肝病的病理形态特点及免疫组化染色体会课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,整理课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,整理课件,*,常见肝病的病理形态特点及免疫组化染色的几点体会,复旦大学病理学系,张锦生,整理课件,1,常见肝病的病理形态特点及免疫组化染色的几点体会 复旦大学病理,肝穿刺标本检查和处理原则,1.,肉眼观察,肝穿刺标本呈完整园柱状，长度,1,3 cm,典型的慢性肝炎肝纤维化标本呈竹节状外观,肝硬化的穿刺标本，呈不规则碎块,整理课件,2,肝穿刺标本检查和处理原则1. 肉眼观察 整理课件2,2.,石蜡切片,每张玻片上应放置超过,6,个连续组织切片，有助于肝纤维化的病理诊断。,整理课件,3,2.石蜡切片 整理课件3,3.,染色 除常规染色供病理诊断用之外，根据条件,和需要作以下特殊染色：,网状纤维染色，,Masson,三色染色，,胶原纤维染色,(Sirius red,或免疫组化,),整理课件,4,3. 染色 除常规染色供病理诊断用之外，根据条件整理课件, Dm-HSC, -SMA-MFb,Dm,-SMA,整理课件,5, Dm-HSCDm-SMA整理课件5,S,1,S,2,S,3,S,4,各种病因引起肝纤维的病理学特点及分期,1.,慢性肝炎肝纤维化,( Dr.Scheuer,方案）,整理课件,6,S1S2S3S4各种病因引起肝纤维的病理学特点及分期整理课件,活动性纤维间隔静止性纤维间隔,整理课件,7,活动性纤维间隔静止性纤维间隔整理课件7,脂肪性肝病肝纤维化,穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液,小叶中央区纤维化窦周纤维化,整理课件,8,脂肪性肝病肝纤维化 小叶中央区纤维化,3.,肝糖原累积病肝纤维,整理课件,9,3. 肝糖原累积病肝纤维 整理课件9,4. Wilson,病,红氨酸,(Rubeanic acid),染色,铜被染成深绿色,整理课件,10,4. Wilson病 红氨酸(Rubeanic acid),5.,血色病,穿刺肝组织因含有大量含铁血黄素沉着呈火焰红色,肝细胞普鲁氏蓝染色阳性,整理课件,11,5. 血色病 肝细胞普鲁氏蓝染色阳性整理课件11,6.,自身免疫性肝炎肝纤维化（,AIH,）,门管区肝细胞呈花环状排列,Hepatic Rosette,，表现为数个水样变性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环状结构。,整理课件,12,6. 自身免疫性肝炎肝纤维化（AIH）整理课件12,7.,原发性胆汁性肝硬化（,PBC,）,3,期（间隔期）,90%,出现自身抗体,(A-Mit),，,Florid duct lesion+Biliary PN,，,纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性,4,期（肝硬化） 静止,-,纤维间隔内无炎症或轻度炎症,活动, Fibrous PN.,整理课件,13,7. 原发性胆汁性肝硬化（PBC） 整理课件13,8.,血吸虫性肝纤维化,整理课件,14,8. 血吸虫性肝纤维化 整理课件14,肝癌,(LIVER CANCER,),HCC,ICC,Combined hepatocellular and cholangiocarcinoma,整理课件,15,肝癌(LIVER CANCER)HCC整理课件15,肝癌病理诊断常用免疫组化和特染,Hep Par1,线粒体相关抗原，与,AFP,无关,对胎儿和成人肝细胞高度特异,(HCC:,阳性率,82-97%,）,整理课件,16,肝癌病理诊断常用免疫组化和特染Hep Par1整理课件16,AFP,HCC,阳性率：,15-82%,整理课件,17,AFP整理课件17,CD34:,HCC,型染色,长条分枝，管壁纤细，管腔狭窄，分布均匀弥漫,.,而非癌肝组织内极少见,.,整理课件,18,CD34:整理课件18,CK 18:,HCC,ICC, Metastatic carcinoma:100%+,上皮性肿瘤标志物,整理课件,19,CK 18:整理课件19,CK 19:,胆管型,CK: CK19,CK7,肝细胞,胆管上皮，,ICC,：,77-100%,ICC,最好的标志物,整理课件,20,CK 19:整理课件20,CEA,：,monoclonal CEA:,毛细胆管,ICC,，转移性肝癌：,60-75%+,HCC:0-11%+,polyclonal CEA:,毛细胆管,HCC,特异标志物之一,整理课件,21,CEA：整理课件21,CK 20:,胃肠道腺癌的主要标志物,转移性腺癌：,74-100%+,ICC:10%+,HCC:0%+,整理课件,22,CK 20:整理课件22,MOC31:,抗人上皮相关抗原,转移性腺癌：,100%+,ICC: 92.9%+,HCC: 0% +,胃癌肝转移,整理课件,23,MOC31: 抗人上皮相关抗原整理课件23,HBsAg:,HCC: 70-80% +,胞质型，胞核型阳性,胞质型，核周型阳性,整理课件,24,HBsAg:胞质型，胞核型阳性胞质型，核周型阳性整理课件24,黏液染色：,AB/PAS,酸性黏多糖：兰色（胆管腺瘤,ICC,腔内黏液）,中性黏多糖,糖原：红色（假腺管型,HCC),整理课件,25,黏液染色：AB/PAS整理课件25,免疫组织化学染色的几点体会,一、组织和细胞标本制备,目的：,(1),最大限度地保存组织结构。,(2),最大限度地保存抗原性。,注意事项：在选择组织处理方法前，先根据实验目的，参考抗体说明，确定组织处理方式,(,冰冻,?,石蜡,?),。,整理课件,26,免疫组织化学染色的几点体会一、组织和细胞标本制备整理课件26,1.,取材,（,1,）原则：尽可能新鲜，动物标本可选,用动脉灌注固定。,（,2,）取材部位：尽量包括病灶和正常组,织交界处，避免选择坏死组织。,（,3,）避免挤压：受挤压组织不但影响,HE,切片的观察，还造成非特异性,免疫组化组织着色。,整理课件,27,1.取材（1）原则：尽可能新鲜，动物标本可选整理课件27,2.,固定,根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。,容器要大,固定液要宽余,.,固定时间既要考虑充分固定,又不能太长,(,依组织块厚薄大小从,24hr,至,3,5,天,太长可溶性抗原会渗漏,阳性会减弱甚至转阴,.,选择最合适的固定剂,如用福尔马林,必须用缓冲福尔马林,整理课件,28,2.固定根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新,3.,制备蜡块,冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋,如无低温石蜡,可将组织块尽可能修薄,以缩短脱水、透明、包埋时间,尽可能保存组织内抗原稳定。,整理课件,29,3.制备蜡块冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋,4.,制备冰冻切片,冷冻包埋能较好保存抗原,新鲜及已固定材料均适合于冷冻包埋、切片。,防止冰结晶,!,预处理,:,目的是减少组织中的水分以减少冰结晶的产生,方法是将已固定、冲洗的组织块放入,20,30%,蔗糖缓冲液内,4,冰箱过夜,再将组织块埋于,OCT,包埋剂,速冻,:,目的是使温度很快下降迅速通过冰点,防止冰结晶产生。,整理课件,30,4.制备冰冻切片冷冻包埋能较好保存抗原,新鲜及已固定材料均适,速冻方法,液氮法,:,将,OCT,包埋的组织块投入液氮数秒,等组织块冻结后,立即移入低温冰箱,(,装入封口塑料袋内密封,),或放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片,;,干冰,-,丙酮法,:,将,200ml,丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度可达,-70;,将装有,50ml,异戊烷的小烧杯缓慢置入,干冰,-,丙酮,饱和液中,;,然后将,OCT,包埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。,整理课件,31,速冻方法液氮法:将OCT包埋的组织块投入液氮数秒,等组织块冻,免疫组化染色后的衬染,常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果阳性信号在细胞核,切勿衬染细胞核,!,细胞质衬染,:1%,亮绿,但退色较快,可改用坚固绿,(FAST BLUE),染,则保存时间较长,整理课件,32,免疫组化染色后的衬染常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果阳性,封固和保存,绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用,DAB,以外的底物应注意有色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固物如明胶、甘油缓冲液等。,酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。,免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。,整理课件,33,封固和保存绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用DAB以,一,.,常用免疫组织化学方法,免疫荧光,:,用于培养细胞效果较好,石蜡切片因常有自发荧光,背景荧光较强,用时要注意,FITC,(,异硫氰酸荧光素,),用,450,490 nm,光激发,515nm,滤片观察,呈,翠绿色,RB200,(,四乙基罗达明,B200),用,570nm,光激发, 596,600nm,滤片观察,呈,橘红色,TRITC,(,四甲基异硫氰酸罗达明,),用,530,560nm,光激发,580nm,滤片观察,呈,红色,Texas red,用,595nm,光激发, 615nm,滤片观察,呈,红色,直接免疫荧光法,:,间接免疫荧光法,双重荧光染色,整理课件,34,一.常用免疫组织化学方法整理课件34,2.,免疫组织化学,常用方法,:,PAP,ABC,或,LSAB,ELPS(,二步法,),整理课件,35,2.免疫组织化学常用方法:整理课件35,20,世纪,70,年（,1970,）,Sternberg Peroxidase-anti-Peroxidase,(PAP),整理课件,36,整理课件36,20,世纪,80,年代（,1981,） 许世民,ABC,（亲和免疫组化）,Avidin-Biotin-Peroxidase Complex,整理课件,37,20世纪80年代（1981） 许世民 ABC（亲和免疫组,90,年代中期：,Enhanced Polymer One Step (EPOS),EnVision (Enhanced Labelled Polymer System,ELPS),简称二步法,1 mol,含,70 mol HRP + 10 mol AB,整理课件,38,90年代中期：Enhanced Polymer One St,如何做好免疫组化染色,?,什么才是高质量的免疫组化染色,?,阳性信号突出,无背景染色,切片平整,无破裂,/,碎,无污秽,整理课件,39,如何做好免疫组化染色?什么才是高质量的免疫组化染色?整理课件,做好免疫组化染色几点体会,1.,组织细胞处理,:,固定剂,固定时间,速冻防冰结晶,白片质量好,:,平整,无破裂,/,碎,无污秽,防脱片,:,玻片绝对干净,涂粘合剂,:,白胶,多聚赖氨酸,铬明矾明胶液,甲醛明胶液,贴片后冷风吹干或,37 /60,烘干,整理课件,40,做好免疫组化染色几点体会1.组织细胞处理:整理课件40,2.,抗体,:,特异性,高效价,亲合力,适度稀释度,3.,石蜡切片,-,抗原修复,(1),蛋白酶消化,:,胰蛋白酶 胰糜蛋白酶 链霉蛋白酶,蛋白酶,K,胃蛋白酶,消化不足,-,修复失败,假阴性或信号弱,消化过度,-,结构破环,脱片,(2),热修复,:,微波照射 高压加热 水浴加热,(3),微波,+,蛋白酶消化,注意点,: ,固定时间长,消化时间或热修复时间适当延长,酶生产厂家不一,或批号不一,消化时间可能也不一,热修复的介质要选合适,必须要加钙螯合剂,预实验摸最佳方案,整理课件,41,2.抗体:特异性,高效价,亲合力,适度稀释度整理课件41,阳性结果的判断,“,边界效应”引起假阳性,均匀一致的着色,假阳性可能极大,根据阳性信号的分布,:,核抗原应该在核内,有时胞质也可阳性,;,膜抗原应在细胞膜,有时胞质也可阳性,;,胞质抗原应在细胞质,.,转录因子或核内受体应在核内或胞质内,.,如出现异常分布,则假阳性可能很大,.,整理课件,42,阳性结果的判断“边界效应”引起假阳性整理课件42,谢谢,!,请提宝贵意见,!,整理课件,43,谢谢!请提宝贵意见!整理课件43,此课件下载可自行编辑修改，供参考！,感谢您的支持，我们努力做得更好！,整理课件,44,此课件下载可自行编辑修改，供参考！整理课件44,