资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、实验目的,掌握间接血凝测定猪瘟抗体的方法,二、材料用具,猪瘟间接血凝抗原（猪瘟正向血凝诊断液）、阳性对照血清、阴性对照血清、稀释液、待检猪血清样品、,96,孔,110,微量血凝板 、微量移液器,10-100,微升 、玻璃板。,正向间接血凝检测猪瘟抗体水平,一、实验目的 正向间接血凝检测猪瘟抗体水平,三、反应原理,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应或被动凝集反应。以红细胞为载体的间接凝集反应叫间接血凝。,间接凝集反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测,正向间接凝集反应 用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。,反向间接凝集反应 用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。,三、反应原理将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载,四、操作方法,1,、,检测前，应将冻干诊断液每瓶加稀释液,5,毫升浸泡,7-10,天后方可应用。,2,、按常规方法采血制备血清并编号。,3,、将被检血清于,56,水浴灭活,30,分钟。,4,、稀释待检血清 用微量移液器向血凝板的第,1,孔,-6,孔各加稀释液,50ul,，吸待检血清,50ul,加入第,1,孔，混匀后从中取出,50ul,加入第,2,孔，依此类推直至第,6,孔混匀后弃去,50ul,，第,1,孔,-6,孔的血清稀释度依次为,1,：,2,，,1,：,4,，,1,：,8,，,1,：,16,，,1,：,32,和,1,：,64,。,四、操作方法1、检测前，应将冻干诊断液每瓶加稀释液5毫,5,、,稀释阴性血清（稀释,1,：,4,） 在血凝板上的第,11,排第,1,孔加稀释液,60ul,，取阴性血清,20ul,混匀，这样此孔阴性血清稀释度为,1,：,4,。,6,、稀释阳性血清（稀释,1,：,512),在,血凝板,上的第,12,排第,1,孔加稀释液,70ul,，第,2,孔,第,7,孔各加稀释液,50ul,，吸取阳性血清,10ul,，加入第,1,孔混匀并从中取出,50ul,加入第,2,孔,直到第,7,孔混匀并丢弃,50ul,。第,7,孔中的阳性血清稀释度则为,1,：,512,。,5、稀释阴性血清（稀释1：4） 在血凝板上的第11排第1,7,、加对照孔 取,1,：,4,稀释的阴性血清,50ul,加入第一排第,10,孔，取,1,：,512,稀释的阳性血清,50ul,加入第一排第,11,孔，取稀释液,50ul,加入第一排第,12,孔，分别作阴性、阳性和稀释液对照。,8,、加间接血凝抗原 在第,1,排,1,6,孔和对照孔各加血凝抗原,25ul.,9,、振荡 血凝板在振荡器上或用手轻拍摇动，使诊断液中的红细胞与血清混匀。,10,、盖上与血凝板相符的玻璃板，以防水分蒸发，在室温下（,10-36,）静置,2h,判断结果。,7、加对照孔 取1：4稀释的阴性血清50ul加入第一排,五、结果判断,1,、先检查对照孔是否合格 阴性血清对照和稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝集现象,(,),或呈阳性,(+),的轻度凝集为合格；阳性血清对照应呈,(+),凝集为合格。,2,、在以上,3,孔对照合格的情况下，观察待检血清各孔的凝集程度，以呈,“,+,”,凝集的待检血清最大稀释度为血凝效价,(,血凝价,),五、结果判断1、先检查对照孔是否合格 阴性血清对照和,“”表示不凝集，红细胞在中央沉积呈圆点。,“,+”,表示约有,25,的凝集，红细胞沉积在中央，周围有小点凝集。,“,+”,表示,50,凝集，红细胞呈薄层，面积小中心致密，边沿松散呈锯齿状,+,：血细胞凝集,布满孔底,边缘不整齐,有时卷曲成荷叶状。,出现“,+”,以上凝集者判为阳性。,“”表示不凝集，红细胞在中央沉积呈圆点。,六、临床应用,1,、间接血凝抗体滴度在,1,：,32-1,：,64,时，攻毒可获得,100%,保护，,1,：,16-1,：,32,时有,80%,保护，,1,：,8,时则完全不能保护。,2,、猪瘟间接血凝实验适用范围,（,1,）检测仔猪母源抗体水平,（,2,）猪瘟疫苗免疫猪群抗体水平的监测,（,3,）测定猪瘟抗体消长时间,六、临床应用1、间接血凝抗体滴度在1：32-1：64时，攻毒,七、注意事项,1,、污染严重或溶血严重的血清样品不宜检测。,2,、冻干血凝抗原，必须加稀释液浸泡,7,10,天，方可使用，否则易发生自凝现象。,3,、用过的血凝板，应及时冲洗干净，勿用毛刷或其它硬物刷洗板孔，以免影响孔内光洁度。,4,、使用血凝抗原时，必须充分摇匀，瓶底应无血球沉积。,七、注意事项,5,、液体血凝抗原,4-8,贮存，有效期三年。,6,、 如来不及判定结果或静置,2,小时结果不清晰，也可放置第二天判定。,7,、每次检测，要设阴性、阳性血清对照各,1,孔。,8,、吸取不同样品时，必须更换塑料枪头。,5、液体血凝抗原4-8贮存，有效期三年。,口蹄疫血清抗体检测,一、正向间接血凝试验,特点：简易、快速、特异性强，直观，是目前测抗体的使用方法,（一）实验材料,96,孔,110V,型反应板 玻璃板 微量移液器（,10-100,微升） 塑料咀 微量振荡器 口蹄疫各型正向间接血凝诊断液（,O,型、,A,型、,C,型、,Asia-1,型） 口蹄疫各型阳性血清 阴性血清 稀释液 待检血清,0.2-0.5ml,（,56,水浴灭活,30,分钟）。,口蹄疫血清抗体检测 一、正向间接血凝试验,（二）实验方法,1.,疫苗接种动物抗体水平检测 （基本同猪瘟间接血凝试验）,（,1,）检测样品前，应将冻干的血凝抗原，每瓶加稀释液,5ml,，摇匀后置,4,冰箱内静置,7-10,天。,（,2,）稀释待检血清 用微量移液器向血凝板的第一排第,1-8,孔各加稀释液,50ul,，吸待检血清,50ul,加入第,1,孔，混匀后从中取出,50ul,加入第,2,孔，依此类推直至第,8,孔混匀后弃去,50ul,，第,1-8,孔的血清稀释度依次为,1,：,2,，,1,：,4,，,1,：,8,，,1,：,16,，,1,：,32,，,1,：,64,，,1,：,128,，,1,：,256,。,（二）实验方法 1.疫苗接种动物抗体水平检测 （基本同猪瘟间,（,3,）稀释阴性对照血清（稀释,1,：,64,） 在血凝板上的第,11,排第,1,孔加稀释液,70ul,，第,2,4,孔各加稀释液,50ul,，取阴性血清,10ul,加入第一孔混匀，并从中取出,50ul,加入第,2,孔混匀后取出,50ul,加入第,3,孔混匀后取出,50ul,加入第,4,孔，这样第,4,孔中阴性血清稀释度为,1,：,64,。,（3）稀释阴性对照血清（稀释1：64） 在血凝板上的第1,（,4,）稀释阳性血清 在,血凝板,上的第,12,排第,1,孔加稀释液,70ul,，第,27,孔各加稀释液,50ul,。吸取阳性血清,10ul,，加入第,1,孔混匀并从中取出,50ul,加入第,2,孔,直到第,7,孔混匀，这样第,7,孔中阳性血清稀释度则为,1,：,512,。,（,5,） 滴加对照孔 取,1,：,64,稀释的阴性血清,50ul,加入第一排第,10,孔，取,1,：,512,稀释的阳性血清,50ul,加入第,11,孔，取稀释液,50ul,加入第,12,孔，分别作阴性、阳性和稀释液对照。,（4）稀释阳性血清 在血凝板上的第12排第1孔加稀释液70,（,6,）滴加正向血凝诊断液 将正向诊断液充分摇匀后，每孔各加,25ul,，置于振荡器上震荡,1,分钟。,（,7,）盖上与血凝板相符的玻璃板，以防水分蒸发，在室温下（,10-36,）静置,2h,。,（6）滴加正向血凝诊断液 将正向诊断液充分摇匀后，每孔各加,（,8,）判断结果,先检查对照孔是否合格 阴性血清对照孔，红细胞应全部沉入孔底或只有,25%,的凝集；阳性血清对照应呈,50%(+),以上凝集，证明该批诊断液的效价达,1,：,512,为合格。稀释液对照孔红细胞应全部沉入孔底或只有,25%,的凝集。,在对照合格的情况下，观察待检血清各孔的凝集程度，以呈,“,+,”,凝集的待检血清最大稀释度为血凝效价（血凝价）。,猪口蹄疫油佐剂灭活疫苗（,O,型）接种种猪的抗体水平达到,1,：,128,以上为免疫合格。,（8）判断结果,2.,用于鉴别诊断的正向间接血凝试验,（,1,） 稀释待检血清（同抗体检测） 但需做,5,排。,（,2,） 稀释阴性对照血清 在另一块血凝板上将阴性血清稀释,1,：,64,。,（,3,） 稀释阳性血清 将阳性血清做,1,：,512,稀释。,2. 用于鉴别诊断的正向间接血凝试验 （1） 稀释待检血,4.,滴加对照孔 取,1,：,64,稀释的口蹄疫,O,型阴性血清,50ul,加入第一排第,10,孔，取,1,：,512,稀释的口蹄疫,O,型阳性血清,50ul,加入第,11,孔，取稀释液,50ul,加入第,12,孔，分别作阴性、阳性和稀释液对照。第二排,10-12,孔分别加入稀释好的口蹄疫,A,型阴性血清、阳性血清和稀释液。第三排,10-12,孔分别加入稀释好的口蹄疫,C,型阴性血清、阳性血清和稀释液。第四排,10-12,孔分别加入稀释好的口蹄疫,Asia-1,型阴性血清、阳性血清和稀释液。第五排,10-12,孔分别加入稀释好的猪水泡病阴性血清、阳性血清和稀释液,。,4. 滴加对照孔 取1：64稀释的口蹄疫O型阴性血清50,5.,滴加正向血凝诊断液 将正向诊断液充分摇匀后，每孔各加,25ul,，第一排滴加口蹄疫,O,型间接血凝诊断液，第二排滴加口蹄疫,A,型间接血凝诊断液,第三排滴加口蹄疫,C,型间接血凝诊断液，第四排滴加口蹄疫,Asia-1,型间接血凝诊断液，第五排滴加猪水泡病间接血凝诊断液。置于振荡器上震荡,1,分钟。,6.,盖上与血凝板相符的玻璃板，以防水分蒸发，在室温下（,10-36,）静置,2h,。,5. 滴加正向血凝诊断液 将正向诊断液充分摇匀后，每孔各加,7.,判断结果,先检查对照孔是否合格，在各排第,10-12,孔都成立条件下。观察,1-5,排第,1-8,孔，如果某排,1-8,孔出现,100%-50%,凝集，其余四排仅在,1-3,孔出现,50%-25%,凝集，便可判定该份待检血清为阳性，其型别与所加的血凝抗原型别相同。,本法尚不能区分,感染性抗体,和,免疫性抗体,。为此，欲使本法用于鉴别诊断，采血时必须要弄清该批动物是否接种过口蹄疫或猪水泡病疫苗。,7. 判断结果,二、琼扩试验,同以前讲过的法氏囊抗体检测,此法敏感性差，漏检率高，常用于定性检验。,二、琼扩试验,
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