基因诊断原理课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因诊断原理课件,基因诊断原理课件基因诊断原理课件 基因诊断原理李时荣,概念：,又称DNA诊断，是利用DNA重组技术，直接从DNA水平来检测人类疾病的新的诊断手段，是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。,基因诊断是形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生和发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。基因诊断,一我国农村职业教育的现状 （一）农村职业教育生源不足，招生困难 世纪之交的高等教育扩招促使高等教育迈入大众化阶段，由于各类高校不断扩招，高等院校与职业院校在招生方面展开了激烈的竞争。1实行九年义务教育后，虽然每年初中毕业生升学率逐年上升，但2005年以前始终保持在50%左右，50%左右的升学率意味着每年有一半的初中毕业生没能升学而直接参与就业，积聚了大批初中及以下受教育水平的劳动者，对我国劳动力资源整体素质的提升造成严重的影响。另一方面与基础教育相类似，对于职业学校而言，农村职业学校在与城市职业学校竞争中处于劣势，由于区域教育发展的不平衡，贫困地区、民族地区部分农村贫困家庭虽然想让孩子进入农村职业学校却承担不了高昂的学杂费和生活费。招生困难直接影响到农村职业教育持续发展。,（二）办学条件差，专业设置不合理,目前，很多农村职业学校一方面存在着专业建设缺乏相应的教学配套设备，实习设备陈旧落后，缺少实习实训基地，师资力量薄弱，专业骨干教师特别是“双师型”教师紧缺等问题，严重影响学校办学质量的提高，进一步限制了学校的发展。另一方面，办学方向还是单一的应试教育、片面追求升学率，类似于普通高中，教学内容陈旧。由于绝大部分农村职业教育几乎是单一地根据城市的人才需求状况确定人才培养目标和专业设置，不能统筹好劳动力的输出与本地需要的关系，在专业设置上贪大求全，存在专业重复设置的问题。目前，绝大多数农村职业学校培养的人才不能做到“适销对路”，它们的专业设置对劳动力市场缺乏敏感性，不能前瞻性地进行专业调整；所开专业多为成本小，对实习基地要求不高，缺乏特色的专业；专业结构与产业、行业对人才的需求结构不协调。2,（三）农村职业教育评价低，社会偏见严重,受中国传统思想文化的影响，农民的教育观念比较落后，处于弱势阶层的农民有“学而优则仕”的思想，片面追求高学历，迫切希望自己的子女能够进入普通高校尤其是重点高校学习，将来能够离开农村到大城市生活。由于农民自身文化素养不高、目光短浅，许多农民对农业职业教育认识不足，职业教育培养的是蓝领阶层，学生毕业后从事的工作社会评价低、收入水平低。家长认为子女如果通过接受职业教育仍然不能够“跳出农门”摆脱农村生活，他们宁愿让子女选择外出打工或参加农业劳动。3在当今社会普遍存在着“重城市、轻农村，重普教、轻职教，重学历、轻职业技能培训”的思想观念，4绝大多数职业院校“多在城市，少在农村”，城市职业院校财政投入资金多、规模大、生师比高。,二发展农村职业教育的迫切性,（一）促进社会公平，构建和谐社会,构建社会主义和谐社会，必须落实教育优先发展的战略地位，努力办好农民满意的教育。教育事业关系千家万户，关系广大人民群众的切身利益，是构建社会主义和谐社会的基石。和谐社会是经济和谐发展的社会，而教育是促进经济社会全面协调发展的基础和保障。和谐社会是公平正义的社会，而教育公平是社会公平的起点和核心环节，是社会公平的重要组成部分。发展农村职业教育极大地促进了教育公平，同时也为人的个性发展提供了机会。5由于城乡二元体制影响了教育资源的人、财、物分配，是城乡教育资源配置失衡的源头，因此应大力发展农村职业教育，缩小城乡差别，促进我国农村社会稳定和全面进步，促进教育公平，进而促进社会的公平。当前就业市场矛盾相当突出，发展农村职业教育可以帮助就业大军提高劳动技能，促进社会稳定。,（二）转变经济增长方式，促进农业现代化,当今一个阶段，我国处于工业化中期，城镇化、市场化、国际化加快发展，为提高我国生产技术含量，推动经济结构的调整，特别需要具有高素质的劳动者和技能型人才。为了解决“三农”问题，促进农村经济的发展，有些学者认为农村职业教育可以普及农业先进实用技术，有力地推进农村经济的发展，激活农村经济，将农村职业教育称为“经济助推器”，所以应加快发展面向农村的职业教育，用现代的农业科技培养和培训农业劳动者，提高其科技素养，有力地促进农业科学技术进步、推广、应用，加速传统农业向现代农业迈进，促进我国经济的发展。,三加快发展农村职业教育的对策,（一）扩大职业教育对农村学生的招生，树立“大职教观”,生源不足使得农村职业学校不能实现可持续发展，招生难成为了农村职业教育发展的瓶颈。因此，进一步扩大面向农村的中等职业教育招生规模，首先应把加快发展面向农村中等职业教育作为职业教育的重点，除进一步扩大招收农村应届初中毕业生的规模，还要通过东部和西部、城市和农村中等职业学校联合招生合作办学，开展职业教育集团化办学。其次，应实行灵活学制。虽然乡村的新生代农民、外出的农民工急需进行系统的职业培训，拥有一技之长，但往往因职业学校学习周期等问题，挫伤了接受职业教育的积极性，应树立“大职教观”，让中考、高考落榜的往届生、农村富余劳动力、退转军人、下岗职工、农民工、农民、在岗职工等能够无门槛或低门槛进入职业学校，接受职业教育、继续教育和培训，支持各级各类学校积极参与新型农民、进城务工人员和农村劳动力转移培训。6再次，在加大各级政府支持力度的同时加强职业教育的法制建设，推进教育公平，逐步推行中等职业教育免费制度，发展农村职业义务教育。,（二）加大对职业教育投入，保障农村职业教育的发展,农村职业教育发展离不开政府、企业和社会的支持。首先，为改善农村职业学校的办学条件，应加大财政经费投入力度，提供农业职业教育的经济保障。为消除城乡职业教育的巨大差别，国家必须推进城乡教育机会平等，在资金投入方面继续向农村倾斜。推进城乡教育机会平等，加强农村剩余劳动力职业教育。7其次，在师资方面，构建“双师型”教师队伍，优化教师素质。为提高农业职业教育质量，必须加强教师队伍建设。为提高农业职业教育质量以适应经济发展的需要，一方面应以“双师型”教师为重点，为加快实现农村现代化的步伐逐步建立适应新型农民的师资队伍，包括加大职业院校教师培养培训力度；依托相关专业的高等学校或大中型企业，共建“双师型”教师培养培训基地，聘任一些具有实践经验的专业技术人员和高技能人才担任专职或兼职教师，着力提高农村职业学校教师的学历层次，优化教师学历结构，同时学校应该制定相关优惠政策吸引高层次的人才到农村职业学校。学校可以通过面向社会招聘，从行业、企业中引进具有丰富实践经验的技术人才作为兼职教师。积极开展教育教学研究，鼓励教师参加农业生产一线的实践锻炼，重视选拔和培养骨干教师和学术科研带头人，提高教师综合素质，使教师成为集理论教师、实训教师、素质培育师为一体的教育工作者。8再次，在专业设置方面，为适应新形势下农村经济发展需要，实现农业现代化，农村职业学校应该结合学校实际，以就业市场为导向，及时调整专业设置和课程安排，农村职业教育应涉及农业建设，加大培养适应农业和农村发展需要的专业人才力度，城市和高等院校、科研院所应大力支持农村职业教育的发展，办好涉农专业，增强为农服务的能力。,（三）转变传统观念，加快农村职业教育的发展,要充分发挥大众传媒的作用，充分借助新闻舆论的力量，通过电视、广播、报纸、杂志、网络等媒体，关注和宣传农村职业教育，大力宣传通过农村职业教育脱贫致富的成功案例，改变他们对职业教育的轻视并促使他们愿意让孩子接受合适的职业教育。同时，要提升农村职教的层次，畅通职业教育升学通道。有些学者提出：“职教育可以拓展到本科职业教育和研究生职业教育，可以授予学士学位和硕士、博士学位。职校毕业生与普校毕业生平等参与劳动力市场竞争，职校生同样可以从事白领工作。这样能够在一定程度上削弱农村社会对职业教育的偏见。”9在实现农村现代化的进程中，加快农村经济的发展，需要我们缩小城乡差别，优先发展农村职业教育，通过政府提供的政策倾斜让农民子女拥有与城市相同的职业教育权利和机会，这有助于促进城乡教育公平在职业教育资源配置上向农村倾斜，有效解决在人财物资源分配方面的“贫富悬殊”，以实现整体优化。,探究学习是从知识获得途径与方式角度对学习进行分类的，即从学科领域或现实生活中选择和确定研究主题的，教学中创设类似学术研究的情境，学生自主通过实验、调查、搜集处理信息、交流等活动，独立发现问题，获得知识，它是学生探索精神和创新能力发展的过程。它不仅使学生的知识与技能、情感与态度得到发展，更重要的是使学生探索精神和创新能力也得到发展。因此，它既是一种学习方式，也是一个学习过程。,怎样在化学课堂中实施探究学习，促进学生素质提高呢？,一、培养学生探究的欲望,探究就是探讨研究， 探究欲实际上就是求知欲， 是一种内在的东西，它解决的是“想不想”探究的问题。,在课堂教学中，教师的一个最重要的任务就是要激发和培养学生的探究欲望，使其经常处于一种探究欲望之中。因此教师在课堂教学中，要注意激发学生兴趣，促使他们主动参与研究。比如在探究“CO2能否和氢氧化钠发生化学反应”这个实验中，我是这样设计的：,取2支试管，分别倒入等量的澄清石灰水和氢氧化钠溶液，然后找全班最矮和最高的两个男生吹气，结果矮个的溶液很快变浑，而高个同学使出浑身的力气吹，溶液始终没有发生变化。,大家的兴致开始上来了：唉，怎么回事啊？难道二氧化碳真的不和氢氧化钠反应吗？不对！氢氧化钙（石灰水的主要成分）和氢氧化钠都是碱，具有相似的性质，应该都能和二氧化碳发生化学反应。大家议论纷纷，我顺势引导他们设计实验方案并验证实验是否发生化学反应那节课，学生兴致盎然，意犹未尽，下课了还在争论着。,由此可见，充分利用生活中和课本上资源，通过与学生的共同研讨，使学生在愉悦的氛围中学习 ，逐步形成在日常学习和生活中乐于质疑和探究，努力求知的心理欲望。,二、创造学生探究问题空间,俗话说：心有多大，舞台就有多大。因此，问题空间有多大，探究的空间就有多大。在课堂教学中，问题从哪来？一方面由教师设计，另一方面由学生提出。如果教师要为学生设计探究空间，必须具有探究价值，问题应该落在学生的“最近发展区”。如果太难或者太易都没有太大探究价值。拿上面例子来说，既然碱有相似化学性质，问题就自然引出来了：怎样来证明二氧化碳和氢氧化钠发生了化学反应呢？既然两者反应没有任何现象，我们必须要从间接角度来证明它们发生反应。可以从哪些方面来着手呢？学生通过讨论提出几种方案：1.用酚酞试液，2.用稀盐酸，3.氯化钙溶液。第一种被学生否定了，理由是氢氧化钠本身也是碱性的，无法证明产物是碳酸钠。第二、三种可以，学生通过动手实验观察到有气体或白色沉淀生成。从而验证了所给问题。,我们还能从别的角度，比如气压角度来证明吗？学生思考交流，最后也提出了一些方法：有的学生用塑料瓶来做，看见瓶子变瘪了，就证明反应了；有的学生还想到了瓶吞鸡蛋的方法等。,在探究实验的教学中，教师应设法让学生自主提出问题、作出假设、设计实验方案、验证假设，教师只提供常见药品和仪器，让学生自主探究。或者让学生根据教师提出的问题，设计实验方案，进行多次实验探索。但是要注意问题要符合学生的“最近发展区”。由此可见，要想让学生有效地进行探究学习，问题的设计是关键。,三、留给学生充分自主学习的时间,在平时的课堂教学中，教师对时间如何分配，直接反映了教师的教学观。很多教师习惯把课堂当做展示自我的舞台，在不知不觉中垄断了学生的学习权利。而作为学习的主人学生，却变成了录音机和被灌食的鸭子。难怪教师抱怨“书教的辛苦”，学生叫苦“书学的受罪”。,苏霍姆林斯基曾说过：自由支配的时间是学生个性发展的必要条件。因此要让学生成为学习的真正主人，就必须保证学生拥有自己支配的课堂时间，这是关键，否则就是一句空话。,在学习“生活中常见酸和碱”这节内容时，课前，我让学生准备一些物质如肥皂、洗衣粉、碱面、食盐、白醋等。学生通过触摸，品尝如肥皂，洗衣粉，碱面等，知道它们都有滑腻感和苦涩味，这一类物质显碱性，属于碱性物质，然后给出“碱”的概念。我当即提问：近年来生活中出现“不加洗衣粉的洗衣机？”。学生顿时来了兴致：还有不要洗衣粉的？不加洗衣粉能洗干净衣服吗？我接着问：它的原理是什么？既然可以去油污，洗衣机里的水显碱性吗？怎么知道是否显碱性？自然引出判断酸碱的方法：酸碱指示剂和PH试纸的使用，课上学生学的津津有味，课外，有的动手测洗衣机里水的pH值，有的上网查找它的去污原理。,四、课堂要有多维互动的交流空间,儿童的认知发展既需要独立思考，又需要合作交流。建构主义认为协作交流是学习的基本要求之一。理论上，学生之间都存在个体差异，如果我们的课堂一直是“一言堂”“满堂灌”，势必会抹杀学生的个性差异，哪还有什么探究可言。难怪有人说，100个孩子上学前有100个思想，经过9年义务教育后只有一种思想。在探究实验教学过程中，教师要把个别学习与合作学习结合起来，为学生探究提供广阔空间。,【,基因诊断原理课件基因诊断原理课件基因诊断原理课件,1,基因诊断原理,李时荣,基因诊断原理李时荣,2,概念：,又称DNA诊断，是利用DNA重组技术，直接从DNA水平来检测人类疾病的新的诊断手段，是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。,基因诊断是形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生和发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。,基因诊断,基因诊断,3,基因的作用：,是遗传的物质基础，基因是决定遗传性状的最基本的功能单位，生物体的完整结构（细胞器、膜结构等）的保证及各种功能的发挥有赖于多种基因的正常表达及相互调节，这些基因构成了一个生物体的完整的基因组。,病原体基因的特点：,它决定了病原体的生物学特性。除个别病毒外，现知的所有微生物均是以核酸为遗传物质。病原体的基因即可以使脱氧核糖核酸DNA，也可以使核糖核酸RNA。简单病原体的基因组，如某些病毒仅有一至数个基因组成，细菌的基因组则含有数千种基因。但是任何一种病原体均有其独以无二的基因组成和结构，尤其是基因的一级结构，这就为病原体的基因诊断奠定了物质基础。,基因诊断,基因的作用：基因诊断,4,基因诊断的目的：,就是要通过各种手段，如杂交、扩增等，去寻找和发现这些独特基因组、基因或基因片段的存在，从而证实某种病原体的存在。,传统诊断与基因诊断的比较：,传统诊断的缺陷多，方法大多为：,1、表型诊断：以疾病或病原体的表型为依据。而表型的改变在多数情况下是非特异的，出现的时间也比较晚，易错过治疗的最佳时期。某些疾病本身不呈现显著的表型改变，用传统的检测方法亦出现假阴性。,2、传统诊断方法费时，精确度低。,基因诊断,基因诊断的目的：基因诊断,5,基因诊断的优点：,基因诊断以基因作为检测对象，因而具有以下优点,（1）针对性强，特异性高。,（2)标本用量少，来源广，灵敏度高。病人的血液、尿液和羊水脱落细胞以及头发等均可用以检测，由于基因体外扩增技术的发展，待分析的标本只需微量，目的基因秩序PG水平。,基因诊断,基因诊断的优点：基因诊断,6,（3）适应性强，检测范围广一语基因探针的来源工种类较广，其探针序列列为亦可谓一类特定的基因组，可谓内源性基因亦可为外源性基因，在感染性疾病的基因诊断中，不仅可检出正在生长的病原体，也可检出潜伏的病原难题，能确定以娃娃能够感染，也能确定现行感染。对那些不容易体外培养的和不能在实验室安全培养的病原体，也可用基因折断检测，辅以DNA片段长度多态性分析。还可以对病原体进行基因分析。另外，基因诊断可用于研究基因差异表达，对有组织和分化间断特异性表达的基因进行检测，还能对疾病的易感性、发病类型和间断以及疾病的抗药性做出判断,（3）适应性强，检测范围广,由于基因探针的来源种类较广，其探针序列可为已知，亦可为一类特定的基因组，可谓内源性亦可为外源性基因，在感染性疾病的基因诊断中，不仅可检出正在生长的病原体，也可检出潜伏的病原体，能确定以往感染，也能确定现行感染。对那些不容易体外培养和不能再实验室安全培养的病原体，也可以用基因诊断检测，辅以DNA片段长度多态性分析，还可以对病原体进行基因分型，另外，基因诊断可用于研究基因差异表达，对有组织和分化阶段特异性表达的基因进行检测，还能对疾病的易感性、发病类型和阶段以及疾病的抗药性做出判断,基因诊断,（3）适应性强，检测范围广一语基因探针的来源工种类较广，其探,7,基因诊断技术方法分类,一，诊断技术分类,根据目的基因是否被放大分类 ：,1、杂交法:,被检测的目的的基因不被放大,如分支链DNA技术,但用杂交法可以进一步检测经过放大了的基因片断，如PCR产物杂交分析:,2、扩增法:,包括PCR及连接酶链反应，QB复制酶系统等。,基因诊断,基因诊断技术方法分类基因诊断,8,根据被测基因的核酸类型分类：,1、杂交Southern印迹用于检测DNA;Northern印迹用于检测RNA;斑点印迹或称斑点杂交 ,既可检测DNA也可检测RNA。,2、PCR法主要用为直接扩增DNA，但是通过逆转录技术,可以将RNA先转变为cDNA再行扩增，称逆转录PCR,如检测HCV，HGV，HIV等。,3、原位杂交,或原位PCR,也可分DNA或RNA原位杂交和原位PCR或逆转录PCR。,基因诊断,根据被测基因的核酸类型分类：基因诊断,9,根据是否提高了敏感度分类,1、分支链DNA技术(bDNA),就是根据固相杂交的原理,采用了一种放大标记探针,目的探针不被放大,但检测信号被放大,从而提高了敏感度。,2、套式或巢式PCR,是用两套引物(内,外引物)作两轮PCR,第二轮PCR是以第一轮PCR的产物作为模板,敏感度进一步提高,常用于极微量病毒基因检测,如检测TT病毒,以及检测大多数RNA病毒(称逆转录套式PCR)。,基因诊断,根据是否提高了敏感度分类 基因诊断,10,根据待测标本的性质,分析体中的(血，尿，粪，痰液,胸腹水等等),细胞和组织基因检测。,1、体液中的待测基因可在将标本适当处理后,根据需要采用上述各种方法检测,2、组织切片内基因检测则可采用原位杂交和原位PCR法,3、细胞内病原体基因检测可以通过细胞裂解，释放测基因后，采用与体液检测相同的方法，也可将细胞固定于一定载体上，如玻片，或硝酸纤维膜上（如平板上细菌菌落内的基因鉴定），采用类似于组织基因测定的方法.,基因诊断,根据待测标本的性质 基因诊断,11,根据诊断目的或要求,分为定性诊断,定量诊断和半定量诊断,以及序列分析等。,二，基因诊断的策略,1， 从基因产物入手,这是一种比较早期的诊断策略。首先,分析异常基因的产物（蛋白质），,并弄清是如何引起临床症状的。在纯化了该蛋白质以后，进行氨基酸序列测定,据此合成寡核苷酸探针,从互补DNA(CDNA)文库中筛选克隆,然后通过,DNA序列分析确定导致疾病的分子缺陷。这种策略是由蛋白质至DNA，由表型至基因型。,迄今分离的绝大部分分子病和遗传性代谢缺陷病如白化病,苯丙酮尿症(PKU)和镰状细胞贫血等的相关基因都是根据这一策略分离的。,基因诊断,根据诊断目的或要求 基因诊断,12,2， 从基因定位入手,根据遗传连锁图将致病基因定位在染色体的某一具体位置上,这种基因定位和克隆的策略称为定位克隆。比较正常和异常基因的差别，就可找出导致遗传病的分子缺陷，进而阐明正常和异常基因产物（蛋白质）的生理功能和病理效应。常用于染色体上基因定位的遗传标记有限制片段长度多态性(RFLP),可变数目串联重复序列(VTR),短串联重复序列(STR)及近年来发展起来的单核苷酸多态性(SNPs)等。,基因诊断,2， 从基因定位入手 基因诊断,13,3、 从比较正常和异常基因的差异入手,临床上较常见的一些遗传病如糖尿病，重度肥胖，哮喘，精神病等都是由多个疾病基因与有害环境因素相互作用的结果。比如，已定位的2型糖尿病易感基因有10多个，其中单个基因的作用是微小的，但存在累加效应。对于这些复杂遗传病，目前主要采用表型克隆方法进行诊断。表型克隆是将表型与基因结构或基因表达的特性结合起来，直接分离该表型的相关基因。这种策略既不用事先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受基因数及其相互作用方式的影响。,基因诊断,3、 从比较正常和异常基因的差异入手 基因诊断,14,三，方法和原理,（一）杂交法,1、原理,杂交技术的基本原理是相同的。病原体基因的一级结构中都含有四种碱基：DNA为腺嘌呤（A），胞嘧啶（C），鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T),RNA为腺嘌呤(A), 胞嘧啶（C），鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。在双链DNA或RNA中这四种碱基以固定关系配对，即A-T（或A-U），C-G，这种碱基配对关系就构成了DNA或RNA两条链的互补关系，也就是说，两条链之间是严格的通过A对T（或A对U）,C对G的关系结合在一定的。,基因诊断,基因诊断,15,在一定的温度下，这两条链可以打开，变成分离的两条链，但又可以在一定温度下结合起来，这种“再结合”仍然遵循互补原理，但是再结合时的两条互补链是随机碰撞而形成双链的，也就是说在结合后的两条链已经不再是“元配”的了，“杂交”一词就由此而来。如果我们在一条链上“打上标记”，并用它去与另一条链杂交，如果另一条链的确存在，就必然会发生杂交反应，杂交体（新的双链）上也就会被同样带上了标记，再用特定的技术可以探测到标记的信号。,基因诊断,在一定的温度下，这两条链可以打开，变成分离的两条链，但又可以,16,2、方法,杂交法中最关键的技术是制备标记探针.标记探针的制备过程包括探针的制备和探针的标记两部分,可分别亦可同步进行。常用的方法有切口平移法、随机引物法、末端标坊法、单链探针制备和标记等。目前的还有应用比较广泛的寡核苷酸标记探针,即在寡核苷酸化学合成过程中将标记物(放射性的或非放射性的)掺入或修饰在探针上.,(1)斑点杂交：,将待测标本用点状加样法，直接滴加膜上，然后用碱溶液使核酸变性并结合在膜上以，再经中和及烘烤（尼龙膜可用紫外线照射）后，与探针进行杂交。,基因诊断,2、方法基因诊断,17,（2）Southern印迹：,又称凝胶电泳印迹转移杂交。是电泳技术与杂交技术结合的一种方法。先将待测标本病原体DNA分离，经限制性内切酶消化成一系列片段，时行琼脂糖凝胶电泳，各片段因分子量不同而彼此分开，然后经碱处理凝胶，使DNA的片段变性，在原位将单链核酸吸印到硝酯纤维膜上，经烘干、固定，以放射性核素标记DNA探针进行杂交，最生洗膜和放射自显影，从显影区带鉴定待测标本DNA片段。,基因诊断,（2）Southern印迹：基因诊断,18,（3）Northern印迹：,是指RNA（主要Mrna）的分子杂交技术。其原理和操作过程基本上与Southern印迹法相同。差别在于电泳标本是RNA片段，使用的探针是标记的DNA。,（4）原位杂交：,是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种特殊技术。用标记核酸探针，与细胞涂片、压片、细胞悬液滴片或组织切片上具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，然后通过放射自显影或酶底物显色或激发荧光等方法检测特定的核酸分子所在的部位。由于本法不需从细胞中提取核酸并可直接观察待测核酸所在的细胞类型、细胞内分布状态与细胞染色体的关系，因此常用检测病毒与细胞关系的极好方法。,基因诊断,（3）Northern印迹：基因诊断,19,（5,）微反应板杂交：,杂交反应的载体不是硝酸纤维膜或尼龙膜，而是微孔反应板，操作方便，敏感度高。此法快速、简便，不需先抽提核酸，一次可检测大量标本，已广泛用于检测血清或肝组织HBV、DNA、HCV、RNA、HIV、RNA等。该技术近年来发展较快，预计将取代斑点印迹法。,基因诊断,（5）微反应板杂交：基因诊断,20,扩增法PCR法,1、原理,利用耐热的DNA聚合酶（如Taq、DNA聚合酶等）在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成。它包括变性、退火、延伸三个过程。这3个过程组成一个循环周期，上一个周期合成的确良产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过n个循环后，靶DNA的拷贝数呈2n增长，可把靶DNA的拷贝数扩大百万倍,以上。,基因诊断,扩增法PCR法基因诊断,21,2方法,（1）标本处理：作为PCR的待测标本，单链、双链DNA或RNA均可。如以RNA为起始标本，则需选通过逆转录获得cDNA第一链后才能扩增，此即逆转录PCR（RT-PCR）法。标本中不能混有任何外源和内源性蛋白酶（可降解Taq DNA聚合酶）、核酸酶、DNA多聚酶的掏剂或能结合DNA的蛋白质。,（2）引物设计：由于引物决定扩增片段的特异性，因此它必须对致病微生物是特异的。可通过计算机进行致病微生物基因资料分析，先选出致病微生物基本组中具有相对独立性与保守性的序列，再设计与该序列两端互补的寡核苷酸片段进行人工合成。,基因诊断,2方法基因诊断,22,（3）扩增条件：须注意dNTP浓度、Taq酶的质量、引物用量、镁离子浓度、反应温度与时间、实验环境、器材质量等，这些都影响PCR结果的质与量。尤为重要的是要严格预防产物污染，以避免假阳性。,（4）PCR产物检测：根据检测目的不同可能选择琼脂糖凝胶泳染色法、Southern印迹转移法、酶切图谱分析法、序列分析法和PCR-ELISA。,基因诊断,（3）扩增条件：须注意dNTP浓度、Taq酶的质量、引物用量,23,3基因定量诊断,基因定量是在基因定性诊断技术基础上发展起来的，但历史不长，应用范围亦有限。目前主要用于数种病毒基因的定量分析，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒（HIV）等。基因定量诊断可用于病情评估、疗效预测和观察及预后判断等，故有重要的临床应用价值。随着基因定量技术和方法的不断完善，其应用范围也将不断扩展。,基因诊断,3基因定量诊断基因诊断,24,1杂交定量分析,（1）分支链DNA信号广大技术（bDNA）：,该技术系美国Chiron公司的专利。检测系统中的主要成分是5组功能不一的人工合成的寡脱氧核苷酸探针，其中标记放大探针是技术的关键。,bDNA技术有以下优点：,灵敏度高。其cut-off值为700000Eq/ml,阳性检出率高。Chiron的第二代bDNA系统将检测探针的针,对性扩展到HBV基因的各种亚型和突变型,稳定性和可重复性好,操作简便、省时、易于普及。因内已有一些医院采用bDNA,技术进行HBV基因和HCV基因检测。,基因诊断,1杂交定量分析基因诊断,25,（2）液丁分子杂交：,分别由美国的Abbott实验室和芬兰的Orion公司建立。其基本原因是将放射性同位素掺入标记探针，与待检基本在液相中杂交，然后经过吸付洗脱或过柱注脱，分离游离和结合探针，测定结合探针部分的放射活性。,（3）双抗体夹心杂交法：,彩用两种DNA/RNA杂交体的抗体：一抗为捕获抗体，吸附在微孔反应板上，二抗是标记抗体，偶联有AP，可通过酶促化学发光反应检测DNA/RNA杂次体的信号。,基因诊断,（2）液丁分子杂交：基因诊断,26,（4）微反应板酶联杂交,方法与bDNA相似，但在信号放大探针制备方式上有其独到之处，获得了国家发明专利。目前主要由于定量分析HBV基因组，敏感度比bDNA略低，但不需要特殊仪器，可普及化等其优势。,基因诊断,（4）微反应板酶联杂交 基因诊断,27,2PCR基本定量技术,基本原理同PCR定性技术，方法上计有终点稀释法、外参照法、荧光PCR、PCR-ELISA等。竞争PCR的基本原理则在定性PCR的基础上，在扩增反应管内加入一种称之为内参照的竞争模板，可以与野生模板即目的片段等效地被扩增。内参照是决定分析系统是否可靠和稳定的关键因素。,竞争PCR-ELISA法，采用一种独特和简便的技术，制备与目的片段等长的内参照，内参照中还含有杂交位点，这个杂交位点与目的片段的相应位点有近乎完全相等的杂交参数，该制备技术获得国家发明专利，利用该技术定量检测HBV DNA，有精确、简便、迅速、敏感的特点。,基因诊断,2PCR基本定量技术基因诊断,28,基因诊断技术的质控指标,临床医生了解基因诊断质控指标的含义，对于合理地选择检测方法和正确地分析与解释结果有很大的价值。,1 灵敏度,简单地说，灵敏度就是检测的最小值。一般来说，我们希望某一种检测技术的敏感度越高越好。理想地，病原体分离培养时能从待测标本中找到一个细菌或一个病毒颗粒或其他任何一个病原体；免疫学检测时，能测出一个抗原或抗体分子，等等，但这些通常都很难做到。然而基因检测则能达到这个理想境界，但在临床实践中，我们的确需要这么高的灵敏度吗？太高的灵敏度会对结果的可靠性带来什么影响呢？我们应当将这两个问题结合起来考虑，才能对某一检测项目的灵敏度有一个正确认识， 不应一味追求灵敏度。,基因诊断,基因诊断技术的质控指标基因诊断,29,2、 精确性,精确性就是真实性，我们希望任何一个检测技术的精确性越高越好，希望获得的结果与患者的病情吻合的。但是精确性要受下述两个条件的制约；第一，技术本身可能存在的局限性。第二，实验室条件和操作技术。大家都知道PCR法最难克服就是假阳性的问题，实验室内产物污染会毁掉一个实验室，而恢复一个实验室的正常检测需要相当长的时间、做许多的工作和浪费大量的人才、物力。假阴性也同样给临床工作带来不便。,基因诊断,2、 精确性基因诊断,30,3、 特异性,特异性与精确性有一定关系，但不能与精确性混为一谈。假阳性率和假阴性率的高低是衡量基因检测技术特异性的两大指标.前面谈到的PCR产物污染所致的假阳性主要与实验室条件和操作技术有关,严格地讲与特异性高低的关系不大。特别性是由检测手段的内在因素决定的。,决定基因检测的特异性的因素有以下几个：,1）待测目的基因的特异性。,首先，,生物体有一个完整的基因组，基因组内有各种基因，各有其功能，有些基因在同种、属的不同型和株之间有很高的同源性，甚至是完全相同的；而有些基因在不同种、属之间的同源性也很高，因此我们在选择待测基因时应避开这些基因；,其次，,基因的保守性也很重要，选择非保守区基因极易产生假阴性；,最后，,即使是在保守区，也还存在保守程度的问题。,基因诊断,3、 特异性基因诊断,31,2）引物质量。这主要针对PCR技术而言。保证引物质量的主要因素之一，是保证其与基因扩增片段上的引物区完全结合，而且与基因组序列其他区域的同源性不得超过70%；其他比较重要的因素有引物的Tm值、引物长度，形成发夹结构和引物二聚体的能量值。第三，探针的制备。这是针对杂交技术而的。如果是寡核苷核探针,其设计要求基本同引物.制备较长探针时除了要考虑第一因素外，还要考虑标记物的选择，比如不宜选择生物素标记探针作原位杂交，因为组织细胞中含有大量生物素，去除困难。第四，标本的准备。标本中的抑制物会干扰检测结果，造成假阳性或假阴性。第五，检测条件是否优化。这里不是指实验室条件，面是指检测试剂的组合、各种试剂最佳浓度的选择、杂交或扩增温度的优化、杂交或扩增时间的确定等。,基因诊断,2）引物质量。这主要针对PCR技术而言。保证引物质量,32,4、 可重复性,它与精确性有关，但又不是完全由精确性所决定，因为可重复性的好坏牵涉到技术难度的问题。比如杂交法，看似简单，尤其是微反应板杂交，操作过程与酶联免疫技术相似，但难度要比酶联免疫技术大得多，检测者必须有一定的技术，至少原来对酶联免疫技术的检测过程比较熟悉，否则应当经过培训。PCR技术，尤其是逆转录PCR技术的应用，新手很容易失败。,基因诊断,4、 可重复性基因诊断,33,谢谢你的阅读,知识就是财富,丰富你的人生,71,、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。,康德,72,、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。,西塞罗,73,、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。,伏尔泰,74,、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。,屈原,75,、内外相应，言行相称。,韩非,谢谢你的阅读知识就是财富71、既然我已经踏上这条道路，那么，,34,