分子生物学实验技术3

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,分子生物学实验三,分子生物学实验三,1,Contents,质粒,DNA,的酶切及分析,1.,重组蛋白质表达的鉴定,2.,分子生物学课题设计,3.,2,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）,常规,PAGE,不连续,PAGE,SDS-PAGE,固相,pH,梯度,IEF(IPG-IEF),双向电泳,3,凝胶聚合原理,化学聚合,以过硫酸铵（,AP,）为催化剂，以四甲基乙二胺（,TEMED,）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。,光聚合,核黄素,B1,还原型 游离基 聚合反应,光照,O,2,4,凝胶的孔径,单体和双体在凝胶中的总浓度,a+b,V, 100%,T,双体占总浓度的百分含量，即交联度,b,a,b, 100%,C,a,，,Acr,的质量（,g,）,b,，,Bis,的质量（,g,）,V,，溶液的体积（,ml,）,C,6.5,-0.3T,T,：,5,20,孔径大小,5,蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系,蛋白质相对分子质量范围,(kD),适用的凝胶浓度（,T%,）,10,20,30,10,40,15,20,40,100,10,15,100,500,5,10,500,25,凝胶浓度的选择,6,不连续,PAGE,的分离效应,浓缩效应,分子筛效应,电荷效应,可分离：,1.,电荷性质与密度相近的但分子量有差别,2.,分子量相近、性质一样、电荷与密度有差别 的分子,3.,电荷性质、分子量大小相近，但构型不同,7,浓缩效应,1.,缓冲液与凝胶的离子成分和,pH,值不同。,Cl,-,，,Gly,-,，蛋白质离子。快慢离子迁移快慢的差别造成电场强度与电导率的变化。低导电区和高导电区。蛋白质样品迁移率在快慢离子之间，压缩聚集成一条窄带。,2.,两层凝胶的孔径不同：浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶,8,分子筛效应,移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的,pH,变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解离出,gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和,pH,值中泳动，依其分子量的大小而分开。,9,电荷效应,蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子的迁移率的关系，在同一电场强度中，在单位时间内各分子迁移的距离的差别而到达分离。,10,重组蛋白在原核生物中,诱导表达的,SDS-PAGE,鉴定,(B,菌,),11,实验原理,SDS-PAGE,：消除电荷对蛋白质样品迁移率的影响，电泳迁移率取决于蛋白质的分子量大小。,SDS,是一种阴离子去垢剂，溶液中带负电荷。,SDS,能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，蛋白质解聚为单一多肽。,蛋白质多肽与,SDS,分子按比例结合，形成带负电荷的,SDS-,蛋白质复合物，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块。,12,影响因素,溶液中,SDS,单体的浓度大于,1mmol/L,时大多数蛋白质与,SDS,结合的重量比为,1:1.4,，,如果单体浓度低于,0.5,mmol,/L,，两者的结合比仅为,1: 0.4,这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与,SDS,的充分结合，它们的重量比应该为,1:4,或,1:3,样品缓冲液的离子强度。,SDS,电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是,10,100mmol/L,用,SDS,处理样品同时用巯基乙醇或,DTT,处理，完全还原蛋白质内的二硫键，使很多不溶性蛋白质溶解而与,SDS,定量结合。,13,实验试剂和器材,1.,材料：,低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶,B MW=97,400,牛血清白蛋白,MW=66,200,兔肌动蛋白,MW=43,000,牛碳酸酐酶,MW=31,000,胰蛋白酶抑制剂,MW=20,100,鸡蛋清溶菌酶,MW=14,400 2.,试剂,（略）,14,12,分离胶的制备：,15ml,ddH,2,O 4.8 ml,30%,凝胶储存液,6.0 ml,分离胶缓冲液（,pH8.8,）,3.8 ml,10,SDS 150,l,10,AP 150,l,10,TEMED 100,l,15,浓缩胶的制备：,5ml,ddH,2,O 3.34ml,凝胶储存液,0.83ml,浓缩胶缓冲液（,pH6.8,）,0.63ml,10,SDS 50,l,10,AP 50,l,10,TEMED 100,l,16,操作步骤,1.,将干净玻璃板在灌胶支架上固定好,.,固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板,.2.,按比例在烧杯中配好分离胶,用滴管快速加入,之后加少许蒸馏水封胶,静置,30,40min.,配制凝胶要迅速,催化剂,TEMED,要在注胶前再加入,否则凝胶无法注胶,.,注胶过程最好一次性完成,避免凝胶不均匀,.,17,操作步骤,封水的目的是为了使分离胶上沿平直，并隔绝空气，促使凝胶聚合过程；,凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面,.4.,倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入分离胶面上,迅速插入样梳,静置,30min.,样梳需平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,.,18,操作步骤,5.,拔出样梳。插入电泳槽，倒入缓冲液体，用缓冲液冲洗样品孔,要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果,.6,、用微量移液器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热,10,分钟。,注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样品下沉时会发生扩散,. ,为避免边缘效应,最好选用中部的孔上样,.,19,操作步骤,8.,电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在,80V,，当进入分离胶后改为,150V,，溴酚蓝距凝胶边缘约,5mm,时，停止电泳。,9.,凝胶板剥离与染色：电泳结束后，取出凝胶，考马斯亮蓝染色，做好标记后准备蛋白印迹。,剥胶时要小心,保持胶完好无损,.,20,注意事项,没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近,一定要催化充分，使之完全聚合,集中处理，实验中全部的胶专门收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，统一处理。,聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，因为其中可能留下少量没有聚合的单体。,21,重组,DNA,的酶切分析,目的基因非变性,PAGE,鉴定,22,1.,实验目的和要求,学习和掌握限制性内切酶的特性、酶切分析和,DNA,非变性,PAGE,鉴定的操作方法，并理解限制性内切酶是,DNA,重组技术的关键工具，非变性,PAGE,是高分辨率分离鉴定小分子双链,DNA,片段的有效方法。,23,2.,相关基础知识,限制性核酸内切酶,(Restriction Endonuclease,，,RE),：是一类能,识别双链,DNA,分子特异性核酸序列的,DNA,水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。,RE,不仅是,DNA,重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。,24,1),寄主控制的限制与修饰现象,2),核酸限制性内切酶的类型、命名法,3),核酸限制性内切酶的基本特性,4),同裂酶和同尾酶,5),影响核酸限制性内切酶活性的因素,25,1),寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种细菌都能合成一种或几种核酸内切酶，用来限制外源,DNA,存在于自身细胞内，但细胞自身的,DNA,不受影响，因为细胞内还合成了一种修饰酶，能对自身的,DNA,进行修饰，限制性酶对修饰过的,DNA,不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,26,2),限制性核酸内切酶的类型及特性,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：,型,型*,型,27,第一类（,I,型）限制性内切酶,:,能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割,DNA,分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序,没有专一性,，是随机的。这类限制性内切酶在,DNA,重组技术或基因工程中用处不大。,28,第二类,(II,型,),限制性内切酶,:,能,识别专一,的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类,RE,的识别和切割的核苷酸都是专一的,因此,是,DNA,重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是,4,个或,6,个核苷酸，少数也有识别,5,个、,7,个、,8,个、,9,个、,10,核苷酸的。,II,型,RE,的识别顺序是回文对称顺序。酶的切割可有两种结果：平头末端、粘性末端。,29,第三类（,III,型）限制性内切酶,:,也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。,30,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,Eco,R I is from,Escherichia coli,.,3,）限制性核酸内切酶的命名法,31,同裂酶：,有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如,Hpa,和,Msp,的识别顺序都是,5GCG_G3,，如果其中有,5-,甲基胞嘧啶，则只有,Hpa,能够切割,。这些有相同切点的酶称为,同裂酶（同切酶或异源同工酶）,。,4,） 同裂酶和同尾酶：,32,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,33,同尾酶,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生,相同的粘性末端,，称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,34,可以通过,DNA,连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个,新的酶切位点,。如,Xba,1,、,Nhe,1,以及,Spe,1,切割的,DNA,序列不同，但均给出相同的“,CTAG”,粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的,4,核苷酸的酶切位点，即,Bfa,1,的酶切位点。,35,5),影响核酸限制性内切酶活性的因素,(1) DNA,的纯度；,(2) DNA,的甲基化程度；,(3),酶切消化反应的温度；,(4) DNA,的分子结构；,(5),溶液中离子浓度及种类；,(6),缓冲液的,pH,值。,36,Hin,d III 1ul,Bam,H I 1ul,10X Buffer 2 ul,Plasmid DNA 6-8 ul,ddH,2,O 10-8 ul,*,缓冲液随不同的酶而不同。,置于,37,水浴酶切,1-2hr,（,7h,）。,质粒,DNA,的酶切（自提质粒）,实验步骤：,37,DNA,酶切片段的,非变性,PAGE,鉴定,凝胶的配制：,10 ml,30, 凝胶储存液,2.67 ml,5TBE,缓冲液（,pH8.8,）,2.0 ml,ddH,2,O 5.3 ml,10,AP 70,l,10,TEMED 60,l,38,加样：酶切后的质粒,DNA,溶液，加入,1/5,倍体积的,6,上样缓冲液。上样于点样孔。,电泳：,90-100 V,染色：,0.5 ug/ml EB,步骤,39,分子生物学课题设计,1,、,思考题：,核酸凝胶电泳种类选择的依据。,2,、分子医学的内容包括疾病基因的发现与克隆，生物制药、基因诊断与治疗等方面，就你感兴趣的方面设计一实验技术线路图。,40,