过氧化氢酶活性的测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,过氧化氢酶活性的测定,碘量法,实 验 三,学时：,3,1,生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是清除体内自由基：,POD,：过氧化物酶,SOD,：超氧化物歧化酶,CAT,：过氧化氢酶,2,1,、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法；,2,、了解过氧化氢酶的作用。,一、实验目的：,3,植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使,H,2,O,2,发生累积。,H,2,O,2,可进一步生成,氢氧自由基（,OH,）。,氢氧自由基（,OH,）,是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。,过氧化氢酶,(catalase,；,CAT),可以清除,H,2,O,2,、分解,氢氧自由基，,保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此,CAT,是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。,二、实验原理,:,4,CAT,活性大小以一定时间内分解的,H,2,O,2,量来表示：,在一定条件下，,CAT,能把,H,2,O,2,分解为,H,2,O,和,O,2,。,当,CAT,与,H,2,O,2,反应一定时间,(t),后，再用碘量法测定未分解的,H,2,O,2,，以钼酸铵作催化剂，,H,2,O,2,与,KI,反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，反应式为：,H,2,O,2,（余）,+2KI+H,2,SO,4,-I,2,+K,2,SO,4,+2H,2,O,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,-2NaI+Na,2,S,4,O,6,（连二硫酸钠）,用硫代硫酸钠分别滴定空白液,(,可求出总的,H,2,O,2,量,),和反应液,(,可求出未分解的,H,2,O,2,量,),，再根据二者滴定值之差求出分解的,H,2,O,2,量。,二、实验原理,:,5,1,、实验材料：,三叶草,2,、仪器：,(1),滴定管,(2),研钵,(3),容量瓶,(4),移液管,(5),三角瓶,(100ml),3,、试剂：,（,1,）,0.05M H,2,O,2,（,2,）,0.2M Na,2,S,2,O,3,（,3,）,1.8M H,2,SO,4,（,4,）,1.5%,淀粉溶液,（,5,）,10%,（,NH,4,),6,Mo,7,O,24,（,6,）,20% KI,（,7,）,CaCO,3,，石英砂,三、实验材料、仪器和试剂：,6,1,、酶液提取：,称取,0.5g,三叶草，加少量石英砂，,CaCO,3,，,2ml,水，研成匀浆，移入,50ml,容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。,2,、酶促反应：,（,1,）取锥形瓶,2,个，编号,A,，,B,，各加入,10ml,酶液，之后立即向,A,瓶中加入,1.8mol/L H,2,SO,4,5ml,，终止酶活性，作空白滴定。,（,2,）向,A,，,B,两瓶各加,H,2,O,2,5ml,，摇匀，在加入,B,瓶那一刻起，记录,时间，,5,分钟后迅速向,B,瓶中加入,1.8mol/LH,2,SO,4,5ml,，终止酶活性。,3,、滴定：,向,A,，,B,两瓶各加,1ml 20% KI,和,3,滴（,NH,4,）,6,Mo,7,O,24,，摇匀后迅速加入,5,滴,1.5%,淀粉溶液，用,Na,2,S,2,O,3,进行滴定至蓝色恰好消失，记录两次消耗,Na,2,S,2,O,3,的体积,V,A(,空白,),，,V,B(,反应液,),。,四、实验步骤：,7,酶活性测定,管号,酶液,(ml),1.8M H,2,SO,4,(ml),0.05M,H,2,O,2,保温,1.8M,H,2,SO,4,(ml),20% KI,溶液,(ml),钼酸铵溶液,(,滴,),淀粉溶液,(,滴,),0.2M,Na,2,S,2,O,3,溶液的滴定量,A,空白,10,5,5,5,分钟,-,1,3,5,V,A(,空白,),=,B,反应,10,-,5,5,1,3,5,V,B(,反应液,),=,8,1,、被分解的,H,2,O,2,量（,mg,）,=,（空白滴定值,-,样品滴定值）,Na,2,S,2,O,3,摩尔浓度,17,2,、,CAT,活性（,mg.g,-1,.min,-1,）,=,被分解的,H,2,O,2,量（,mg,）,(,总体积,测定取液量,),样品重（,g,）,时间（,min,）,五、实验结果与计算：,9,六、思考题：,1,、,本实验中影响,CAT,活性测定的因素有哪些？,10,