干细胞基础与临床应用基础研究ppt课件

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culture),方式：移植（,Transplantation,）,条件：异体相似环境,优点：最大限度模拟自然生长环境,目的：分化研究、临床治疗、特殊,目的,（如珍贵细胞株污染的处理）,5,学习交流,PPT,（一）基本概念 2体内培养(In vivo cultur,（二）基本条件,（模拟）,营养条件的模拟,水： 无机盐： 葡萄糖： 维生素：,氨基酸：,细胞因子,(Cytokine),：未知因素,理化条件的模拟,温度： 液体渗透压： 氧与酸碱度：,细胞之间的相互关系： 培养基的选择,6,学习交流,PPT,（二）基本条件（模拟）营养条件的模拟6学习交流PPT,一、水,细胞及机体内环境溶解或分散状态离子和,/,或分子的水溶液（化学基础）,水的重要性质：,惰性大多数物质溶于水而不发生化学反应。,热稳定性和导热性。,表面张力等等：表面张力是维持细胞形态的重要条件。,7,学习交流,PPT,一、水细胞及机体内环境溶解或分散状态离子和/或分子的水溶液,二、无机盐,存在形式：离子状态为主 结合,（蛋白质或脂质）,形成与维持培养液的晶体渗透压,对细胞功能活动的支持作用,细胞和组织类型不同，对无机盐的要求也不同,实验目的不同，对培养基中无机盐的要求也不同,实验步骤的目的不同，对培养基中无机盐的要求也不同,8,学习交流,PPT,二、无机盐存在形式：离子状态为主 结合（蛋白质或脂质）8,三、理化条件,1,温度：,35,37 ,细胞对低温耐受能力强过高温,1,、应该对实验有全过程的考虑,2,、高温的结果是一样的,3,、低温条件下细胞活动减缓至停止,4,、对低温的耐受能力与细胞类型、个体年龄等因素有关,5,、低温的危害与细胞内外冰晶形成的不均衡有关，故降温应该是缓慢的，避免冰晶形成；复温应该是快速的。,液体渗透压：正常血浆,280,310 mOsm/kg,；,（主要由晶体渗透压构成 胶体渗透压,1.5 mOsm/kg,）,酸碱度：,7.36,7.44,耐受范围,6.0,8.0,；,9,学习交流,PPT,三、理化条件 1温度：3537 细胞对低温耐受能力,三、理化条件,2,细胞之间的相互关系：,1,、从组织水平的认识 细胞是结构和功能的基本单位，而,组织是细胞的存在形式,。,2,、从细胞水平的认识,a.,直接接触型；膜表面分子结合,b.,直接联系型；胞间间隙连接,c.,间接联系型；生物因子传递,10,学习交流,PPT,三、理化条件 2细胞之间的相互关系：10学习交流PPT,三、理化条件,3,生长基质（,Ground substance,）：,大多数机体内的细胞不是生活在液态环境中的，体外培养环境下表现为贴壁、附壁生长，培养器皿的表面不适合细胞的这一特性，必需包被某些物质，以帮助细胞贴壁、附壁生长。,1,、多聚赖氨酸,(Polylysine) 0.05 mg/ml,2,、纤维连接蛋白,(Fibronectin),3,、胶原 （如 鼠尾胶）,4,、层粘连蛋白,(Laminin) 5,10g/ml,11,学习交流,PPT,三、理化条件 3生长基质（Ground substance,四、培养基的选择,1,一、基本概念,培养基,(Nutrient medium),：多指商品，固态或粉剂，未,经溶剂溶解的状态。,培养液,(Culture solution medium),：用溶剂溶解后的溶,液，一般添加有血清、抗生素、活性因子等等。,条件培养液,(Conditioned medium),：经过某些细胞培养，,含有特定的（已知或未知）细胞分泌物的培养液。,参考文献只能提供基本的参考，除重复性实验外，具体的实验方案应该从多个角度来综合考虑，必要时还应该做探索性实验。,12,学习交流,PPT,四、培养基的选择 1一、基本概念参考文献只能提供基本的参考,二、常用类型,天然培养基：血清、胚胎渗出液、水解蛋白,合成培养基：,RPMI1640,、,Eagle MEM,系列（,BME,、,DMEM,、,IMEM,、,MEM,）、,HamF12,。,无血清培养基：化学成分确定的培养基，对实验目的和细胞类型的针对性强。,1,、基础培养液：,DMEM HamF12 = 1 1,2,、附加成分： 根据实验目的、细胞类型等因素设定。如,B27,、,N-2,，针对神经元；,G-5,，针对神经胶质细胞,四、培养基的选择,2,13,学习交流,PPT,二、常用类型四、培养基的选择 213学习交流PPT,（三）基本步骤,取材 ：目的明确、取材准确、避免过多的损失和损伤。,分离,:,制作细胞悬液。,纯化： 提高目的细胞富集度。,原代培养：目的细胞在体外条件下的生长、扩增。,传代培养：进一步扩增、纯化。,鉴定：定质、定量。,冻存与复苏：保存,连续传代培养,14,学习交流,PPT,（三）基本步骤 取材 ：目的明确、取材准确、避免过多,一、取材,1,（一）、实验的目的：,直接影响实验各环节，如培养基的选择、培养时间的长短等等。,取材是整个实验的重要步骤之一，决定了后续实验步骤的效率。,15,学习交流,PPT,一、取材 1（一）、实验的目的： 取材是整个实验的重,一、取材,2,（二）、细胞及其所在组织的性质：,帮助确定分离的方法、消化酶的选择与使用等等。,（三）、操作流程的优化：,应该充分考虑保持细胞活力：操作时间短、细胞损失和损伤少。,16,学习交流,PPT,一、取材 2（二）、细胞及其所在组织的性质：16学习交流P,一、取材,3,细胞悬液,(Cell suspension),：,单个细胞存在于溶液（培养液、平衡液、缓冲液等）。,一般程序：,、解剖充分暴露、洗涤、剔除多余组,织。,、分割,1 mm,3,植块植块培养,、分离（散）细胞机械解离、酶消化、,鳌合剂解离。,、筛网过滤,、低速离心,500,800 r,m,5,10 min,800,1000 r,m,5,10 min,、计数、调节细胞密度,10,5,个,ml,17,学习交流,PPT,一、取材 3细胞悬液(Cell suspension)：1,二、分离与纯化,1,分离与纯化在概念上没有明确的区别，也不是一个单一的、独立的步骤，往往贯穿在整个细胞培养的过程之中。,分离与纯化是衡量细胞培养成功与否的重要标志；也是建立细胞系（细胞株）的前提。,1,、细胞分离（,Separation,）：从组织材料、细胞悬液中获取目的细胞。,2,、细胞纯化（,Purification,）：从异质性的混合物中获得单一类型细胞。,3,、富集（,Enrichment,）：分离纯化后，目的细胞数量所达到的比例。,18,学习交流,PPT,二、分离与纯化 1分离与纯化在概念上没有明确的区别，也不是,二、分离与纯化,2,（一）基本原理,1,、根据细胞的物理特性，如密度、电荷等。,2,、根据细胞的生物学特性，如贴壁紧密程度、贴壁快慢、特异性表面标志等。,3,、根据其它细胞特性,（二）基本方法,1,、机械分离与酶学分离,2,、基于物理性状的分离纯化技术、速度沉降法,3,、根据细胞表面电荷的分离方法,4,、利用细胞表面标志的分离方法,5,、根据其它细胞特性的分离方法,19,学习交流,PPT,二、分离与纯化 2（一）基本原理19学习交流PPT,机械分离与酶学分离,1,1,、取材过程中的分离,尽可能剔除其它结构、组织。,充分冲洗，必要时可考虑添加抗生素。,2,、筛网过滤,根据组织、细胞的类型，细胞大小来选择筛网的材,质、孔径大小,3,、酶学分离,对同一种组织，采用不同的酶消化，细胞富集的类,型也不同。,举例：对皮肤消化 胰蛋白酶 ？,胶原酶 ？,20,学习交流,PPT,机械分离与酶学分离11、取材过程中的分离20学习交流PPT,机械分离与酶学分离,2,4,、培养过程中的选择性,体外培养过程中的,自然法则,：,a,、富集多、活力强、增殖能力强的细胞类型会表现出,优势生长,。,b,、细胞集落可以出现,区域性分布,。,方法：,机械性刮除、选择性消化,目的： 清除 或 收集,21,学习交流,PPT,机械分离与酶学分离24、培养过程中的选择性21学习交流PPT,基于物理性状的分离纯化技术,1,优点：无需对细胞进行复杂的（化学、生物,学等）处理，避免了细胞发生变化，,对细胞的活力影响较少。,关键：,1,、密度梯度形成介质的选择。,2,、密度梯度的配置。,也称为密度梯度离心,（,Density gradient centrifugation,）,技术,沉降速度,=,离心力 细胞体积 细胞密度和介质密度差,/,介质黏度,22,学习交流,PPT,基于物理性状的分离纯化技术 1优点：无需对细胞进行复杂的（,介质选择的原则：,1,、密度范围大 包括所需要的密度。,2,、溶液的黏度低 较小离心力和较短离心,时间可达 到分离效果,3,、易于测定其密度（浓度）。,4,、不损伤细胞、不改变细胞生物学特性。,5,、离心分离后易于除去。,6,、不妨碍、不影响后续实验研究的目的。,基于物理性状的分离纯化技术,2,23,学习交流,PPT,介质选择的原则：基于物理性状的分离纯化技术 223学习交流,基于物理形状的分离纯化技术,3,常用介质,1,、血清白蛋白,早期常用，但黏度太高。,2,、聚蔗糖（,Polysucrose,）,即,Ficoll,，实验室常见，缺点是：黏度、渗透毒性随浓度增加而增加。使用时注意避免。,3,、泛影酸盐,常用的“淋巴细胞分离液（密度：,1.0770.001g/ml,）”,就是泛影酸盐和,Ficoll,配制而成，以避免,Ficoll,黏度、渗,透毒性随浓度增加而增加的缺点。,24,学习交流,PPT,基于物理形状的分离纯化技术 3常用介质1、血清白蛋白24,基于物理形状的分离纯化技术,4,常用介质,4,、硅胶颗粒,Percoll,（密度：,1.130.005g/ml,）,优点：（,1,）稳定性好。可长期保存。,（,2,）密度稀释范围大，包括了大多数细胞密度。,（,3,）溶液产生的渗透压小，全密度范围内维持,等张。,（,4,）黏度低，较小离心力和较短离心时间可达,到分离效果。,（,5,）易于洗涤清除，对细胞无毒性。,（,6,）高速离心时可形成连续密度剃度。,（,10000 r/min,）,（,7,）用量少，经济。,25,学习交流,PPT,基于物理形状的分离纯化技术 4常用介质4、硅胶颗粒 Pe,基于物理形状的分离纯化技术,5,常用方法,1,、一步密度梯度离心法,高密度介质、低速离心,依据细胞的密度和体积,:,密度大于介质的在介质之下；密度小于介质的在介质之上,体积大的沉降速度快；体积小的沉降速度慢。,注意：对不同物种的细胞，分离介质的密度稍有不同。,26,学习交流,PPT,基于物理形状的分离纯化技术 5常用方法1、一步密度梯度离,基于物理形状的分离纯化技术,6,常用方法,2,、等密度梯度离心法,依据细胞的密度,a,、连续密度梯度：,密度逐渐增高的介质体系,c =,m,时，沉降速度为零，细胞停留在密度相同的介质区带内。,b,、不连续密度梯度：,密度递减、顺序、分层分布介质体系， 时细胞停留在,m 1,c,m2,的界面上。,27,学习交流,PPT,基于物理形状的分离纯化技术 6常用方法2、等密度梯度离心,基于物理形状的分离纯化技术,7,常用方法,3,、速度沉降法 依据细胞的密度和体积，但以体积为主要因素。,a,、单位重力速度沉降法：,单位重力作用，低密度介质（,BSA + 0.01 mol/L PBS,，梯度：,1.0099,1.0123 g/ml,）,优点：细胞回收率高、重复性好、分离量大。,缺点：,时间太长（数个小时！），,细胞活力易,受影响。,b,、低速离心速度沉降法：,5%,20% Ficoll,，,100 g,，,25 min,的条件下。,28,学习交流,PPT,基于物理形状的分离纯化技术 7常用方法3、速度沉降法,根据其它细胞特性的分离方法,1,一、反复植块培养法,原理：,不同的细胞从植块中迁移出来的时间、速度不同。,优点：细胞在取材时受损伤少,缺点：纯化周期长，细胞纯度低，细胞产量低。,植块,雪旺细胞,成纤维细胞,成纤维细胞,第一周,第二周,第三周,29,学习交流,PPT,根据其它细胞特性的分离方法1一、反复植块培养法植块雪旺细胞成,根据其它细胞特性的分离方法,2,二、有丝分裂抑制剂法,原理：,有丝分裂后细胞（不再分裂增殖的细胞，如神经细胞）不受有丝分裂抑制剂的影响，可分裂细胞明显受其抑制 逐渐消亡。,常用抑制剂：,阿糖胞苷（,Ara-C,）、氟尿嘧啶（,FU,）,30,学习交流,PPT,根据其它细胞特性的分离方法2二、有丝分裂抑制剂法30学习交流,三、原代培养,1,原代培养的概念：,1,、是指“初次培养”的含义，没有培养物的分割。,2,、“代”只是,分割的记录与记数形式,，与细胞分裂增殖的“代”不同。,3,、植块培养也可以分割，故也可以进行传代培养,4,、,更换培养液、更换培养器皿，仍是原代培养,。,31,学习交流,PPT,三、原代培养 1原代培养的概念：31学习交流PPT,三、原代培养,2,基本目的：,1,、维持目的细胞在体外条件下生存一段时间,适应体外培养的新环境。,2,、更接近,原来的组织形式,，有利于目的细胞适应体外培养的新环境。,3,、使目的细胞在体外条件下稳定生长、扩增，,形成优势群体,。,32,学习交流,PPT,三、原代培养 2基本目的：32学习交流PPT,三、原代培养,3,植块培养,植块培养目的：,1,、观察组织生长行为及其规律。,2,、获得向外迁移的细胞（应该有相应的松解、离散措施）。,植块培养的优点：,保持了良好的,3D,组织结构、维持了细胞之间的相互作用，细胞易于成活和生长。,植块培养的缺陷：,植块中央的物质交换受局限。,适宜大小！,1mm,3,植块培养的关键：,1,、植块的贴壁、固定。,2,、培养液的添加。,3,、如果是为了获得细胞，要注意植块的,适时,移出。,33,学习交流,PPT,三、原代培养 3 植块培养植块培养目的：33学习交,三、原代培养,4,细胞培养,优点：能在特定条件下，获得,单一类型,的细,胞并进行相关的研究。,关键：使细胞尽快进入,分裂、增殖,的生长状态。,1,、促进细胞贴壁,2,、适宜的细胞接种密度。,10,5,个,/ml,是常用的标准，但还应该考虑细胞类型、生长能力、活力。,干细胞的培养会选择,更低密度？,34,学习交流,PPT,三、原代培养 4 细胞培养优点：能在特定条件下，获,三、原代培养,5,培养空间,3,、培养空间 构建适宜的,培养体系,：,培养体系由两大部分组成：液相和气相,调整培养空间的目的：保证细胞的供,O,2,量,相关参数：,（,1,）、液相气相,= 1 10,（体积）,（,2,）、液相高度：,2,5 mm,O,2,O,2,O,2,35,学习交流,PPT,三、原代培养 5 培养空间3、培养空间 构建适宜的培,四、传代培养,1,传代的目的：,1,、避免接触性抑制，保持细胞稳定地生长。,2,、进一步纯化细胞类型。,（,1,）不同的传代处理方式,（,2,）不同的处理强度,传代的指标：,1,、,体细胞,：集落占据,80%,90%,的瓶底面积。,2,、,干细胞,：根据目的细胞集落的生长状况，有必要时。,36,学习交流,PPT,四、传代培养 1传代的目的：36学习交流PPT,四、传代培养,2,传代的基本步骤：,1,、换液 一些技术手册要求传代前一天换液，主要,是改善细胞状态，增强适应能力。,2,、解离细胞 目的细胞的生物学特性决定解离细胞方法,酶消化法 机械震荡法,3,、再次接种,传代的关键：,1,、适当的时间,2,、适当的方法,3,、适当的细胞密度,37,学习交流,PPT,四、传代培养 2传代的基本步骤：37学习交流PPT,五、,“,二倍体细胞,”,的问题,细胞性状的稳定，是体外培养条件下，研究体内细胞生物学性状的前提。,问题：在较长时间和不适宜条件下的体外培养，由于细胞融合等已知和未知的原因，细胞的染色体倍数会发生变化，成为多倍体细胞。,营养条件,理化条件,生活环境,遗传物质基础,传代,38,学习交流,PPT,五、“二倍体细胞”的问题细胞性状的稳定，是体外培养条件下，研,六、体外培养细胞的生长与观察,1,在体外培养条件下，细胞的生长行为会有相应的变化，对其研究的目的是：,1,、了解细胞的生长行为的基本规律；,2,、区分质变与量变，判断目的细胞的价值和意义。,A,、 体外培养细胞的生长方式：,1,、黏附型,2,、悬浮型,39,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 1 在体外培养条件,六、体外培养细胞的生长与观察,2,黏附型细胞,黏附是体外培养条件下恢复“组织形式”的倾向,1,、细胞与细胞之间的接触,2,、细胞与细胞外基质结合,体内、体外的差异：体内是立体三维的结构；而体外只是二维的空间，大多数情况下只有一个附着面。故细胞的外形会有变化。,40,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 2黏附型细胞40学习交流PP,六、体外培养细胞的生长与观察,3,黏附型细胞的类型：,1,、上皮型细胞（上皮样细胞）：,细胞镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”；起源于内胚层、外胚层的细胞多呈此型。,41,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 3黏附型细胞的类型：41学习,六、体外培养细胞的生长与观察,4,2,、成纤维细胞（成纤维细胞样）：,细胞梭形、多角形、胞体铺展，细胞间隙较大，细胞排列疏松；细胞可呈放射状、螺旋状排列。起源于中胚层的细胞多成此型。,42,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 42、成纤维细胞（成纤维细胞样,六、体外培养细胞的生长与观察,5,3,、多形型细胞,细胞有较长的突起、胞体多角形，可分为胞体部和突起部，细胞间距大。,常见类型：神经组织细胞。,43,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 53、多形型细胞43学习交流P,六、体外培养细胞的生长与观察,6,4,、游走型细胞：,细胞分散、不易形成集落；,可有胞质突起，细胞变形、游走活跃。,见于单核吞噬细胞系统、肿瘤细胞。,44,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 64、游走型细胞：44学习交,六、体外培养细胞的生长与观察,7,铺展：,球形 原饼形,细胞铺展,极性细胞,铺展的程度与细胞,DNA,合成、细胞的生长有密切关系。,内质,外质,45,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 7铺展：球形 原饼,六、体外培养细胞的生长与观察,9,B,、每,一代细胞,的生长过程：,1,、潜伏期：,2,、指数生长期：,3,、停滞期：,1,2,3,接种,细胞数量,培养时间,46,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 9B、每一代细胞的生长过程：1,关于“隔天换液”的辨析：,细胞周期（,cell cycle),：,是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段,根据细胞的分裂能力可把它们分为三类：,增殖细胞群，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环；,不再增殖细胞群，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（,end cell,）；,暂不增殖细胞群，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于,G0,期，故又称,G0,期细胞。在某种刺激下，这些细胞,重新进入细胞周期,。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。,47,学习交流,PPT,关于“隔天换液”的辨析：根据细胞的分裂能力可把它们分为三类：,六、体外培养细胞的生长与观察,8,C,、,细胞系,的生长过程,1,、原代培养期,2,、传代培养期,3,、衰退期,1,2,3,接种,细胞数量,培养时间,转化,传代,老化,死亡,48,学习交流,PPT,六、体外培养细胞的生长与观察 8C、细胞系的生长过程123接,细胞株（系）的基本概念,1,细胞系：从原代培养经传代培养后得到的细胞群体（适应后的细胞群体）。,1,、可较长期的传代,2,、细胞类型不均一,3,、以某一种明确的细胞类型为主（主类,细胞）,49,学习交流,PPT,细胞株（系）的基本概念 1细胞系：从原代培养经传代培养后得,细胞株（系）的基本概念,2,细胞株：经由选择和,/,或克隆化培养技术，从细胞系中获得的，细胞类型较为单一的细胞群体。,1,、细胞的遗传、生化性质相同，,2,、细胞带有共同的特异性标记,以上两点，在后续培养过程中必须持续保持。如遗传形状发生变异，则形成“亚株”。,50,学习交流,PPT,细胞株（系）的基本概念 2细胞株：经由选择和/或克隆化培养,细胞株（系）的基本概念,3,有限细胞系（株）：体外仅能持续传若干代，多,为二倍体细胞。,连续细胞系（株）：体外具无限增殖能力，多为,异倍体细胞。,永生性（不死性）：保持接触抑制，无致瘤性。,恶性转化细胞系： 有致瘤性。,51,学习交流,PPT,细胞株（系）的基本概念 3有限细胞系（株）：体外仅能持续传,细胞克隆,概念：将单一细胞分离、单独培养，并使其生,长、增殖为一个新的细胞群体。,基本方法：,1,、稀释铺板法：,2,、饲养层克隆法：,3,、生长基质克隆法：,a,、胶原模板、血纤维蛋白模层板,b,、琼脂克隆法,c,、琼脂基底加甲基纤维素克隆法,52,学习交流,PPT,细胞克隆 概念：将单一细胞分离、单独培养，并使其生52学习交,细胞周期与细胞同步化,53,学习交流,PPT,细胞周期与细胞同步化53学习交流PPT,国内外细胞库,1,、,ATCC,（,American Type Culture Collection,）,：,http,：,/,2,、中国国家专利局 武汉大学生命科学院,3,、中国科学院上海细胞所,54,学习交流,PPT,国内外细胞库1、ATCC （American Type,