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,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,大肠杆菌高密度发酵,第二组,小组长：李青,小组成员：韩娇月、李洋、冯春红、胡建 贝、倪娜娜、常亚培、许志扬、李瑞兵、郭荣欣,大肠杆菌高密度发酵第二组,1,目录,大肠杆菌,高密度发酵,培养基选择,培养基配置,培养方式,培养条件,操作流程,具体步骤,参数控制,注意事项,目录大肠杆菌高密度发酵培养基选择培养基配置培养方式培养条件操,2,大肠杆菌,大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的,30%,以上,.,大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,由于具有遗传背景清楚,目的基因表达水平高,技术操作、培养条件简单,抗污染能力强,大规模发酵经济等优点,倍受遗传工程专家重视,是目前应用最广泛,最成功的表达体系,.,大肠杆菌 大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许,3,高密度培养技术,高密度培养技术：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。,高密度培养技术 高密度培养技术：是应用一,4,利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建的基因工程菌的表达产物,大肠杆菌的生物量,表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低,难以获得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发酵不但可获得较高的生物量,而且可显著提高目的基因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有较高的要求,而且对发酵条件也有非常高的要求。影响高密度发酵的因素非常多,如细菌生长所需的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的,pH,值、补料方式及发酵液流变学特性等。,利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建,5,大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。,预防措施：,1,、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。,2,、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。,3,、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。,大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产,6,培养基选择,LB,培养基,(,种子培养基,) :,胰蛋白胨,5g,酵母粉,2.5g,NaCl5g,溶于,500mlH2O,NaOH,调节,pH7.0, 2L,三角瓶装,灭菌锅湿热高压灭菌,121, 20min,室温保存,.,TB,培养基,(,发酵培养基,) :,胰蛋白胨,240g,酵母粉,480g,甘油,80g,消泡剂,1ml,溶于,H2O,定容至,19L,B. Braun,发酵罐在位灭菌,121, 15min.,培养基选择 LB培养基(种子培养基) :胰蛋,7,培养基配制,配制种子固体培养基,100mL,， 分装试管，,0.1MPa,灭菌,20min,，然后摆成斜面。,配制种子培养液,600mL,，分装,50mL,于一个,250mL,三角瓶中（作一级种子瓶），余下,550mL,平均分装于三个,500mL,三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌。,培养基配制配制种子固体培养基100mL ， 分装试管， 0.,8,培养方式,微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批,3,种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。,培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。,培养方式 微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分,9,培养条件,1,、温度：,3638 ,2,、,pH,：,7,3,、搅拌速率：,100200r/min,4,、溶氧,: 2050%,5,、通风：,23L/min,6,、接种量：,12%,培养条件1、温度：3638 ,10,操作步骤,1,、菌种准备,2,、上罐前的准备及实罐灭菌,3,、发酵操作,4,、发酵管理,5,、,发酵过程中各生化指标的测定,6,、补料,7,、放罐,8,、清洗,操作步骤1、菌种准备,11,菌种准备,1,、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜,面，,37,培养,24h,。,2,、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子,瓶，,37,振荡培养,12h,，然后转接二级,种子瓶，,37,振荡培养,10h,。,菌种准备1、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜,12,上罐前的准备及实罐灭菌,1,、洗净发酵罐及各联接胶管,2,、 配制发酵培养基,5.0L,，置发酵罐内，加入几滴泡敌。,3,、校正,pH,电极和溶氧（,DO,）电极。,4,、把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀,V2,、,W1,，使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀,V4,，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速,300r/min,，开启冷凝水出水阀,V1,，开启蒸气阀门,S1,，进行在位灭菌。,上罐前的准备及实罐灭菌1、洗净发酵罐及各联接胶管,13,发酵罐,发酵罐,14,上罐前的准备及实罐灭菌,5,、当保护罩顶部阀门,V4,有蒸气排出时，,2min,后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀,V4,适当排气，并调整蒸气阀,S1,维持罐温。保温结束后，关蒸气阀,S1,，全开冷凝水出水阀,V1,，开进水阀,W3,，将温度设定在,37,，切入自动。,6,、当温度降到,100,以下，缓缓开排气阀,V4,，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。,上罐前的准备及实罐灭菌5、当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，,15,上罐前的准备及实罐灭菌,7,、连接通气管路，将进气过滤器,K7,口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源， 对发酵罐进行通气， 调整空气流量,3,5L/min,。,8,、当温度达到,37,时，将预先灭菌的,pH,电极、,DO,电极（,75%,酒精消毒、,UV,消毒）接入发酵罐，连接各电极导线。,上罐前的准备及实罐灭菌7、连接通气管路，将进气过滤器K7口与,16,上罐前的准备及实罐灭菌,9,、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在,15%,，下限设为“,0”,，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。,10,、设定搅拌转速为,300r/min,、空气流量,2,3L/min,、,pH7.0,、,DO100%,，系统进入发酵状态。,上罐前的准备及实罐灭菌9、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过,17,发酵操作,,当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，进行如下操作：,1,、取样：松开弹簧夹,J2,，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧,J2,，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹,J3,，发酵液被压入接料瓶，开,J2,、,J3,排出取样管内残料，夹紧,J2,、,J3,2,、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌,OD,值。,发酵操作 当发酵罐内温度达到并维持在所需温度,18,发酵管理,控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及时排除。,每小时取一次样，每次取样50ml。取样时先将空气流量计旋钮调至01L/min，松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入量筒，当达到40mL，开J2排出取样管内残料，夹紧J3、J2。将样液入标记有取样时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样要及时清洗量筒。,每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。,发酵管理控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度,19,发酵过程中各生化指标的测定,发酵过程中，虽然能自动控制温度和,pH,两个重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作：,（,1,）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。,（,2,）每小时取样测定细菌光密度值，进行革兰氏染色及镜检，以了解菌生长情况及检查是否有杂菌污染。,（,3,）随着培养时间的延长，适当地调节进气量和搅拌转速，以维持一定的,DO,值。,发酵过程中各生化指标的测定 发酵过程中，,20,发酵过程中各生化指标的测定,（,4,）定时取样用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含量。测定步骤如下：,发酵液中糖含量小于,4,时，直接取发酵液,0.5 ml,于锥形瓶中，若糖含量大于,4,时，先稀释,10,倍后，取稀释液,0.5ml,于锥形瓶中。,向锥形瓶加入裴林试剂甲液和乙液各,5ml,，混匀，加热至沸腾。,用,0.1,标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖液的体积数（,V,）。,取,0.5 ml,蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗葡萄糖的体积数（,V0,）。,按下公式进行计算：,(V0-V)x0.1/0.5x,稀释倍数,V0,为葡萄糖滴定空白时消耗的毫升数。,V,为葡萄糖滴定样品时消耗的毫升数。,发酵过程中各生化指标的测定（4）定时取样用裴林快速定糖法测定,21,发酵过程中各生化指标的测定,（,5,）定时取样测定发酵液中氨基氮的含量，测定步骤如下：,取发酵液经,3500 r,min,离心,10min,。,分别吸取上清液,2.0 ml,于两个磨口具塞锥形瓶中，各加蒸馏水,5ml,。向另一磨口具塞锥形瓶中加入,7 ml,蒸馏水，作空白对照。,向上述,3,个瓶各加中性申醛溶液,5.0 ml,，混匀，加,0.5,溴麝香草酚兰液,2,滴和,0.5,酚酞液,4,滴。,用标准,0.100mol,L NaOH,溶液滴定至紫色，分别记录消耗的,NaOH,液毫升数。,按下式计算,: (V0-V)x1.4008,V,为滴定发酵液时消耗,NaOH,溶液的毫升数。,V0,为滴定空白时消耗,NaOH,溶液的毫升数。,1.4008,为,1ml 0.1mol,LNaOH,溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。,发酵过程中各生化指标的测定（5）定时取样测定发酵液中氨基氮的,22,发酵过程中各生化指标的测定,（,6,）测定,OD,值, 大肠杆菌标准曲线的绘制：取,10mL,离心管，与,105,烘,2h,至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上称重（,W0,），精确到小数后,4,位，然后准确取,10mL,发酵液，于,3000rpm,离心,10min,，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，与,100,烘至恒重，用镊子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（,W1,），精确至小数后,4,位，得细胞干重为,W1-W0,。取同一发酵液，稀释,2,、,5,、,10,、,20,、,50,倍，于,600nm,下测,OD,值。以,0D,值为纵坐标，菌液浓度（,g/L,）为横坐标，绘制标准曲线。, 均匀取样品,5mL,于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在,721,分光光度计上测定,A600,，根据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。, 其余发酵液于,3,，,2000r/min,条件下离心分离,8min,上清液装入编号三角瓶，用于测糖。,发酵过程中各生化指标的测定（6）测定OD值,23,发酵过程中各生化指标的测定,（,7,）当发酵到一定时候，光密度值达到,1,1.5,，发酵液中还原糖和氨基氮含量较低时，开始补料，并在发酵结束前一小时终止。,（,8,）每小时记录发酵过程温度、,pH,和,DO,的测定数值，并记录操作情况。,发酵过程中各生化指标的测定（7）当发酵到一定时候，光密度值达,24,大肠杆菌流加发酵策略,大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有,0.25,0.5 g/L,，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。,大肠杆菌流加发酵策略 大肠杆菌是迄今为止遗,25,补料方式,采用简单反馈控制补料，又称单一循环法，此法控制与营养物利用相偶联的,pH,或溶解氧浓度等参数,使之保持恒定。,例如,预先设定,pH,恒定值,发酵中菌体代谢产生酸性物质或铵,使,pH,值发生改变,从而启动控制开关,开始补料,pH,恢复至恒定值以溶解氧浓度作为补料开关则是根据培养基中某种关键营养物,(,主要是碳源,),消耗,会导致溶解氧浓度迅速改变。,补料方式 采用简单反馈控制补料，又称单一循,26,溶氧控制的分批补料培养,控制的几个关键参数如下：,1,、温度：培养温度为,37 ,。,2,、,pH,：自动流加,30%,的氨水，使,PH,保持 在,7.0,左右。,3,、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流加补料分三个阶段进行，发酵过程中,04h,不加补料，,410h,补加含,50g,葡萄糖的补料，,1020h,加入含,190g,葡萄糖的补料，诱导前,0.5h,追加,100ml,补料。,溶氧控制的分批补料培养控制的几个关键参数如下：,27,放罐,发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢，且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准备放罐。,放罐操作同取样。将全部发酵液取出后，100煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可排放入下水道。,放罐发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵液的PH不断上升,28,清洗,放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟，排水。,再次注入自来水清洗，操作如1。,清洗结束，关闭电源。,清洗放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动,29,注意事项,首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。,其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制,pH,值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。,第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在,0.2,之内。,注意事项,30,注意事项,第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，,pH,偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的,pH,，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比,。,注意事项第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌,31,谢谢观赏,谢谢观赏,32,
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