第八章-细胞凋亡与肿瘤课件

,细胞凋亡与肿瘤,Apoptosis and Tumor,第 八 章,长海医院病理科 何妙侠,细胞凋亡与肿瘤 Apoptosis and Tumor,学 习 要 求,1 掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区别,2 掌握细胞凋亡的基因调控机制及其与肿瘤,发生的关系,3 了解细胞凋亡的常用检测方法及其特点,学 习 要 求 1 掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区,前 言,对细胞死亡的认 识,前 言对细胞死亡的认 识,Nature Reviews,Molecular cell biology.,2001; 2: 545,Nature Reviews, Molecular cel,P C D Apoptosis,1858年，Virchow开始研究细胞死亡,1951年, Glucksman提出程序化细胞死亡,(Programmed Cell Death, PCD),1972年, Kerr提出细胞凋亡,（Cell Apoptosis）,P C D Apoptosis1858年，Virchow,Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston,2002年英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，,因在,细胞凋亡,研究工作中取得的杰出成就,获诺贝尔生理与医学奖,Sydney Brenner H. Robert,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,主 讲 内 容,细胞凋亡特点,细胞凋亡检测,发生调控机制,细胞凋亡与肿瘤,主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测发生调控机制细胞,主 讲 内 容,细胞凋亡检测,发生调控机制,细胞凋亡与肿瘤,细胞凋亡特点,主 讲 内 容细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤细,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,细胞凋亡特点 概念意义,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程,细胞凋亡特点 概念意义细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理,(dropping off , falling off),(dropping off , falling off),细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,细胞凋亡是高度有序的基因控制的一系列活性酶参与的过程，是多细胞动物生命现象的重要属性,细胞凋亡特点 概念意义细胞凋亡是高度有序的基因控制的一系列活,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,细胞凋亡与胚胎发生发展、个体形成、器官的细胞平衡稳定等有密切的关系,细胞凋亡特点 概念意义细胞凋亡与胚胎发生发展、个体形成、器官,蝌蚪尾,消失,发育过程,手足成形过程,脊椎动物,神经系统发育,蝌蚪尾发育过程脊椎动物,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,近年来研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的异常密切相关；细胞凋亡受抑作为细胞增殖紊乱的对应面在肿瘤发生发展和转归方面均有重要作用,。,细胞凋亡特点 概念意义近年来研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,该“死”的细胞不死，如自身免疫性疾病，恶性肿瘤等,不该死的细胞死了，可能与老年性痴呆、帕金森症等有关,细胞凋亡特点 概念意义该“死”的细胞不死，如自身免疫性疾病，,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,细胞凋亡与衰老密切相关,细胞凋亡对维持机体的遗传稳定性起着重要的作用,细胞凋亡特点 概念意义细胞凋亡与衰老密切相关,老 化,老 化,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,程序性死亡,是功能上的概念，而,细胞凋亡,是形态学上的概念，不是所有的程序性死亡都表现为凋亡，即不一定存在凋亡的形态学改变,细胞凋亡特点 概念意义程序性死亡是功能上的概念，而细胞凋亡是,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,凋亡细胞形成多个大小不等有膜包裹的,凋亡小体（apoptotic bodies）,内含形态保存完好的细胞器和/或浓缩的细胞核碎片，后期被吞噬细胞清除,细胞凋亡特点 概念意义凋亡细胞形成多个大小不等有膜包裹的 凋,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,1 受基因调控，死亡过程具有程序性，需要某些基因的启动并合成新的RNA和蛋白质,细胞凋亡特点 概念意义1 受基因调控，死亡过程具有程序性，,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,2 形态学上表现为细胞皱缩、染色质沿核膜聚集、胞体胞核裂解包裹形成凋亡小体,细胞凋亡特点 概念意义2 形态学上表现为细胞皱缩、染色质沿,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,3 常单个存在于组织中,4 周围组织无炎症反应,细胞凋亡特点 概念意义3 常单个存在于组织中,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,5 DNA片段化：琼脂凝胶电泳可见特殊的阶梯状由不同倍数的l80200bp核苷酸组成DNA梯带图,6,合成一些大分子物质,细胞凋亡特点 概念意义5 DNA片段化：琼脂凝胶电泳可见特,细胞凋亡特点,概念意义,形态变化,基本特征,与坏死区别,细胞凋亡特点 概念意义,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,细胞凋亡与细胞坏死的区别,特 点,细胞凋亡,细胞坏死,发生原因,形态特征,受累范围,细胞膜,细胞体积,染色质,细胞核,细胞器,凋亡小体,周围组织,生化特征,调控,DNA降解,蛋白质合成,对ATP要求,生理性或病理性,多为单个或散在细胞,仍保持完整,固缩变小,聚集在核膜下，呈半月形,先固缩后降解,仍保持完整,有，被临近细胞或巨噬细胞吞噬,无炎症反应,整个过程受基因调控主动进行,有规则，电泳呈梯状DNA谱带,有,必需,病理性,多为连续大片组织细胞,完整性破坏,肿胀增大,分散凝集，呈絮状,溶解,肿胀，内质网明显崩解,无，后期细胞破裂溶解，残屑被巨噬细胞吞噬,有炎症反应,整个过程均被动进行,无规则，电泳多呈弥散状,无,无需,细胞凋亡与细胞坏死的区别 特 点,主 讲 内 容,细胞凋亡特点,凋亡调控机制,细胞凋亡与肿瘤,细胞凋亡检测,主 讲 内 容细胞凋亡特点凋亡调控机制细胞凋亡与肿瘤细,细胞凋亡检测,形态学观察,细胞膜完整性,DNA断裂,凋亡定量检测,凋亡定位检测,细胞凋亡检测 形态学观察,细胞凋亡检测,形态学观察,细胞膜完整性,DNA断裂,凋亡定量检测,凋亡定位检测,细胞凋亡检测 形态学观察,1 光学显微镜观察,优点：光镜,技术简单、快速，能短时间内,进行大样本分析,缺点：样本制备复杂、耗时,形态计数常受到主观因素干扰,重复性差,细胞形态学的检测,1 光学显微镜观察细胞形态学的检测,2 电子显微镜观察,优点：,可显示凋亡细胞的许多形态学特点,尤其是膜结构和细胞器的变化,主要用于获取细胞凋亡的定性资料,缺点：样本制备复杂、耗时,细胞形态学的检测,2 电子显微镜观察细胞形态学的检测,细胞凋亡检测,形态学观察,细胞膜完整性,DNA断裂,凋亡定量检测,凋亡定位检测,细胞凋亡检测 形态学观察,1 台盼兰（Trypan blue）染色法,台盼兰为细胞膜非通透性活性染料，坏死细胞着色，而活细胞与早期凋亡细胞不着色,意义：,方法简单、便捷；,常常用于细胞死亡的初步评估,细胞膜完整性的检测,1 台盼兰（Trypan blue）染色法细胞膜完整性的,2 丫啶橙（acridine orange, AO）和溴化乙啶,（ethidium bromide, EB）双染法,AO和EB都能结合DNA的荧光染料，可,分别产生兰色和橙色荧光，其中 AO能透过,完整的细胞膜，而 EB 则只能染色胞膜受损,的细胞,细胞膜完整性的检测,2 丫啶橙（acridine orange, AO）和溴化,AO/EB双染法意义,可用于荧光显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死细胞或继发性坏死细胞,较台盼兰染色精确、详细,细胞膜完整性的检测,AO/EB双染法意义细胞膜完整性的检测,细胞凋亡检测,形态学观察,细胞膜完整性,DNA断裂,凋亡定量检测,凋亡定位检测,细胞凋亡检测 形态学观察,琼脂糖电泳法,琼脂糖凝胶电泳中,细胞凋亡呈现具有特征性的“阶梯”,（DNA ladder）,样条带外观,坏死细胞则因DNA的随机降解却常出,现弥散样外观,DNA断裂的检测,琼脂糖电泳法DNA断裂的检测,J Clin Pathol: Mol Pathol,2000;,53,:5563,J Clin Pathol: Mol Pathol 2000,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,J Clin Pathol: Mol Pathol,2000;,53,:5563,J Clin Pathol: Mol Pathol 2000,琼脂糖电泳法,缺点：,目前已被更为敏感的同位素标记、,原位末端标记技术所替代,DNA断裂的检测,琼脂糖电泳法DNA断裂的检测,细胞凋亡检测,形态学观察,细胞膜完整性,DNA断裂,凋亡定量检测,凋亡定位检测,细胞凋亡检测 形态学观察,流式细胞仪检测（flow cytometry, FCM）,几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生化和分子特点都可利用FCM的单参数和/或多参数分析进行检测,优点：,单个细胞分散相中辨别凋亡细胞；,快速、准确；应用范围广,快速准确的定量分析,流式细胞仪检测（flow cytometry, FCM）快速,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,细胞凋亡检测,细胞膜完整性,形态变化,DNA断裂,凋亡定量检测,凋亡定位检测,细胞凋亡检测 细胞膜完整性,Annexin V检测技术,原理,：,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻是早期凋,亡细胞的重要形态特征之一，而依,赖Ca,2+,的磷脂结合蛋白Annexin V则,具有与PS高亲和结合特性，将其作,为检测细胞膜表面PS的敏感探针试,剂，用于凋亡细胞检测,敏感的定位检测,Annexin V检测技术敏感的定位检测,Annexin V检测技术,优点,：1,对凋亡细胞进行定性及定位检测,2,同时使用膜非通透性DNA染料如,PI等，就能从Annexin V染色细,胞中将凋亡和坏死细胞区别开,来：凋亡细胞(-)，坏死细胞(+),敏感的定位检测,Annexin V检测技术敏感的定位检测,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI,Apoptotic HeLa cells were stai,DNA检测技术,原理：根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中,单链的碱基缺失部分的基本原理，,应用同位素或非同位素（如生物,素，FITC等）标记的三磷酸核苷酸,（dNTP）形成新的DNA，以了解DNA,是否断裂和发生DNA断裂的细胞数量,原位末端标记检测,DNA检测技术原位末端标记检测,优点：,常用荧光素FITC标记物，故可以,通过FCM或荧光显微镜检测相应细,胞的携带荧光强度，进行快速定,性、定位、定量及大批量细胞悬液,或涂片的回顾性研究，是当前较流,行的一类细胞凋亡评判方法,原位末端标记检测,优点：常用荧光素FITC标记物，故可以 原位末端标记检测,标记方法,（1）DNA 聚合酶I或Klenow 大片段介导的原位缺口平移(in situ nick translation，,INST),（2）末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法,(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabeling,TUNEL),原位末端标记检测,标记方法原位末端标记检测,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,TUNEL法的优点,1 定性和定位：,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映凋亡细胞最典型的生物化学和形态特征,2 可用于多种来源标本：,如细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等,3 操作简单，灵敏度高：,直接标记步骤少，操作简便，且间接标记有信号放大的作用,原位末端标记检测,TUNEL法的优点原位末端标记检测,1 端粒酶检测：,90%的凋亡都具有端粒酶活性,2 mRNA水平检测：,通过检测fas, Bax-和 bcl-X基因的 mRNA表达水平可反映细胞凋亡的水平,3 细胞内氧化还原状态：,谷胱甘肽状态检测,4,细胞色素C定位检测：,细胞色素C存在于线粒体内外膜之间，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞质，结合Apaf-1 启动级联反应,5,线粒体膜电位变化：,线粒体膜电位耗散启动凋亡,其它凋亡检测方法,1 端粒酶检测：90%的凋亡都具有端粒酶活性其它凋亡检测方法,细胞凋亡检测方法小结,定性和定量,定 性：,琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电子显微镜和荧光显微镜）,定量或半定量：,流式细胞仪法、原位末端标记法、ELISA定量、琼脂糖凝胶电泳,区分凋亡与坏死,可区分：,琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（透射电子显微镜最可靠）、PI双染色法流式细胞仪检测,无法区分：,原位末端标记法、PI单染法流式细胞检测,细胞凋亡检测方法小结定性和定量区分凋亡与坏死,细胞凋亡检测方法小结,标本来源不同,组织：,主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳),培养细胞：,几乎所有方法,凋亡时期不同,早期：,细胞外膜磷脂酰丝氨酸的检测、细胞内氧化还原状态改变检测、细胞色素C定位检测、线粒体膜电位变化的检测,晚期：,原位末端标记法、琼脂糖凝胶电泳、端粒酶检测,细胞凋亡检测方法小结标本来源不同凋亡时期不同,主 讲 内 容,细胞凋亡特点,细胞凋亡检测,细胞凋亡与肿瘤,发生调控机制,主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测细胞凋亡与肿瘤发,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程,凋亡相关因素,凋亡调控机制,凋亡信号通路,凋亡调控基因,凋亡发生调控机制 凋亡发生过程,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程,凋亡相关因素,凋亡调控机制,凋亡信号通路,凋亡调控基因,凋亡发生调控机制 凋亡发生过程,诱导启动,信号传递,凋亡实施,吞噬搬运,各种凋亡诱导分子(细胞内/外),线粒体途径,(P53 bcl-2家族),死亡受体途径,(Fas-Fas配体),Caspase 8,Caspase 9,Caspase 3,细胞凋亡,诱导启动信号传递凋亡实施吞噬搬运各种凋亡诱导分子(细胞内/外,1,接受凋亡信号,2,凋亡调控分子间的相互作用,3,蛋白水解酶（Caspases）的活化,4,凋亡的级联反应,凋亡发生过程,1 接受凋亡信号凋亡发生过程,诱导期：,诱导期是由特定的凋亡诱导信号所,决定的,效应期：,活化的“中央处理器”（central,executioner）启动和“宣判”细胞迅,速进入降解期,降解期：,出现特征性形态学和生物化学改变,凋亡过程分期,诱导期：诱导期是由特定的凋亡诱导信号所 凋亡过程分期,凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等,从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子存在，以形成完整的反馈环路，使凋亡过程受到精确严密的调控,凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程,凋亡相关因素,凋亡调控机制,凋亡信号通路,凋亡调控基因,凋亡发生调控机制 凋亡发生过程,（一）诱导性因素,细胞凋亡是一个程序化的过程，正常情况下它并不“随意”启动，只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用时才会启动,凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者。在少数情况下细胞凋亡可自发产生，但多数是在诱导因素的作用下发生,凋亡相关因素,（一）诱导性因素 凋亡相关因素,1.激素和生长因子失衡,生理水平的激素和生长因子是细胞正常生长不可缺少的因素，一旦缺乏，细胞会发生凋亡；相反，某些激素或生长因子过多也可导致细胞凋亡，例如：强烈应激引起大量糖皮质激素分泌，后者诱导淋巴细胞凋亡，致使淋巴细胞数量减少,凋亡相关因素,1.激素和生长因子失衡 凋亡相关因素,2.理化因素,射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等，均可导致细胞凋亡。例如：电离辐射可产生大量氧自由基，使细胞处于氧化应激状态，DNA受损，引起细胞凋亡,凋亡相关因素,2.理化因素 凋亡相关因素,3. 免疫性因素,免疫细胞在生长、分化及执行防御、自稳、监视功能中，可释放某些分子导致免疫细胞本身或靶细胞的凋亡。例如：细胞毒T淋巴细胞（CTL）可分泌颗粒酶（granzyme），引起靶细胞发生凋亡,凋亡相关因素,3. 免疫性因素 凋亡相关因素,4.微生物学因素,细菌、病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡。例如：HIV感染时，可致大量CD4+ T淋巴细胞凋亡,凋亡相关因素,4.微生物学因素 凋亡相关因素,5. 其 他,如缺血与缺氧，神经递质（如谷氨酸、多巴胺），失去基质附着等因素都可引起细胞凋亡。在肿瘤治疗中，单克隆抗体、反义寡核苷酸、抗癌药物等均可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡相关因素,5. 其 他 凋亡相关因素,（二）抑制性因素,1.细胞因子 IL2、神经生长因子等,具有抑制凋亡的作用，当从细胞培养基中去除后，依赖细胞会发生凋亡；反之，如在培养体系中加入所需要的细胞因子，则可促进细胞内存活基因的表达，抑制细胞凋亡的发生,凋亡相关因素,（二）抑制性因素1.细胞因子 IL2、神经生长因子等凋亡,2. 某些激素 ACTH、睾丸酮、雌激素等,对防止靶细胞凋亡，维持正常存活必需,例如：,当腺垂体被摘除或功能低下时，肾上腺皮质细胞失去ACTH刺激，可发生细胞凋亡，引起肾上腺皮质萎缩,睾丸酮对前列腺细胞,雌激素对子宫平滑肌细胞,凋亡相关因素,2. 某些激素 ACTH、睾丸酮、雌激素等凋亡相关因素,3. 其 他,某些二价金属阳离子如Zn2+，药物如苯巴比妥，病毒如EB病毒，以及中性氨基酸等也具有抑制细胞凋亡的作用,凋亡相关因素,3. 其 他 凋亡相关因素,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程,凋亡相关因素,凋亡调控机制,凋亡信号通路,凋亡调控基因,凋亡发生调控机制 凋亡发生过程,细胞死亡基因,cell death gene,线虫的ced-3、ced-4,哺乳动物的白细胞介,素-1转化酶（ICE）,野生型p53/ner77,Fas/Apo-1,凋亡调控机制,细胞死亡抑制基因,线虫的ced-9,哺乳动物的bcl-2,对细胞凋亡的研究始于对 ced系列的研究,细胞死亡基因凋亡调控机制细胞死亡抑制基因 对细胞凋,线虫（celegans）, 研究细胞凋亡的理想模型,目前有关细胞凋亡机制研究的许多资料源于对这类无脊椎动物细胞的观察和研究，在其雌雄同体发育产生的1090个体细胞中，131个细胞是在特定的时空内以凋亡而终结,凋亡调控机制,线虫（celegans）凋亡调控机制,线虫Ced基因 和细胞凋亡,线虫最重要的凋亡活化基因ced3、ced4和凋亡抑制基因ced-9,细胞凋亡时，ced-3被活化，活化的ced-3能特异地降解底物，诱导凋亡细胞产生特征性的形态和生物化学变化,凋亡调控机制,线虫Ced基因 和细胞凋亡凋亡调控机制,线虫Ced基因 和细胞凋亡,Ced-4既能结合ced-3，也能与ced-9结合,在非凋亡细胞，ced-9以ced-4为中介与,ced-3结合成二聚体复合物，扣押ced-3,使其处于无活性酶原状态存在于细胞内,在凋亡诱导信号作用下，ced-9则自复合体,中解离，ced-3被活化，引导细胞凋亡,ced-3和ced-4受ced-9基因的负调控,凋亡调控机制,线虫Ced基因 和细胞凋亡凋亡调控机制,Caspases 和细胞凋亡,1993年，袁钧英等研究发现线虫细胞凋亡基因ced-3与哺乳动物细胞中的白细胞介素-1转化酶（interleukin-1 converting enzyme, ICE）存在功能和序列上的相似性，并与ced-3一样，ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞的凋亡,凋亡调控基因,Caspases 和细胞凋亡凋亡调控基因,Caspases 和细胞凋亡,随后，许多实验室又相继报道其他哺乳动物或人细胞中发现的14种具有参与细胞凋亡的不同的ICE/ced-3家族成员,1996年6月以后，国际学术界统一定名为,caspases,（cysteiny aspartate-specific proteinases即半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶的缩拼名称），并按发现的时间先后顺序，在caspase命名之后再以阿拉伯数字表示其家族成员,凋亡调控机制,Caspases 和细胞凋亡凋亡调控机制,Caspase家族主要成员,序号,原名,功能,底物特异性,Caspase-1,ICE,辅助促炎症,WEHD,Caspase-2,ICE-1,凋亡反应,DEXD,Caspase-3,CPP32,Yama,apopain,凋亡反应,DEXD,Caspase-4,ICErel-II,TX,ICE-2,辅助促炎症,WEHD,Caspase-5,ICErel-III,TY,辅助促炎症,WEHD,Caspase-6,Mch-3,凋亡反应,(I/L/V)EXD,Caspase-7,Mch3,ICE-LAP3,CMH-1,凋亡反应,DEXD,Caspase-8,MACH,FLICE,Mch5,凋亡反应,(I/L/V)EXD,Caspase-9,ICE-LAP6,Mch6,凋亡反应,(I/L/V)EXD,Caspase-10,Mch4,凋亡反应,Caspase-11,ICH3,Caspase-12,Caspase-13,ERICE,Caspase-14,MICE(Mini-ICE),Caspase家族主要成员 序号 原名,Caspases的结构,Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，其家族成员拥,有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性,Caspase都以酶原（30-50kd）形式表达，存在,于胞质中,Caspase酶原单链分子一般由四个结构域，,即末端多肽或前（原）结构域、大亚单,位、小亚单位和连接区,凋亡调控机制,Caspases的结构凋亡调控机制,Caspases的活性特点,Caspase具有严格的底物特异性，即异常,特异地剪切天冬氨酸残基后的肽腱,邻近剪切位点N端的四肽序列及其结构对,Caspase的有效酶解非常重要,各种Caspase识别的四肽序列明显不同，,可能是造成功能差别的重要基础,凋亡调控机制,Caspases的活性特点凋亡调控机制,Caspases的活性特点,Caspase分为、类，分别以四肽序 列WEHD、DEXD和（I/L/V）EXD为特异性底物，Caspase活性显示高度有效性,Caspase严格底物特异性和高度有效性有力地确保了细胞凋亡过程发生专一性的蛋白消化，即以一种和谐的方式选择性地剪切一组蛋白质，导致其功能的丧失或结构变化,凋亡调控机制,Caspases的活性特点 凋亡调控机制,Caspase的活化机制,根据作用不同Caspase分为两大类：,始动或上游（如Caspase2，810等）,效应或下游（如Caspase-3，6和7）,凋亡调控机制,Caspase的活化机制凋亡调控机制,Caspase的活化机制,在凋亡诱导信号的作用下，始动Caspase 通过结合特异辅助因子而活化，活化的始动Caspase进一步活化效应Caspase，进一步参与凋亡,降解期中，活化Caspase的“级联（或瀑布式）”模型体现在死亡受体介导的细胞凋亡信号途径中,凋亡调控机制,Caspase的活化机制凋亡调控机制,Caspase的作用底物,依据Caspase的作用底物将其分为两大类,分别以Ced-3和ICE为代表,ICE亚家族（Caspase-1,4,5）：,主要辅助促炎症反应,Ced-3亚家族（Caspase-2,3,610）：,主要参与细胞凋亡过程,近几年来，已发现有40多种Caspase底物,凋亡调控机制,ced-3/ICE基因,凋亡调控的中央处理器，起核心作用,Caspase的作用底物凋亡调控机制ced-3/ICE基因,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,Caspase通过下列机制参与凋亡过程,（1）灭活细胞凋亡抑制蛋白,（2）剪切细胞结构蛋白,（3）剪切细胞效应蛋白,Caspase,通过切断与周围细胞的联络，重组细胞骨架，关闭DNA复制和修复，破坏DNA和核结构，诱导凋亡小体的形成等,Caspase在细胞凋亡中的作用,凋亡调控机制,Caspase通过下列机制参与凋亡过程Caspase通过切断,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程,凋亡相关因素,凋亡调控机制,凋亡信号通路,凋亡调控基因,死亡受体通路,线粒体通路,凋亡发生调控机制 凋亡发生过程死亡受体通路,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,Mitochondria,Caspase-8,Caspase-3 / 6/ 7,Caspase-9,Extrinsic Pathway,Intrinsic Pathway,UV / Chemotherapy,FADD,Cyto c,Apoptosis,DISC,Fas-L,Caspase-10,Fas,Apoptosome,Apaf-1,MitochondriaCaspase-8Caspase-3,死亡受体（death receptor, DR）是指能够通过与其相应的死亡配体（DL）结合，传递细胞凋亡信号的细胞表面的跨膜蛋白，主要包括肿瘤坏死因子（TNF）受体家族,TNF,受体家族具有相似的、富含半胱氨酸的细胞外结构域，其胞浆区内包含由6080个氨基酸组成的死亡结构域（death domain,DD）,（一）死亡受体信号通路,死亡受体（death receptor, DR）是指能,死亡受体超家族包括：,TNFR、Fas（Apo-1或CD15）、DR3（Apo-3、TRAMP、LARD或WSL-1）、DR4（TRAIL-R1）、DRS（APD-2、TRAIL-R2、,KILLER）或DcR1（TRID）和TGF-,（一）死亡受体信号通路,死亡受体超家族包括：（一）死亡受体信号通路,死亡受体,与,细胞凋亡,死亡受体,（一）死亡受体信号通路,参与死亡受体信号转导的接头蛋白,（,死亡结构域蛋白death domain protein）,TRADD：,TNF受体相关死亡结构域蛋白,TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD细胞凋亡,FADD：,Fas相关死亡结构域蛋白,FasL+Fas（死亡结构域）+ FADD细胞凋亡,RIP：,受体相互作用蛋白,CRADD：,含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白,MADD：,活化MAP激酶的死亡结构域蛋白,（一）死亡受体信号通路参与死亡受体信号转导的接头蛋白,（一）死亡受体信号通路,FasL+Fas FADD,凋亡诱导复合物（DISC）,胞质中游离的caspase8聚集到复合物上,细胞足够caspase8 细胞caspase8浓度不够,死亡受体活化 切割Bid，tBid从胞质到线粒体,细胞凋亡 Cyto C 释放,线粒体PT孔或Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道,Bcl-2家族结构和能形成离子通道的一些毒素（如大肠杆菌毒素）插入膜结构中形成较大的通道,（一）死亡受体信号通路FasL+Fas FAD,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,（二）线粒体信号通路,凋亡刺激因素使线粒体内膜的跨膜电位降低，进而使线粒体通透性转换孔(permeability transition pore，PTP)开放和线粒体膜通透性增高，导致线粒体内的细胞色素C (cytochrome c，Cyto-C)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor， Apaf)等凋亡启动因子释放入胞浆,（二）线粒体信号通路 凋亡刺激因素使线粒体内膜的跨膜电,线粒体通透性转换孔,细胞凋亡期间尽管线粒体超微结构基本正常，但其功能已发生显著改变,线粒体通透性转换孔,细胞色素C(cytochrome c，Cyto-C),细胞色素C正常时位于线粒体膜间，为呼吸链的电子传递体,当凋亡刺激因素作用于线粒体后，可引起细胞色素C释放至胞浆，在dATP存在的情况下，与Apaf-1结合,暴露Apaf-1的CARD（caspase activation and recruitment domain ）基序，并与procaspase-9的CARD结合形成凋亡复合体（apoptosome）,导致procaspase-9激活,后者进一步激活caspase-3，6等，诱导凋亡,（二）线粒体信号通路,细胞色素C(cytochrome c，Cyto-C),凋亡复合体,凋亡复合体,2. AIF (apoptosis inducing factor),AIF是由X染色体上单拷贝基因编码的黄素蛋白，分子量57kd，先在胞浆中合成其前体，然后移位至线粒体，与FAD结合形成成熟的AIF,正常时位于线粒体膜间, 在各种凋亡诱导因子的作用下，AIF从线粒体释放至胞浆，然后进入细胞核，引起染色质浓缩靠边，DNA断裂成50kD的大片段等凋亡的特征性改变,（二）线粒体信号通路,2. AIF (apoptosis inducing fac,释放入胞浆的AIF通过促进线粒体释放细胞色素C而增强凋亡信号，并快速激活核酸内切酶,AIF对凋亡的诱导作用是非Caspase依赖性的,AIF本身无DNA酶的活性，作用于其它蛋白而引起大片段DNA，其作用的靶蛋白目前仍不清楚,（二）线粒体信号通路,释放入胞浆的AIF通过促进线粒体释放细胞色素C而增强,3,.凋亡蛋白酶的活化,凋亡蛋白酶是细胞凋亡的“执行者”，在细胞凋亡的发生发展中起着非常重要的作用,（二）线粒体信号通路,3.凋亡蛋白酶的活化 凋亡蛋白酶是细胞凋亡的“执,4. 内源性核酸内切酶与DNA片段化,细胞凋亡过程中执行染色质DNA切割任务的是内源性核酸内切酶,内源性核酸内切酶作用于DNA双链，形成高分子量的DNA片段或180-200bp整倍数的片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈“梯”状(ladder pattern)条带,（二）线粒体信号通路,4. 内源性核酸内切酶与DNA片段化 细胞凋亡过,内质网与细胞凋亡相联系表现在两个方面：,1 内质网对Ca2+的调控,2 内质网应激反应,内质网信号通路,Ca2+浓度,钙调节分子,抑凋亡蛋白Bcl2,caspase-12,内质网与细胞凋亡相联系表现在两个方面： 内质网信号通路Ca,凋亡发生调控机制,凋亡发生过程,凋亡相关因素,凋亡调控机制,凋亡信号通路,凋亡调控基因,凋亡发生调控机制 凋亡发生过程,凋亡调控基因包括：,bcl-2家族、p53,、C-myc、和Fas/Fas配基（Fas-L）系统等,凋亡调控基因,ced-3/ICE基因,凋亡调控的中央处理器，起核心作用,凋亡调控基因包括：凋亡调控基因 ced-3/ICE基因,1 Bcl-2家族,bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病（B cell lymphoma/leukemia-2, bcl-2）基因的缩写，最初从小鼠B细胞淋巴瘤中分离得到,bcl-2基因定位于18号染色体，含有3个外显子，但仅第二和第三个外显子具有编码功能,Bcl-2编码产物为由239个氨基酸组成，分子量为26KD的线粒体膜蛋白,凋亡调控基因,1 Bcl-2家族 凋亡调控基因,bcl-2在进化过程中高度保守，功能相对保守,bcl-2的主要功能是通过阻断细胞凋亡而促进细胞存活，是一类抗凋亡基因,bcl-2能够抑制许多因素（如射线、甾体激素、抗TCR/CD3单克隆抗体，各种化疗药和癌基因）介导的细胞凋亡,凋亡调控基因,bcl-2在进化过程中高度保守，功能相对保守凋亡调控基,与bcl-2具有同源性的基因构成了bcl-2基因家族,Bcl-2家族中bcl-X基因能编码两种不同的蛋白bcl-X,l,和bcl-X,s,，前者抑制神经细胞的凋亡，后者抑制bcl-2的作用而使胸腺细胞凋亡,bcl-2活性由bcl-2相关蛋白Bax来调节,凋亡调控基因,与bcl-2具有同源性的基因构成了bcl-2基因家族凋,Bax/bcl-2的比值，对决定细胞接受刺激信号存活与否具有关键作用,bcl-2过量表达，细胞存活，Bax过量表达，细胞死亡,bcl-2可以保护所有刺激启动的凋亡性细胞死亡，bcl-2是抑制细胞凋亡的最中心调控步骤,凋亡调控基因,Bax/bcl-2的比值，对决定细胞接受刺激信号存活与,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,第八章-细胞凋亡与肿瘤课件,2 p53,p53作为一种抑癌基因，其作用机制是多方面的，其中p53可以促进肿瘤细胞发生凋亡也是一个重要的调控机制,人的p53基因定位于17p13.1上，由11个外显子和10个内含子组成，编码的p53蛋白由393个氨基酸残基组成,凋亡调控基因,2 p53 凋亡调控基因,p53蛋白功能丧失后，则难以保证细胞染色体正常数目的维持，又不能通过细胞凋亡过程而消除不需要或损伤的细胞，以维持组织、器官的内环境稳定,p53蛋白使细胞暂时停滞于G1期, 促使细胞凋亡，在DNA损伤修复中起重要作用,凋亡调控基因,p53蛋白功能丧失后，则难以保证细胞染色体正常数目的维,3 Fas/Fas-L,Fas又称APO-1或CD95，属于肿瘤坏死因子（TNF）/神经生长因子（NGF）受体超家族,Fas基因定位于人10号染色体长臂及小鼠第19号染色体上，由9个外显子和8个内含子组成,凋亡调控基因,3 Fas/Fas-L凋亡调控基因,Fas与TNF-R1胞浆区有68个氨基酸序列高度保守。这一区域被认为是传递凋亡信号所必需的，称为死亡区域（death domain）,Fas作为一种膜受体可向细胞内传递凋亡信号导致细胞凋亡,凋亡调控基因,Fas与TNF-R1胞浆区有68个氨基酸序列高度保守,4 C-myc,C-myc是早期应答基因，具有促细胞增殖和促细胞凋亡的双功能，c-myc诱导细胞凋亡需要同时缺乏生长因子。也就是说，只要环境中有足够的生长因子存在，即使c-myc表达，细胞仍呈增殖状态，只有生长因子缺乏且同时存在myc蛋白时，才会出现细胞凋亡,凋亡调控基因,4 C-myc 凋亡调控基因,主 讲 内 容,细胞凋亡特点,细胞凋亡检测,发生调控机制,细胞凋亡与肿瘤,主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测发生调控机制细胞,细胞凋亡与肿瘤,凋亡与肿瘤发生,凋亡与肿瘤相关基因,凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生,细胞凋亡与肿瘤,凋亡与肿瘤发生,凋亡与肿瘤相关基因,凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生,随着研究工作的不断深入，越来越多的资料显示与细胞恶性增殖和分化受阻一样，细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上占有重要地位,细胞凋亡与肿瘤发生,随着研究工作的不断深入，越来越多的资料显示与细胞恶性,实验性肝癌发病的始动促进进展三个时期都涉及有细胞凋亡的异常,膀胱癌和结肠癌的多阶段实验模型中也可查见类似变化,细胞凋亡与肿瘤发生,实验性肝癌发病的始动促进进展三个时期都涉及有细胞凋,细胞凋亡与肿瘤发生的关系密切，机制可能有：1 基因水平上诱导凋亡基因如P53、bax、C-myc等 的失活以及抑制凋亡基因(如bcl-2)的过度表达2 机体免疫反应诱导肿瘤细胞凋亡的功能不全3 宿主因子，如细胞粘附分子、肿瘤生长因子等抑 制肿瘤细胞的凋亡4 前癌细胞凋亡机制不全5 细胞凋亡与肿瘤的转移可能也有关系，如基底细 胞癌极少转移可能与肿瘤细胞凋亡明显有关,细胞凋亡与肿瘤发生,细胞凋亡与肿瘤发生的关系密切，机制可能有：1 基因水平,在恶性肿瘤的发病过程中，细胞凋亡异常的发生机制几乎涉及到细胞凋亡信号途径的所有方面，其中，研究最为深入和活跃的是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的异常,细胞凋亡与肿瘤发生,在恶性肿瘤的发病过程中，细胞凋亡异常的发生机制,HBV编码的HBx蛋白和病毒相关的肝癌发生和凋亡受阻密切相关HBx蛋白是Caspase的强效抑制物，合成HBx蛋白的鼠成纤维细胞和肝癌细胞能够耐受各种凋亡诱导剂,细胞凋亡与肿瘤发生,HBV编码的HBx蛋白和病毒相关的肝癌发生和凋亡受阻密,在造血系统恶性肿瘤的发病学上，染色体改变尤其是染色体的易位占有重要地位，这种易位可能导致异常融合蛋白的表达，其中一些就具有抑制细胞凋亡的作用,细胞凋亡与肿瘤发生,在造血系统恶性肿瘤的发病学上，染色体改变尤其是染色体的,Bcl-abl蛋白，它是多数慢性髓细胞白血病（CML）和某些急性淋巴细胞性白血病（ALL）中形成的肿瘤融合蛋白，这种融合蛋白的存在和形成增多，可明显降低肿瘤细胞的凋亡速率和提高肿瘤细胞对某些化疗药物或蛋白合成抑制剂的耐受性，促进肿瘤细胞的迅速增生,细胞凋亡与肿瘤发生,Bcl-abl蛋白，它是多数慢性髓细胞白血病（CML）,细胞凋亡与肿瘤,凋亡与肿瘤发生,凋亡与肿瘤相关基因,凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生,与凋亡和肿瘤相关的基因包括：,1 P53基因,2 Fas基因,3 bcL-2基因家族,凋亡与肿瘤相关基因,与凋亡和肿瘤相关的基因包括：凋亡与肿瘤相关基因,1 P53基因：,P53基因具有肿瘤抑制作用 ：,野生型P53基因能使细胞周期停止在G1期，抑制细胞繁殖，从而抑制细胞的生长和诱导细胞的凋亡，发挥肿瘤抑制的功能,突变型P53基因无此功能，结果抑制了细胞凋亡导致多种肿瘤的发生,凋亡与肿瘤相关基因,1 P53基因：凋亡与肿瘤相关基因,2 bcl-2基因：,bcL-2基因家族是细胞凋亡的重要调节者，按功能分为促凋亡蛋白家族的Bax、bcL-2、bad、bah；和抗凋亡蛋白家族的bcL-2、bcL-xL、ced-9等。bcL-2位于凋亡活动的中心，是细胞凋亡的抑制剂，可保护肿瘤细胞免受各种诱导剂诱发的凋亡过程，乃至肿瘤的形成,凋亡与肿瘤相关基因,2 bcl-2基因：凋亡与肿瘤相关基因,2 Fas基因：,Fas主要存在于免疫细胞膜表面，FasL表达于活化的T淋巴细胞,FasFasL是一种细胞凋亡信号转导途径，调节机体的免疫功能，当T淋巴细胞被激活后可表达Fas及FasL，引起细胞凋亡,凋亡与肿瘤相关基因,2 Fas基因：凋亡与肿瘤相关基因,细胞凋亡与肿瘤,凋亡与肿瘤发生,凋亡与肿瘤相关基因,凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与肿瘤 凋亡与肿瘤发生,细胞凋亡与放射治疗,放疗引起的凋亡率与肿瘤自发的基础凋亡率呈对应关系，即放疗越敏感的肿瘤，其基础凋亡率越大,通过多种手段使得促进凋亡的基因如Bax、Bak、Bid及Fas基因等表达，可以提高肿瘤的放射敏感性,凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与放射治疗 凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与化学治疗,临床使用的许多抗癌药均可在不同类型的敏感细胞中诱导细胞凋亡,化疗药主要通过P53，Bcl2和Fas等诱导肿瘤细胞凋亡，而化疗的副作用也是由于正常细胞凋亡所致,凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与化学治疗 凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与化学治疗,肿瘤细胞的抗凋亡是多药耐药的一个新机制。不同肿瘤细胞对化疗药物敏感性的差异，主要是因各种肿瘤细胞凋亡阈值的不同，肿瘤细胞对化疗耐药的实质是凋亡途径不能被活化,凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡与化学治疗 凋亡与肿瘤治疗,细胞毒淋巴细胞引起的凋亡,T细胞和NK细胞均可引起靶细胞凋亡,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤靶细胞有两种机制，包括凋亡和坏死; 当CTL与靶细胞接触时，一种方式是分泌穿孔素和细胞溶解素导致细胞溶解。另一种方式是CTL向靶细胞传递激活核酸内切酶信号，致DNA降解和细胞凋亡,凋亡与肿瘤治疗,细胞毒淋巴细胞引起的凋亡凋亡与肿瘤治疗,激素撤退或应用引起的细胞凋亡,凋亡与各种激素撤退后引起相应的激素依赖性器官的退化有关,如某些前列腺癌患者摘除睾丸，乳腺癌患者摘除卵巢，癌细胞因激素作用被取消而发生凋亡，肿瘤缩小退化,相反，部分肿瘤组织在激素水平增加后出现大量凋亡，如糖皮质激素引起的胸腺细胞恶性淋巴瘤及淋巴细胞白血病细胞的凋亡与死亡,凋亡与肿瘤治疗,激素撤退或应用引起的细胞凋亡凋亡与肿瘤治疗,细胞凋亡及其机制研究为攻克肿瘤展示了新思路,1 肿瘤发生不单是细胞的增殖分化增强，而且有细胞凋亡的减少,2 肿瘤治疗也可通过诱导肿瘤细胞凋亡达到,用相应单克隆抗体或反义RNA来阻断抑制肿瘤,凋亡的基因及其表达能达到治疗肿瘤的目的,4 减少正常组织和骨髓造血系统的细胞凋亡可以减少或预防放、化疗的毒副作用,展 望,细胞凋亡及其机制研究为攻克肿瘤展示了新思路展,细胞凋亡,是指在体内外因素诱导下，由基因严格调控而发生的自主性细胞有序死亡,细胞凋亡过程,诱导期,执行期,消亡期,小 结,细胞凋亡 是指在体内外因素诱导下，由基因严格调控,细胞凋亡形态学改变,包括细胞皱缩，胞膜空泡化；核染色质固缩，边聚、中聚和核残块；凋亡小体形成等凋亡小体形成后，可被邻近的巨噬细胞识别、吞噬、消化。整个凋亡过程无细胞内容物外漏，不伴有局部炎症反应,小 结,细胞凋亡形态学改变包括细胞皱缩，胞膜空泡化；核染色质固,细胞在激素、生长因子、理化因素、免疫性因素、微生物学因素等作用下，由死亡基因调控各种死亡信号转导通路，激活上游的起始caspases和下游的效应caspases以及相关酶类，使细胞发生特征性的生化和形态学改变：,线粒体中的凋亡启动因子（Cyto-C，AIF，Apaf等）释放入胞浆,DNA片段化（形成180-200bp或其整倍数的片段），琼脂糖凝胶电泳中呈“梯”状条带,小 结,细胞在激素、生长因子、理化因素、免疫性因素、微生物学因,细胞凋亡调控异常,可导致多种疾病发生：,1 细胞凋亡不足：,易发生肿瘤、自身免疫疾病,2 细胞凋亡过度：,与心力衰竭、心肌缺血与缺,血-再灌注损伤、神经元退行性疾病、,移植排斥等有关,小 结,细胞凋亡调控异常可导致多种疾病发生：小 结,1 细胞凋亡和细胞坏死的概念、区别以及生理、病理意义,2 细胞凋亡过程中的主要形态学和生物化学变化 3 Caspase家族的功能和在凋亡中的生物学意义 4 凋亡相关调控基因在细胞凋亡过程中的作用,5 死亡受体通路及线粒体通路在细胞凋亡过程中的作用及其联系,复 习 思 考 题,1 细胞凋亡和细胞坏死的概念、区别以及生理、病理意义,