可溶性蛋白形式存在，在结构上不及,HBcAg,与病毒颗粒关系密切，对判断病毒复制、评估传染性不及,HBcAg,敏感可靠。,血,HBcAg,与,e,系统的关系,一般认为，当,HBeAg/,抗,-HBe,转换后，,HBV,复制趋于减少，没有传染性或传染性很小。,HBeAg,被公认为是,HBV,复制的标志物。但部分阴性者,HBeAg,的血清中仍可检出,HBcAg,和（或）,HBV DNA,，说明,HBeAg,的表达可能不是,HBV,复制的必然结果，对,HBeAg,阴性感染者的带毒状态及抗,-HBe,表达的临床意义必须重新认识，不能忽视其具有传染性的可能。,血,HBcAg,与,HBV DNA,、,HBV DNA-P,的关系,在慢性乙型肝炎患者中，血,HBcAg,与血,HBV DNA,有很好的相关性；而在急性期，尤其是在肝损害极期时，往往血,HBcAg,阳性，而血,HBV DNA,阴性，考虑为,HBcAg,从受免疫损伤的被感染的肝细胞内释放入血，这种情况甚至在病毒已终止复制后也可出现。对,HBsAg,慢性携带状态患者，判断,HBV,复制及传染性，,HBcAg,的敏感性最高，,HBV DNA,和,HBV DNA-P,次之，,HBeAg,敏感性低。,不同肝病的检出率,慢性活动性肝炎中血,HBcAg,阳性率明显高于,ASC,（无症状病毒携带者），说明血,HBcAg,阳性较多见于病变活动较重的慢性肝炎而较少见于病变较静止的,ASC,。血清中的,HBcAg,阳性与肝脏病变活动程度有关，且对估计预后有很好价值。,HBcAg,检出结果是：肝硬化慢性乙型肝炎中型慢性乙型肝炎轻型。,检测血,HBcAg,的临床意义,（,1,）对血液内,HBV,的开壳处理，能直接检测,HBcAg,，能比,HBeAg,更客观地反映血,HBV,的存在，以及作出数量多少的判断，可替代,HBeAg,而作为病毒复制和传染性的敏感指标，是病毒存在的直接标志。它与,HBV,复制标志呈正相关，可以反映,HBV,活动的复制程度。,HBcAg,与乙型肝炎病毒其他五项标志物相比更是反映,HBV,复制的直接证据。它可与其他的,HBV,血清学标志物起到相互配合和相互补充的作用。,检测血,HBcAg,的临床意义,（,2,）有助于对乙型肝炎病情和预后的判断，,HBcAg,感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞，肝细胞溶解后,HBcAg,可直接释放入血，故能直接反映肝细胞损害和病情进展的程度。在急性乙型肝炎早期,HBcAg,亦达高峰值，而且病情严重者的,HBcAg,水平也相应提高。慢性乙型肝炎患者，血,HBcAg,阴性者比阳性者有明显的临床及生化指标的改善。,HBcAg,含量与肝脏损害的情况有关，有助于抗病毒药物及免疫治疗的疗效评价。,检测血,HBcAg,的临床意义,（,3,）从理论上讲，聚合酶链反应（,PCR,）检测法比固相放射免疫法灵敏度高，但实际上可出现,HBcAg,阳性而,HBV DNA,阴性的结果。因此，两种检测方法可以互补使用，以减少漏检。在不具备,PCR,检测条件的单位，以酶联（,ELISA,）法试剂盒在检测血清,HBV,五项标志的同时，检测,HBcAg,不仅能进一步了解病毒的复制情况，还可了解肝细胞损害和病情进展的程度，且检测费用低廉，有临床实用价值。,检测血,HBcAg,的临床意义,（4）在对献血员的筛选中，单凭HBsAg的测定来判断是否受HBV感染也是不够的，会漏诊HBsAg阴性而HBcAg和抗-HBc阳性的乙型肝炎患者，只有三者同时检测，才能更好地诊断乙型肝炎并防止在输血中传播，降低输血后肝炎的发生率。,2.2,肝组织,HBcAg,分布,HBcAg,主要存在于,HBV,颗粒和受染的肝细胞中，,HBV,复制时,HBcAg,表达于肝细胞内，分胞核型、胞质型和胞膜型。,Delladetsima,et al,发现胆管上皮细胞也是,HBV,的适合宿主，,HBV,能够在其中复制并表达,HBcAg,和,HBsAg,抗原。,肝内,HBcAg,与,HBV DNA,关系,肝内HBcAg与HBV DNA的分布区域常较一致，有的肝细胞可同时检出HBcAg和HBV DNA，但多数HBV DNA（）肝细胞并不同时含有HBcAg。HBV高复制期HBcAg以胞核表达为主，无或很少在胞质内表达；而低复制期时相反，HBcAg在肝细胞核内而不是细胞质内的表达程度能够精确地反映慢性乙型肝炎患者的病毒复制水平。肝HBcAg与血清HBV DNA水平呈正相关。经干扰素治疗后的慢性活动性乙型肝炎患者，HBcAg发生从核内向胞质的转换。,肝内,HBcAg,与,HBeAg,关系,HBcAg,与,HBeAg,常同时表达在肝细胞内，但在亚细胞水平有重要差异。在病毒活跃复制的,ASC,，常有较强的,HBcAg,胞核表达和,HBeAg,胞质表达；活动性慢性乙型肝炎时常有,HBcAg,的胞质表达，因免疫清除而病毒减少，难以检出,HBeAg,。作为免疫攻击的靶抗原，,HBeAg,不及,HBcAg,重要。,肝内,HBcAg,与肝组织炎症活动关系,血清,HBV DNA,、,HBeAg,和定位于核内的,HBcAg,都与肝组织的损害程度无关。慢性,HBV,感染者肝组织中浆膜型,HBcAg,的表达强度随肝组织病变活性积分（,HAI,）评分值的增高而增强，,HAI,评分值低者核型,HBcAg,的表达增强。,HBcAg,在核内或胞质内同时表达的其“炎症活动指数”高于,HBcAg,在胞质内和膜内表达。,肝内,HBcAg,与肝组织炎症活动关系,光镜下发现浆膜型,HBcAg,多分布于碎屑样坏死及灶性坏死区，浆膜型,HBcAg,阳性肝细胞常有各种变化，或明显萎缩，或肿胀变形。增生胞核抗原（,PCNA,）是再生肝细胞的标志，代表肝组织的炎症活性，,PCNA,与胞质,HBcAg,表达程度正相关，但不是胞核型,HBcAg,的独立影响因素。发生前,-C,区突变的,HBV,与未发生突变的野生株相比,HBcAg,在胞质内表达显著增高，并伴有较明显的肝组织炎症活动。,HBcAg,在胞质内表达预示预后不良。,肝内,HBcAg,与肝组织炎症活动关系,乙型肝炎引起的肝硬化肝组织中,HBcAg,、,HBV DNA,的阳性率较高。,HBcAg,颗粒在肝组织中主要呈弥漫的浆膜型分布，,HBcAg,和,HBV DNA,呈浆、膜型分布者，其肝组织中,HBV DNA,表达程度、炎症活动度和纤维组织增生程度，明显较呈核型分布者高。,HBcAg,及,HBV DNA,阳性的肝组织，炎症活动明显，界面呈碎屑坏死，灶性坏死。,肝内,HBcAg,与肝组织炎症活动关系,观察肝内颗,HBcAg,粒的分布类型，有助于判断,HBV,在肝组织中的复制状况；肝组织病变的活动程度。这可能是由于机体对呈浆、膜型分布的,HBcAg,和,HBV DNA,具有更加强烈的免疫反应，将肝内含活跃复制的,HBV DNA,和靶抗原,HBcAg,表达的肝细胞溶解破坏，以清除病毒所致。,合并丁型肝炎时，肝内,HBcAg,表达特点,HBV,合并,HDV,感染者的肝组织中，,HBcAg,和,HDAg,阳性细胞分布关系不密切，,HBcAg,阳性细胞明显少于,HDAg,阳性细胞，,HBcAg,主要呈核型表达，胞质中阳性颗粒较少见到，表达强度也较弱，表明,HDV,感染者,HBV,是低水平复制，,HDV,可能有抑制,HBV,基因复制或病毒抗原表达的作用，特别是在,HDV,复制活跃的阶段，即,HDAg,大量表达时，,HBV,复制受到的抑制最为明显。,儿童肝内,HBcAg,表达特点,儿童肝内,HBcAg,主要表达于核内。肝内,HBcAg,呈弥漫性分布者，多见于,10,岁以内的较小儿童；而呈局灶性分布者，多见于,10,岁以上的较大儿童，,HBcAg,呈局灶性分布比弥漫性分布者，,ALT,水平较高并伴有较明显的肝脏炎症活动。在儿童慢性乙型肝炎患者中，肝内,HBcAg,呈弥漫性分布者为病毒感染早期，,HBcAg,呈局灶性分布并伴随,HBeAg,阳性者为疾病短期内进展的标志。,肝组织,HBcAg,检测的应用价值,（,1,）检测肝组织,HBcAg,有助于确定乙型肝炎病原学诊断，尤其是对于血清乙型肝炎病毒标志物阴性病例，在病原学诊断中弥补血清学诊断乙型肝炎的不足。,肝组织,HBcAg,检测的应用价值,（,2,）有助于评估肝细胞坏死炎性活动的程度及病变发展的趋向，推测慢性乙型肝炎的预后。肝细胞内,HBcAg,转阴和肝细胞坏死病变减轻具有一致性。,HBcAg,浆膜型者显示此种一致性，而核型则否，可能由于肝细胞质、膜上的,HBcAg,作为靶抗原易受到杀伤性了淋巴细胞的攻击，导致肝细胞损害，而核型,HBcAg,则不具有此种作用。,肝组织,HBcAg,检测的应用价值,（,3,）,HBcAg,检测也是判断,HBV,复制状态的一项重要指标，肝组织,HBcAg,与,HBV DNA,两种病毒复制标志物相关。研究结果证实肝组织,HBcAg,检测具有多种实用价值，值得推荐。,2.3,其他组织的,HBcAg,表达,国内学者对乙型肝炎孕妇所分娩的死胎进行研究，发现,HBcAg,在多种脏器内均可表达，其中以肺、肝、肾脏、脐带为最高，胸腺、心脏、脾、胎盘次之，大脑最低。说明,HBV,有可能在多种组织内复制并表达抗原。这可能是,HBV,通过产妇传播，导致新生儿乙型肝炎的高发病率、新生儿发育不良和死亡的重要因素。,3 小结,总之，充分认识,HBcAg,的生物学特点和其在血液、肝组织内表达的规律，有助于我们通过对,HBcAg,的检测而正确判断是否有,HBV,的复制以及复制的强度，正确评估肝病活动及肝组织损害的程度，从而指导制定有效的治疗方案。对,HBcAg,的强免疫原特性的认识，可以指导我们研制更有效的预防或治疗乙型病毒性肝炎的疫苗。,4 HBcAg的ELISA法检测 4.1试剂,HBcAg ELISA试剂由北京美迪科生物技术有限公司提供，试剂主要包括HBsAb包被板、HBcAg包被板、开壳剂、HBcAb-HRP结合物、底物液TMB等。,4.2 步骤,（1）标本处理：取血清检测。,（2）乙肝病毒Dane颗粒的分离。将HBsAb包被板用蒸馏水洗2次并拍干，每孔加样本、阴阳性对照血清各100ul（空白对照孔不加），用封片纸封好，45温育30分钟，弃去孔内液体并用蒸馏水洗7次并拍干。,（3）,加开壳剂释放出,HBcAg,。将上述的,HBsAb,包被板每孔加入,100ul开壳剂,（空白对照孔不加），置,45,温育,30,分钟。,4.2 步骤,（4）,中和抑制法检测,HBcAg,。将上述的,HBsAb,包被板每孔中的开壳液转移,50ul,至相应的已用蒸馏水洗,2,次并拍干的,HBcAg,包被板中（注意每份样品要更换一个吸头，以防交叉污染），然后每孔加入,HBcAb-,酶结合物,50ul,（空白对照孔不加），混匀并封板，置,45,温育,30,分钟，弃去孔内液体并用蒸馏水洗,7,次并拍干。,4.2 步骤,（5）显色。将上述的HBcAb包被板每孔中加底物液A、B各50ul，混匀，室温放置10-20分钟。每孔中加入终止液（2MH,2,SO,4,）50ul，混匀，选择波长450nm，空白孔调零，上酶标仪测OD值。,（6）,结果判定。,Cutoff,值（界限值）,=,阴性对照,OD,均值,/2.1,。标本,OD,值,Cutoff,值，为阳性；,OD,值,Cutoff,值，为阴性。,4.2 步骤,（5）显色。将上述的HBcAb包被板每孔中加底物液A、B各50ul，混匀，室温放置10-20分钟。每孔中加入终止液（2MH,2,SO,4,）50ul，混匀，选择波长450nm，空白孔调零，上酶标仪测OD值。,（6）,结果判定。,Cutoff,值（界限值）,=,阴性对照,OD,均值,/2.1,。标本,OD,值,Cutoff,值，为阳性；,OD,值,Cutoff,值，为阴性。,谢谢,