抗真菌药敏试验及结果判读课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,4/25/2010,#,抗真菌药敏试验及结果判读,主讲人：刘伟,北京大学第一医院皮肤性病科真菌室,国家皮肤与免疫疾病临床研究中心,北京大学真菌和真菌病研究中心,抗真菌药敏试验及结果判读主讲人：刘伟北京大学第一医院皮肤性病,1,北京大学第一医院,教授、博士生导师,皮肤病分子诊断北京市重点实验,室副主任,教育部新世纪优秀人才,XXX,主任医师/副主任医师/主治医师,刘伟,主任医师,北京大学第一医院XXX刘伟,2,01,02,04,03,目,录,05,抗真菌药敏试验及意义,纸片扩散法,E-test,法,液基稀释法,临床意义,010203目抗真菌药敏试验及意义纸片扩散法,3,抗真菌药敏试验及意义,01,抗真菌药敏试验及意义01,4,抗真菌药敏试验及意义,定义,是测定抗真菌药物对病原真菌的最低抑菌浓度（MIC）-可抑制病原真菌生长,的最低药物浓度，和最低杀菌浓度（MFC）-可杀死真菌的最低药物浓度，及,最低有效浓度（MEC）-出现有效抑制作用的最低药物浓度，的体外试验方法,意义,监测临床病原真菌对不同抗真菌药物的体外敏感性，对于,已有药,物,指导临床用药的选择，发现新型耐药株,评价新型抗真菌药物的体外抗菌活性，开发,新药,种类,纸片扩散法、E-test法、液剂稀释法,抗真菌药敏试验及意义 定义 是测定抗真菌药物对病原真菌,5,抗真菌药物分类及作用机制,作用靶点为麦角固醇,(细胞膜),多烯类-,Drug-ergosterol,interaction,Amphotericin,B,nystatin,唑类-,Inhibition,of,ergosterol,synthesis,Imidazoles:,Triazoles:,丙烯胺类-,Inhibition,of,ergosterol,synthesis,Terbinafine,butenafine,吗啉类-,Inhibition,of,ergosterol,synthesis,作用靶点为细胞壁,棘白菌素类-抑制匍聚糖合成,Echinocandins,肽-核苷类抑制几丁质合成,Nikkomycin,Z,嘧啶类干扰核酸合成,Flucytosine,其它类,Sordarins,azasordarins,Griseofulvin,Amorolfine,Canuto,et,al.,The,Lancet,Infect,Dis,2002;,2:,550,抗真菌药物分类及作用机制作用靶点为麦角固醇(细胞膜),6,纸片扩散法,02,纸片扩散法02,7,纸片扩散法,临床实验室标准研究所（Clinical,laboratory,standard,institute，CLSI）,M44-A,Tested,Drug：FLC，VRC,Media：Mueller-Hinton,agar,+,2%dextrose,+,0.5ug/ml,methylene,blue,Quality,control：C.albicans,ATCC,90028，C.parapsilosis,ATCC,22019，,C.tropicalis,ATCC,750，C.krusei,ATCC,6258,质控,以ATCC,22019为例,FLC：25ug，22-23mm,VRC:,1ug，28-37mm,纸片扩散法 临床实验室标准研究所（Clinical lab,8,纸片扩散法,临床实验室标准研究所,（Clinical,laboratory,standard,institute，CLSI）,M44-A,操作,用无菌生理盐水制备菌悬液，调整菌悬液浓度（1-5,10,6,CFU/mL,）后用棉签沾,取菌液，均匀沿3个方向涂布；室温下放置15分钟待干燥后将药片紧密压在培养,基上，于35下孵育18-24小时，测量抑菌圈直径，据以确定药敏,结果（mm）和判读折点,Sus,S-DD,Res,VRC,=17,14-16,=19,15-18,=1714-16,9,E-test,法,03,E-test法03,10,E-test法,是将不同量的抗真菌药物包被在商品化的特殊试剂,条上进行测定的方法,Tested,Drug：FLC，ITC，VRC，CAS，,AMB等,Media：,PMI,1640,+,MOPS+2%,glucose,+1.5%,Bacto琼脂,Quality,control,E-test法 是将不同量的抗真菌药物包被在商品化的特殊试,11,E-test法,操作,用无菌生理盐水覆盖生长良好的菌落后，吸取菌悬液，调整菌悬液浓度，用,无菌棉签沾取菌悬液，均匀沿3个方向涂布于平板上，将琼脂板在生物安全,柜中室温放置15分钟，待其表面干燥；用无菌镊子将真菌药敏条置于平皿上，,不再移动；然后置于35下孵育，其中念珠菌孵育24-48小时、新生隐球菌,48-72小时、曲霉及根霉18-24小时、镰刀菌24-48小时后移至室温24-48小,时；每天检查抑菌圈，读取结果,E-test法 操作用无菌生理盐水覆盖生长良好的菌落后，吸,12,液基稀释法,04,液基稀释法04,13,液基稀释法,临床实验室标准研究所（Clinical,laboratory,standard,institute，CLSI）,方案,国内于1994年及时引进并推广应用，对于酵母菌的M27-P，T，A，A2方案，分为,试管法和微量法，以后者为主,对于丝状菌，,2002年问世，试管法和微量法，后者为主,Medium，inoculation，incubation，终点判读均统一规定,质量控制：,C.,albicans,ATCC,90028、,C.,parapsilosis,ATCC,22019、,C.,tropicalis,ATCC,750、,C.,krusei,ATCC,6258,等,意义：保证操作方法尽可能标准化,液基稀释法 临床实验室标准研究所（Clinical lab,14,液基稀释法操作,药液制备,培养基：,RPMI,1640,液基（含MOPS，pH7.0）,水溶性药物：如FLC，蒸馏水制备储存液,先称量，制备20倍于最高药敏试验浓度的药液（如1280）；然后以RPMI1640稀释，,分别获得10倍于各个浓度的药液（640），进一步以RPMI1640分别稀释5倍后，接种,于药敏板,非水溶性药物：如ITC等，DMSO制备储存液，浓度不超过1%,先称量，制备100倍于最高药敏试验浓度的药液（如1600）；然后以DMSO稀释，,分别获得100倍于各个浓度的药液（800，400），进一步以RPMI1640分别稀释50倍,后，接种于药敏板,液基稀释法操作 药液制备 培养基：RPMI 1640,15,液基稀释法操作,菌悬液制备,酵母菌：,35度，PDA或SDA孵育24-48h,丝状菌：曲霉，波氏，孢子丝菌等，35度，PDA孵育7天；镰刀菌，,35度，PDA孵,育48-72h,继续在25度孵育7天-以保证菌的纯度和活力,以生理盐水制备悬液，到0.5McFarland或计数到1-5X10,6,CFU/ml;,进一步稀释100,倍（丝状菌，,0.5-2.5X10,4,CFU/ml,）或1000倍（酵母菌，0.5-2.5X10,3,CFU/ml）,液基稀释法操作 菌悬液制备 酵母菌：35度，PDA,16,液基稀释法结果,MIC:,与生长对照管比较，生长受抑管的最低药物浓度即为MIC值,不同的药物有不同的判读标准,-AmB:,典型，容易判断，100%受抑为标准,-Azoles,and,5-FC:,终点常不清楚，以50%（M27-A2），或100%（M38-,A中ITC）受抑为标准,MFC：Minimal,fungalcidal,concentration,MEC：minimal,effective,concentration,对照：,生长对照：,不生长对照：,液基稀释法结果 MIC:与生长对照管比较，生长受抑管的,17,MIC（g/ml）,敏感,S,剂量依赖性敏感,SDD,中介,I,耐药,R,FLC,=8,ITC*,=1,VRC,=1,CAS,=1,MCFG,=1,ANDFG,=1,液基稀释法结果判读折点,白念珠菌,热带念珠菌及近平滑念珠菌(24h),近平滑念珠菌的棘白菌素类药物判读折点:,=8,resistant,MIC（g/ml）敏感剂量依赖性敏感中介耐药FLC16,8,1,TR34/L98H,1,14,-,21,-8-,31,-8-,6-8-10-20,t02,4787-2,16,2,1,297T/F495I,TR34/L98H/,S,2,23-23-8-29-8-,6-8-10-20,t02,耐三唑类的烟曲霉混合感染,检测到耐药菌株应该更换抗真菌药物治疗,女性，10岁，急淋，在化疗过程中出现高热；给予头孢匹胺等抗,27,感谢聆听,感谢聆听,28,