细胞生物学常用技术1课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,细胞生物学常用实验技术,1,.,1.,cellular level,Subcellular level,Molecular level,2,.,cellular level2.,3,.,3.,显微技术,细胞分离技术,细胞培养技术,细胞组分的分级分离,细胞示踪技术,细胞分子生物学技术,4,.,显微技术4.,一、,显微镜技术,microscopy,m,微米,= 10,-6,m,nm,纳米,= 10,-9,m,埃,= 10,-10,m,(,一,),光学显微镜技术,利用光线照明,将微小,物体形成放大影像的,仪器,5,.,一、显微镜技术 microscopy5.,1.,显微镜的分辨率,显微镜或人眼在,25cm,的明视距离处,能分辨,被检物体微细结构最小间隔的能力。,d =,光学显微镜的分辨极限,0.2m,0.61 ,n sin,6,.,1.显微镜的分辨率0.61 n sin 6.,100m,0.2,m,7,.,100m 0.2m 7.,2.,光镜标本切片的制备,(1),固定,定义：,将组织浸入化学试剂中，通过在细,胞中大分子间形成交联，保持细胞,中原有结构的形态和位置的过程。,固定的目的：,A,防止组织自溶或腐败,B,保持细胞原有的形态,C,保持细胞各种成分的原有位置,常用固定剂：,乙醇、甲醛、戊二醛,8,.,2.光镜标本切片的制备8.,(2),脱水,定义：,借助某些化学溶剂置换组织内水分的过程。,常用的脱水剂：,酒精,(3),包埋,定义：,将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。,常用的包埋剂：,液体石蜡、树脂,(4),切片,1-10 m,9,.,(2)脱水9.,（,5,）染色,采用某些化学物质特异性或选择性地与细,胞内的某些成分相互作用，从而原位显示,细胞某种成分或结构的方法,A,选择性染色,考马斯亮蓝,蛋白质,Brachet,反应,10,.,（5）染色10.,hematoxylin-eosin,11,.,hematoxylin-eosin11.,B,特异性染色,酶,+,底物,抗原,+,抗体,+,substrate,antigen,antibody,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,酶标记,：,免疫组织化学技术,荧光标记,：,免疫荧光技术,12,.,B 特异性染色+ substrateantig,3.,荧光显微镜技术,(1),原理,荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波,长的短波光线，并发射出比原来吸收波长,更长的光,可见光,紫外光,红外光,short,long,13,.,3.荧光显微镜技术可见光紫外光红外光shortlong 1,（,2,）荧光显微镜的基本构造,A,紫外光光源,B,二向色镜：反射短波光线，透过长波光线,C,滤光片,14,.,（2）荧光显微镜的基本构造14.,（,3,）常用的荧光染料,A,有机染料,荧光素,罗丹明,FITC,15,.,（3）常用的荧光染料15.,B,量子点,quantum dot,-,族、,-,族元素,构成的半导体纳米结晶,良好的光学稳定性,抗光漂白性,16,.,B 量子点 quantum dot16.,17,.,17.,18,.,18.,（,4,）应用,A,免疫荧光显微技术,（,Immunofluorescence microscopy,）,抗体,+,荧光染料,19,.,（4）应用 19.,20,.,20.,21,.,21.,B,绿色荧光蛋白,GFP,22,.,B 绿色荧光蛋白 GFP 22.,23,.,23.,4.,相差显微镜,（,phase contrast microscope,）,(1),原理,波长,颜色,振幅,亮度,速度,相位,24,.,4.相差显微镜 （phase contrast micros,(2),应用,活体细胞观察,25,.,(2)应用 25.,5.,激光扫描共焦显微镜,（,Laser,Scanning,Confocal Microscope,）,(1),原理,在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，,共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。,单色激光光源,光源后照明针孔点光源,检测器前探测针孔,分层扫描 三维重建,共扼,26,.,5.激光扫描共焦显微镜单色激光光源共扼26.,27,.,27.,（,2,）,应用,A,细胞的三维重建,B,细胞定量荧光检测,DNA RNA,蛋白质含量,C,细胞内,Ca,2+,pH,动态检测,D,细胞间通讯,28,.,（2）应用 28.,果蝇胚胎原肠胚,29,.,果蝇胚胎原肠胚29.,30,.,30.,31,.,31.,32,.,32.,（二）电子显微镜技术,利用电子与固体样品作用时所发出的信息,对样品进行微区观察和分析的技术,亚显微结构,超微结构,1.,电子显微镜的特点,高分辨率,理论上,d = 0.002 nm,实际上,d = 0.1 nm,生物标本,d = 2 nm,高放大倍率,1,000,000,33,.,（二）电子显微镜技术33.,阴极,阳极,聚光镜（电磁透镜）,物镜,中间镜,投影镜,电镜照片,照相底片,真空、上下颠倒,2.,透射电子显微镜,（,Transmission electron microscope, TEM,）,(1),基本构造,34,.,阴极阳极聚光镜（电磁透镜）物镜电镜照片照相底片真空、上下颠倒,(2),超薄切片的制备,A,固定,戊二醛,:,蛋白质,锇酸,:,C=C,(,膜结构,),35,.,(2) 超薄切片的制备35.,B,脱水,上升梯度,乙醇：,30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%,C,包埋,单体树脂加温聚合,D,切片,500,700,E,重金属染色,U,(,醋酸双氧铀,),Pb,(,柠檬酸铅,),36,.,B 脱水 上升梯度 E 重金属染色 U(醋酸双,37,.,37.,NADP,酶反应,嗜锇反应,TPP,酶反应,38,.,NADP酶反应嗜锇反应TPP酶反应38.,2.,扫描电子显微镜,（,Scanning electron microscopy, SEM,）,39,.,2.扫描电子显微镜39.,(1),原理,二次电子,(2),分辨率,3-10nm,(3),样品的制备,A,固定,B,脱水,C,干燥 临界点干燥,D,染色,Au Pt,40,.,(1)原理 二次电子40.,41,.,41.,42,.,42.,透射电镜,利用穿透标本的电子进行成像,(,散射,),观察组织的二维切片,扫描电镜,利用标本表面发射的二次电子成像,观察组织的表面三维结构,43,.,透射电镜43.,（三）扫描探针显微镜,（,Scanning probe microscope, SPM,）,1.,扫描隧道显微镜,使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。,分辨率高,可在非真空状态下工作,直接观察大分子的三维结构,44,.,（三）扫描探针显微镜44.,2.,原子力显微镜,通过分析探针针尖与样品之间的,原子间作用力,来获取所观察表面的微观信息。,样品无需具有导电性,可在三态下工作,活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测,45,.,2.原子力显微镜45.,二、细胞分离技术,（,cell separation,）,从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法,1.,制备单一细胞悬液,组织,单一细胞,消化,EDTA,细胞间连接,胰酶 细胞外基质,46,.,二、细胞分离技术 （ cell separation）消化,二、细胞分离技术,（,cell separation,）,从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法,1.,制备单一细胞悬液,组织,单一细胞,消化,EDTA,细胞间连接,胰酶 细胞外基质,47,.,二、细胞分离技术 （ cell separation）消化,2.,分离不同类型细胞,(1),离心,（,centrifugation,）,大小 密度 形状,小 轻 不规则,大 重 圆形,48,.,2.分离不同类型细胞48.,(2),免疫磁珠法,利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来,。,Fe,2,O,3,或,Fe,3,O,4,颗粒,+,单克隆抗体,免疫磁珠,49,.,(2) 免疫磁珠法利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞的特异结,50,.,50.,(3),流式细胞仪,( flow cytometry),能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或,化学特性的技术,A,原理,:,抗原,+,抗体*,荧光标记,B,样品制备,细胞悬液制备,细胞固定,细胞染色,51,.,(3) 流式细胞仪 ( flow cytometry)51,52,.,52.,53,.,53.,B,应用,* 细胞分选,cell in 1000,5000 cells/sec,*,细胞大小测量,*,DNA,含量测定,* 免疫表型分析,* 细胞功能分析,* 细胞凋亡研究,54,.,B 应用54.,细胞周期分析,55,.,细胞周期分析55.,药物处理前后,HT29,细胞的流式细胞分析结果,G0/G1 60.86%,S 29.14%,G2 10.00%,G0/G1 37.68%,S 37.56%,G2 24.76%,A,B,56,.,药物处理前后HT29细胞的流式细胞分析结果,57,.,57.,ND-1-,QD605,标记不同大肠癌细胞的流式细胞定量分析,58,.,ND-1-QD605标记不同大肠癌细胞的流式细胞定量分析,(4),激光捕获显微切割技术,（,Laser capture microdissection,，,LCM,）,从组织切片中精确分离获取单一细胞的方法,59,.,(4) 激光捕获显微切割技术59.,工作原理及过程,:,A,制备组织切片,B,镜下将组织切片覆以薄膜,C,激光束切割特定细胞或区域,D,收集管收集,60,.,工作原理及过程:60.,61,.,61.,62,.,62.,三、细胞培养技术,（,Cell culture,）,从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的,条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以,至增殖的方法,in vitro,用培养细胞做实验,in vivo,用动物做实验,63,.,三、细胞培养技术 （Cell culture）63.,1.,细胞培养的条件,(1),固体表面：培养瓶、培养皿,(2),培养基,常见培养基：,1640 DMEM,64,.,1.细胞培养的条件64.,(3),无菌,无菌操作：超净工作台、火焰消毒等,培养液中加入抗菌素,器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）,(4),其他,温度,37,湿度,100%,CO,2,浓度,5%,65,.,(3)无菌65.,2.,细胞培养的传代,原代培养,:,直接取材于有机体的细胞培养,取材 切割 消化 培养,传代培养,:,将原代培养存活的细胞从培养瓶中,取出，以,1:2,以上的比例扩大培养,原代培养,传代培养,(,保持分化特性,),传代,66,.,2.细胞培养的传代传代66.,67,.,67.,3.,细胞系,（,Cell line,）,在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁,殖能力，能够无限传代的细胞群。,变异细胞,细胞系,HeLa,人宫颈癌上皮细胞,3T3,小鼠成纤维细胞,无限繁殖,68,.,3.细胞系（Cell line）无限繁殖68.,相差显微镜观察培养中的,HeLa,细胞,69,.,相差显微镜观察培养中的HeLa细胞69.,4.,细胞融合,（,Cell fusion,）,（,1,）定义,在自然或人工条件下，使二个或二个以上,细胞合并形成一个细胞的过程。,异核体,杂交细胞,分裂,70,.,4.细胞融合（Cell fusion） 异核体杂交细胞分裂7,（,2,）促融方法,生物学方法：仙台病毒,化学方法：,PEG,物理方法：电脉冲打孔仪,（,3,）应用,A,细胞核和细胞质,间的相互作用,B,膜蛋白的流动性,71,.,（2）促融方法71.,C,基因定位,D,单克隆抗体制备,B,淋巴细胞,肿瘤细胞,Mouse cell,Human cell,division,72,.,C 基因定位Mouse cellHuman celldivi,73,.,73.,74,.,74.,E,细胞周期相关因子的发现,75,.,E 细胞周期相关因子的发现75.,四、细胞组分的分级分离,通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的,化学性质和功能进行研究的方法。,匀浆,分级分离,分析,76,.,四、细胞组分的分级分离76.,匀浆液,膜,细胞器,大分子,低渗,超声,去污剂,强制过滤,研磨,细胞,破坏,77,.,匀浆液膜低渗 细胞破坏77.,（一）离心法,用于分离细胞器和大分子,配平,低温,78,.,（一）离心法 配平78.,1.,差速离心法,分离对象,:,不同大小和形状的组分,（细胞核、细胞器）,具体方法,:,由,低速到高速逐级沉降,(repeat),79,.,79.,80,.,80.,2.,速度沉降法,分离对象,:,不同大小、形状的组分,(,沉降系数,S),比差速离心方法更精细,具体方法,:,在离心管中予装,5%-20%,蔗糖梯度的离心介质,81,.,2.速度沉降法81.,3.,平衡沉降法,分离对象,:,密度不同的组分（,与大小、形状无关,）,具体方法,：在离心管中予装一定密度梯度的离,心介质（,20%-70%,蔗糖、,CsCl,）,通常采用超速离心,82,.,3.平衡沉降法82.,（二）层析法（柱层析）,主要用于分离、纯化蛋白质,填充柱,填料（固定相）,流动相,83,.,（二）层析法（柱层析） 填充柱83.,1.,离子交换层析,层析介质,:,阴离子或阳离子树脂,分离原理,:,电荷,84,.,1.离子交换层析84.,2.,凝胶过滤层析,层析介质,:,凝胶,分离原理,:,分子大小,85,.,85.,3.,亲和层析,层析介质,:,基质,+,抗体,底物,分离原理,:,亲和性,86,.,86.,87,.,87.,4.,高压液相层析,HPLC,基质粒度小,（,3-10,m,）、,分辨率高、,分离速度快,88,.,4.高压液相层析 HPLC 88.,(,三,),电泳法,主要用于分离蛋白质、核酸,1.,琼脂糖凝胶电泳,分离对象,:,核酸,支持介质,:,琼脂糖,凝固点,40-45,不同浓度凝胶具有不同孔径,电泳缓冲液,:TAETBE,染料,:,溴化乙锭,EB,89,.,(三)电泳法89.,(,三,),电泳法,主要用于分离蛋白质、核酸,1.,琼脂糖凝胶电泳,分离对象,:,核酸,支持介质,:,琼脂糖,凝固点,40-45,不同浓度凝胶具有不同孔径,电泳缓冲液,:TAETBE,染料,:,溴化乙锭,EB,90,.,(三)电泳法90.,91,.,91.,2.SDS-PAGE,分离对象,:,蛋白质,(,蛋白质分子量、亚单位组成,),样品处理,:,SDS,阴离子表面活性剂,-,巯基乙醇 还原剂,大小,电荷,形状,支持介质,:,丙稀酰胺,甲叉双丙稀酰胺,染色,:,考马斯亮蓝,银染,特异性蛋白,(,western blotting,),92,.,2.SDS-PAGE92.,93,.,93.,SDS-PAGE,94,.,SDS-PAGE94.,3.,双向电泳,根据蛋白质分子量、等电点分离,等电聚焦,:,等电点,SDS,:,分子量,95,.,3.双向电泳 95.,96,.,96.,4.Western,印迹技术,将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸,纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定,蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗,或生物素标记二抗反应,最终以发色底物显色而,被检测,.,基本步骤,: (1)SDS-PAGE,(2),转膜,(3),抗体反应 一抗孵育,标记二抗孵育,(4),显色,97,.,4.Western 印迹技术97.,98,.,98.,western blotting,99,.,western blotting99.,