化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,可编辑,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,可编辑,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体,答辩人： 杨璐,导 师： 崔亚丽 教授,李如琳 副教授,化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体答辩人： 杨璐,Contents,1.,背景介绍,3.,全文总结,2.,实验部分,西北大学,Contents1. 背景介绍3. 全文总结2. 实验部分西,2,梅毒,梅毒螺旋体,严重性传播疾病,发病率不断上升,2010,年,4,月国家卫生部全国法定,传染病疫情报告：,全国乙类法定传染病发病第,位,梅毒检测,：,孕前检查,供血者血液常规筛选检查,西北大学,梅毒西北大学,3,医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法,快速血浆反应素环状卡片实验试验（,RPR,）和甲苯胺红试验(,TRUST),初筛 假阳性高 判断主观,梅毒螺旋体血球凝集试验（,TPHA,）,和,梅毒螺旋体明胶凝集试验（,TPPA,）,确认,判断主观 操作繁琐 要求严格,梅毒,ELISA,实验,灵敏度有待进一步提高,西北大学,医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法西北大学,4,化学发光免疫分析技术,免疫分析系统,化学发光分析系统,（抗原、抗体，免疫反应）,免疫分析高特异性,及,化学发光高灵敏度,于一体,（酶的化学发光底物或氧化剂）,梅毒螺旋体抗体化学发光法检测 灵敏度极高 自动化,西北大学,化学发光免疫分析技术免疫分析系统化学发光分析系统（抗原、抗体,5,化学发光技术,灵敏度极高,较宽线性范围,精密度高,容易实现自动化,广泛应用于医学、食品、分析化学等领域,西北大学,西北大学,6,化学发光法检测梅毒的商品化试剂盒,国外,：,Abbott,：,ARCHITECT Syphilis TP,磁粒,国内,：,北京科美东雅生物技术有限公司：梅毒螺旋体抗体化学发光试剂盒,酶标板,西北大学,化学发光法检测梅毒的商品化试剂盒西北大学,7,聚乙烯酶标板,板表面包被面积有限,反应空间有限,灵敏度受限,化学发光,固相载体的选择,磁性微粒,比表面积大,分散性好,易分离,灵敏度更高,西北大学,聚乙烯酶标板化学发光磁性微粒西北大学,8,金磁微粒化学发光检测方法,GoldMag-AS,微米金磁微粒,1.,生物分子固定化容量大,2.,超顺磁性，易分离,西北大学,金磁微粒化学发光检测方法GoldMag-AS微米金磁微粒1.,9,包被,反应,检测,实验原理,西北大学,包被反应检测实验原理西北大学,10,第一部分 方法的优化,1,HRP,标记抗原稀释液的确定,2,包被抗原最佳用量及酶标抗原最佳工作浓度的确定,3,样本稀释液的确定,4,保护剂的选择,西北大学,第一部分 方法的优化1HRP标记抗原稀释液的确定2包被抗原,11,HRP,标记抗原稀释液的确定,a PBST+20%,小牛血清,b PBST+0.1%BSA,c PBST+0.5%BSA,d PBST+1%BSA,e PBST+1.5%BSA,降低非特异性吸附 ：,加入非特异性蛋白与表面活性剂,阴性样本的发光值,西北大学,HRP标记抗原稀释液的确定a PBST+20%小牛血清降,12,包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定,抗原包,被量,(ng/,孔,),酶标,抗原稀释度,70,140,210,280,350,1:2000,P,N,660,27,1652,56,2954,60,3945,67,7336,67,1:3000,P,N,217,42,744,57,1735,50,2494,64,4947,60,1:4000,P,N,137,46,543,50,1538,50,1816,56,3171,54,1:5000,P,N,140,42,478,50,1181,42,554,34,2943,34,1:6000,P,N,121,42,319,38,657,42,494,34,2019,27,最佳抗原包被量,：,210ng/,孔；,最佳酶标抗原工作浓度,：,1,：,3000,西北大学,包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定701402102803,13,样本稀释液的确定,阳性血清,稀释倍数,检测结果,1PBS,生理盐水,PBS+0.1%BSA,正常人血清,1:25,+,+,+,+,1:50,+,+,+,+,1:100,+,+,+,+,1:200,+,+,+,+,1:400,+,+,+,+,1:800,+,+,+,+,1:1600,+,+,+,+,1:3200,+,+,+,+,1:6400,+ -,+ -,+,+,1:12800,-,-,+,+,1:25600,-,-,+ -,+ -,1:51200,-,-,-,-,最佳样本稀释液：,PBS+0.1%BSA,检测灵敏度与正常人血清相当,西北大学,样本稀释液的确定阳性血清检测结果1PBS生理盐水PBS+0,14,保护剂的选择,保护剂,X,对,HRP,标记抗原的保护作用良好,HRP,标记抗原置于,37,、放置,6,天,西北大学,保护剂的选择保护剂X对HRP标记抗原的保护作用良好HRP标记,15,保护剂,X,对包被抗原金磁微粒的保护作用,包被抗原金磁微粒置于,37,、放置,6,天,稳定性很好,西北大学,保护剂X对包被抗原金磁微粒的保护作用包被抗原金磁微粒置于37,16,保护剂,Proclin300,与保护剂,X,的对比实验,选定浓度为,0.05%,的,Proclin300,作为保护剂,西北大学,保护剂Proclin300与保护剂X的对比实验选定浓度为0.,17,保护剂,Proclin300,对,HRP,标记抗原的保护作用,含,0.05%Proclin300,的,HRP,标记抗原置于,37,、放置,6,天,西北大学,保护剂Proclin300对HRP标记抗原的保护作用含0.0,18,第一部分实验小结,在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳工作条件如下：,1. HRP,标记抗原稀释液：,PBST+1% BSA,作为,HRP,标记抗原稀释液；,2.,抗原包被量：,210 ng/,孔,(7 g/mg ),；,3.,酶标抗原稀释浓度：,1: 3000,时，发光强度达到最佳；,4.,血清样本稀释液：,PBS+0.1%BSA,；,5.,保护剂：浓度为,0.05%Proclin300,的,PBS,缓冲液。,西北大学,第一部分实验小结 在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体抗,19,4,参考值,6,对比实验,1,稳定性,3,标准曲线,2,5,精密度,特异性,第二部分 实验方法的评价,西北大学,4参考值6对比实验1稳定性3标准曲线25精密度特异性第二部分,20,稳定性,化学发光试剂分别置于,4,冰箱和,37,生化培养箱中放置,6,天,将阳性血清分别稀释,50,倍、,100,倍、,200,倍、,400,倍后进行检测,西北大学,稳定性化学发光试剂分别置于4冰箱和37生化培养箱中放置6,21,THANK YOU,SUCCESS,2024/8/25,22,可编辑,THANK YOUSUCCESS2023/9/122,精密度,国家标准,（,15%,）,批内差,：,2.86%,5%,次数,检测结果,阳性检测平均值,RSD,（,%,）,1,P,N,5423,15,5735,23,6249,15,6057,15,5747,15,5949,23,5860,5,2,P,N,5998,23,5923,23,6394,15,6125,15,5876,23,5972,15,6048,3.10,3,P,N,6074,15,6249,15,6302,23,6515,15,6156,15,6022,15,6219,2.86,4,P,N,6287,15,6166,23,6743,23,6534,15,5983,23,6012,23,6288,4.77,5,P,N,5923,23,5799,15,6401,15,6137,23,6117,15,6093,23,6078,3.38,西北大学,精密度国家标准（15%） 批内差：次数检测结果1P5423,23,批间差：,5.1%,9.7%,次数,检测结果,批次,1,批次,2,批次,3,阳性检测平均值,RSD,（,%,）,1,P,N,3895,15,3918,8,4829,15,4822,15,4487,8,4692,15,4441,9.7,2,P,N,4329,15,4052,8,4723,15,4810,15,4541,15,4752,8,4534,6.5,3,P,N,3987,8,4189,15,4428,8,4783,8,4431,15,4246,8,4344,6.2,4,P,N,3995,8,4096,8,4624,15,4742,8,4267,8,4368,15,4349,6.7,5,P,N,4016,15,3979,8,4572,15,4226,8,4146,15,4144,15,4181,5.1,西北大学,批间差：1P38953918482948224487 469,24,质控标准品,10,次重复测定结果,质控品：抗,-TP,标准物质（,2NCU/mL,）,相对标准偏差：,5.42%,西北大学,质控标准品10次重复测定结果质控品：抗-TP标准物质（2NC,25,标准曲线,将梅毒螺旋体抗体质控标准品（,4 NCU/mL,）梯度稀释，在,0.25,4 NCU/mL,范围内线性良好,Y = 599.1X-165.9,R,2,= 0.9980,西北大学,标准曲线将梅毒螺旋体抗体质控标准品（4 NCU/mL）梯度稀,26,参考值（临界值确定）,检测,100,例临床阴性血清样本,临界值：,P/N2.8,，计算得出该方法的临界值为：,COV=72.8,PX+3SD,，计算可得临界值为：,COV=47.6,P/N2.1,，计算可得临界值为：,COV=54.6,发光值,=54.6,西北大学,参考值（临界值确定）检测100例临床阴性血清样本临界值：发光,27,特异性,阴性符合率均为,100%,80,例临床血清样本,20,例乙肝阳性血清,样本（,TP,阴性）,20,例丙肝阳性血清,样本（,TP,阴性）,本次实验：,COV=N2.1=54.6,发光值,西北大学,特异性阴性符合率均为100% 80例临床血清样本本次实验,28,乙肝阳性样本检测结果,丙肝阳性样本检测结果,COV=54.6,COV=54.6,发光值,发光值,乙肝血清样本,丙肝血清样本,阴性符合率均为,100%,西北大学,乙肝阳性样本检测结果丙肝阳性样本检测结果COV=54.6CO,29,化学发光磁酶免疫分析法与,商品化化学发光试剂盒,对比,灵敏度比商品化化学发光试剂盒提高,4,倍,阳性血清,稀释倍数,检测结果,商品化试剂盒,化学发光磁酶免法,(MECLIA),1:100,+,+,1:200,+,+,1:400,+,+,1:800,+,+,1:1600,+,+,1:3200,+,+,1:6400,-,+,1:12800,-,+,1:25600,-,+ -,1:51200,-,-,西北大学,化学发光磁酶免疫分析法与商品化化学发光试剂盒对比灵敏度比商品,30,化学发光磁酶免法,（,COV=N2.1=53.2,）,商品化化学发光试剂盒,COV=N2.1=26151,）,特异性对比实验：,二者相当，阴性符合率均,100%,发光值,发光值,20,例阴性血清样本,20,阴性血清样本,COV=53.2,COV=26151,西北大学,化学发光磁酶免法商品化化学发光试剂盒特异性对比实验：,31,第二部分实验小结,国家法规,：,体外诊断试剂注册管理办法,分析性能评估资料：,分析灵敏度、分析特异性、检测范围,批内不精密度、批间不精密度等项目,参考值（参考范围）确定,稳定性研究资料,发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则,根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行检验，检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。,西北大学,第二部分实验小结国家法规：体外诊断试剂注册管理办法分析,32,稳定性：,4,，及,37,加速破坏性实验，均显示保存稳定性,良好,；,精密度： 批内差在,2.86,5%,，批间差在,5.1,9.7%,，对质控品重复,10,次检测，变异系数为,5.42%,，均达到国家标准（,15%,）,方法评价结果,西北大学,稳定性：4，及37加速破坏性实验，均显示保存稳定性良好；,33,标准曲线：在,0.25,4 NCU/mL,范围内线性范围良好,临界值：临界值为阴性对照血清均值的,2.1,倍,特异性：检测临床,TP,抗体阴性血清，,阴性符合率为,100%,，特异性良好,对比实验：灵敏度较商品化化学发光试剂盒提高,4,倍，特异性二者相当,西北大学,标准曲线：在0.25 4 NCU/mL范围内线性范围良好,34,稳定性,精密度,线性范围,参考值,特异性,对比实验,HRP,标记抗原稀释液,抗原包被量,酶标抗原稀释浓度,血清样本稀释液,保护剂,对方法进行比较全面的评价,方法的进一步优化,初步建立的化学发光磁酶免疫分析法,全文总结：,西北大学,稳定性 精密度HRP标记抗原稀释液对方法进行比较,35,试剂盒研制成功,中试放大,梅毒抗体临床科研血清盘,梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品,临床试验,西北大学,试剂盒研制成功中试放大梅毒抗体临床科研血清盘梅毒螺旋体抗体诊,36,主要生产工艺及反应体系研究资料,半成品试剂盒的检定,成品试剂盒的检定,Company Logo,主要生产工艺及反应体系研究资料Company Logo,37,包被抗原,酶标抗原,试剂盒阳性对照品、阴性对照品研制,主要原材料研究资料,Company Logo,主要原材料研究资料Company Logo,38,稳定性研究资料,批间稳定性,标准品稳定性检测,试剂盒成品稳定性检测,试剂盒开封稳定性,Company Logo,稳定性研究资料Company Logo,39,性能评估资料,试剂灵敏度的考察,试剂特异性的考察,试剂重复性的考察,试剂准确性的考察,与市售同类产品的比较,Company Logo,性能评估资料Company Logo,40,致 谢,感谢导师崔亚丽教授对我学业的悉心指导。,感谢陈超教授为我提供了一流的实验平台。,感谢李如琳副教授对我学业上的指导帮助。,感谢纳米材料组彭明丽副教授、所有同学及全体员工对我的无私帮助。,感谢国微中心全体成员对我工作的支持。,感谢我的父母一直对我的大力支持与关怀。,感谢各位评委老师。,西北大学,致 谢感谢导师崔亚丽教授对我学业的悉心指导。西北大学,41,Thank You !,Thank You !,经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量,Study Constantly, And You Will Know Everything. The More You Know, The More Powerful You Will Be,写在最后,经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量写,43,Thank You,在别人的演说中思考，在自己的故事里成长,Thinking In Other PeopleS Speeches,，,Growing Up In Your Own Story,讲师：,XXXXXX,XX,年,XX,月,XX,日,Thank You,44,