第十章-发光免疫技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第十章,化学发光免疫,分析技术,第十章 化学发光免疫 分析技术,发光免疫分析,:,是将发光分析和免疫反,应相结合而建立起来的一种新的检测,微量抗原或抗体的新型标记免疫分析,技术。,发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种,第一节,概,述,第一节 概 述,发光,:,是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态,（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回,到基态，并释放光子的过程。,根据形成激发态分子的能量来源不同可分为,:,光照发光、生物发光、,化学发光,等。,发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能,光照发光（,photoluminescence,）,是指发光,剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子,吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，,发射出较长波长的可见光（荧光）。,生物发光（,bioluminescence,）,是指发生在生物,体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为,萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用,ATP,能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时,多余的能量以光子的形式释放出来。,光照发光（photoluminescence）是指发,化学发光（,chemiluminescence,）,是指伴随化学反,应过程所产生的光的发射现象。某些物质,(,发光剂,),在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，,使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃,迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发,射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。,一、化学发光,化学发光（chemiluminescence）是指伴随化,一些化学反应能释放足够,的能量把参加反应的物质激,发到能发射光的电子激发态，,若被激发的是一个反应产物,分子，则这种反应过程叫直,接化学发光。反应过程可简单地描述如下：,A,十,B C*,C* C,h,其中为光子，,C*,表示,C,处于单线激发态。,一些化学反应能释放足够 的能量把参加反应的物质激 发到,若激发能传递到另一个未参加化学反应,的分子,D,上，使,D,分子激发到电子激发态，,D,分子从激发态回到基态时发光，这种过,程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：,A,十,B C,*,C,*,十,D C,十,D,*,D,*,D,十,h,若激发能传递到另一个未参加化学反应 的分子D上，使D分子激发,化学发光效率（,CL,）决定于生成激发态产物,分子的化学激发效率（,CE,）和激发态分子的发,射效率（,EM,）。化学发光反应的发光效率、光,辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质,的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性,的化学发光光谱和不同的化学发光效率。,二、化学发光效率,化学发光效率（CL）决定于生成激发态产物分子的化学,化学发光免疫分析目前分类,按发光剂不同分为,1.,发光酶免疫测定技术（,CLEIA,）,2.,化学发光免疫测定技术,(CLIA),3.,电化学发光免疫测定技术,(ECLIA),化学发光免疫分析目前分类 按发光剂不同分为 1.发光酶,第二节,化学发光剂和标记技术,第二节 化学发光剂和标记技术,在化学发光反应中参与能量转移并最终,以发射光子的形式释放能量的化合物，称为,化学发光剂或发光底物。,一、化学发光剂,在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式,能作为化学发光剂的条件：,发光的量子产率高；,它的物理,-,化学特性要与被标记或测定的,物质相匹配；,能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；,其化学发光常是氧化反应的结果；,在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。,能作为化学发光剂的条件： 发光的量子产率高； 它的物理-,直接化学发光剂,直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不,需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们,在化学结构上有产生发光的特有基团，可直,接标记抗原或抗体。,直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过,1.,吖啶酯,在碱性条件下被,H,2,O,2,氧化,时,发出波长为,470nm,的光，具有很高的发,光效率，其激发态产物,N-,甲基吖啶酮是,该发光反应体系的发光体。,1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发,2,三联吡啶钌,三联吡啶钌,RU(bpy)3,2+,是,电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（,TPA,）,在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化,反应。,三联吡啶钌,2三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电,电化学发光剂反应原理,电化学发光剂反应原理,酶促反应发光剂：,是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底,物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂,称为酶促反应发光剂。,1,鲁米诺及其衍生物,2,AMPPD, 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂,1,鲁米诺,鲁米诺发光原理,1鲁米诺 鲁米诺发光原理,鲁米诺增强发光反应原理,鲁米诺增强发光反应原理,2,AMPPD,3-(2,-,螺旋金刚烷,)-4-,甲氧基,-4-(3,“,-,磷酰氧基,),苯,-1,2-,二氧杂环丁烷,2AMPPD 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-,1.,碳二亚胺（,EDC,）缩合法,二、发光剂的标记技术,C-O,1. 碳二亚胺（EDC）缩合法 二、发光剂的标记技术 C-,2.,过碘酸钠氧化法,2. 过碘酸钠氧化法,3,重氮盐偶联法,3重氮盐偶联法,4. N-,羟基琥珀酰亚胺活化法,4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法,1,发光剂的选择,2,被标记蛋白质的性质,3,标记方法的选择,4,原料比,5,标记率,6,温度,7,纯化与保存,影响标记的因素,1发光剂的选择 2被标记蛋白质的性质 3标,第三节,化学发光免疫分析的类型,第三节 化学发光免疫分析的类型,用吖啶酯直接标记抗体,(,抗原,),，与待测标本中相应的抗,原,(,抗体,),发生免疫反应后，形成固相包被抗体,-,待测抗原,-,吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（,H,2,O,2,）和,NaOH,使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、,发光,。,由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生,的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从,标准曲线上计算出待测抗原的含量。,一、直接化学发光免疫分析,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原,发光,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯,标记物抗,体,冲洗后,-,夹心法,（,1,）,加入,H,2,O,2,（,pH10,）,直接化学发光的机理,发光 磁微粒 被测抗原 + 抗体 + 带丫啶酯标记物抗体 冲,磁微粒模式图,Y,特点,?,抗原和抗体结合与未结,合部分的易分离,磁微粒技术,磁微粒模式图 Y 特点 ?抗原和抗体结合与未结合部分的易分离,化学发光酶免疫分析（,chemiluminescence enzyme,immunoassay,，,CLEIA,）是用参与催化某一化学发光反应的酶,如辣根过氧化物酶（,HRP,）或碱性磷酸酶,(ALP),来标记抗原或抗,体，在与待测标本中相应的抗原,(,抗体,),发生免疫反应后，形成,固相包被抗体,-,待测抗原,-,酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入,底物,(,发光剂,),，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接,收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们,传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,二、化学发光酶免疫分析,化学发光酶免疫分析（chemiluminescence,该分析系统采用辣根过氧化物酶（,HRP,）标,记抗体,(,或抗原,),，在与反应体系中的待测标,本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包,被抗体,-,待测抗原,-,酶（,HRP,）标记抗体复合,物，这时加入鲁米诺发光剂、,H,2,O,2,和化学发,光增强剂使产生化学发光。,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,该分析系统以碱性磷酸酶,标记抗体,(,或抗原,),，,在与反应体系中的待测标本和固相载体发生,免疫反应后，形成固相包被抗体,-,待测抗原,-,酶,标记抗体复合物，这时加入,AMPPD,发光剂，,碱性磷酸酶使,AMPPD,脱去磷酸根基团而发光。,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析,该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,分析步骤,分配样品,磁颗粒,和试剂,孵育,使反应物,结合,在磁场中,清洗去除,未结合物质,加入,底物,产生,信号,孵育,促使信号,的产生,信号,检测,分析步骤 分配样品, 磁颗粒 和试剂 孵育 使反应物 结合,电化学发光免疫分析,（,electrochemiluminescence immunoassay,，,ECLIA,）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记,抗体,(,抗原,),，以三丙胺,(TPA),为电子供体，,在电场中因电子转移而发生特异性化学发光,反应，它包括电化学和化学发光两个过程。,三、电化学发光免疫分析,电化学发光免疫分析（electrochemiluminesc,?,电化学指,?,在阳极表面,Ru(bpy),3,2+,和,TPA,同时失去,电子发生氧化反应。,a.,自由基,TPA,+,失去一个质子（,H,+,），成为,自由基,TPA,，这是一个强还原剂。,b.,TPA,将一个电子递给,Ru(bpy),3,3+,，而,TPA,被,氧化。,c.,激发态的,Ru(bpy),3,2+*,在衰减时发射一个波,长为,620nm,的光子。,化学发光包括,?电化学指 ?在阳极表面 Ru(bpy)3 2+ 和TP,电化学发光免疫分析示意图,电化学发光免疫分析示意图,磁性微粒直径,2.8,m,，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微,粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁,场中易于分离。,磁性微粒直径2.8m，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体,电化学发光免疫测定示意图,电化学发光免疫测定示意图,电化学发光免疫测定示意图,电化学发光免疫测定示意图,标记磁颗粒在电场中发光工作示意图,标记磁颗粒在电场中发光工作示意图,1.,激素：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质激素,2,标志物：肿瘤标志物、心脏标志物、病毒标记物,3,药物浓度监测,4,贫血因子,5,感染性疾病、过敏性疾病,7,糖尿病,胰岛素、血清,C-,肽、血浆胰高糖素等。,四、临床应用,1. 激素：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质激素,1,发光的分类,2.,常见的发光剂,3.,发光剂的标记方法,4.,电化学发光的原理,重点,1发光的分类 2.常见的发光剂 3.发光剂的标记方法 4.,