实验一质粒DNA提取及检测

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验一,质粒,DNA,的提取及检测,1,质粒,（,plasmid,）,是染色体外小型（1-200,kb）,的共价、闭合、环状的双链,DNA,分子（,cccDNA），,能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。,常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等,质粒的复制：严紧型复制（,1,n,个,）,松弛型复制（,20,个以上）,2,常用的质粒载体,是通过,DNA,重组技术构建而成的。,pUC18, pUC19,3,质粒提取的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量,DNA,要去除的物质：,蛋白,基因组,DNA,脂类及小分子杂质,RNA,4,第一部分质粒,DNA,的提取,5,一目的,了解提取质粒的原理。,学习和掌握质粒提取的方法和技术。,细菌的生长和质粒的扩增,菌体的收集裂解及质粒,DNA,的分离,质粒,DNA,的纯化,6,二原理,碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：,在,pH 12.0-12.6,碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体,DNA,变性，而共价闭环质粒,DNA,仍为自然状态；,将,pH,调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体,DNA,之间交联形成不溶性网状结构，大部分,DNA,和蛋白质在去污剂,SDS,的作用下形成沉淀，而质粒,DNA,仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体,DNA,、,RNA,及蛋白质，质粒,DNA,尚在上清中，,再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒,DNA,（可省略）,。,7,原理示意图,返回目录,返回原理,8,三、实验仪器、材料与试剂,（一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅,（二）材料：含,pUC18,（或其他）质粒的大肠杆菌、,（三）试剂：,LB,培养基（液体、固体）,溶液,I,溶液,II,溶液,III,TE(pH8.0),9,溶液,I,50 mmol/L,葡萄糖,/1mg/mL,溶菌酶,25 mmol/L TrisCl (pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0),在,10 lbf/in,2,(6.89510,4,Pa),高压下蒸汽灭菌,15,分钟，保存于,4,。,作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活,10,溶液,II,0.2 mol/ L NaOH(,从,5mol/L,贮存液中现用稀释,),1% SDS,作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。,11,溶液,III,5mol/L,乙酸钾,60ml,冰乙酸,11.5ml,水,28.5ml,所配成的溶液中钾的浓度为,3mol/L,，乙酸根的浓度为,5mol/L,。,作用：酸性条件下质粒,DNA,复性，变性蛋白,-SDS,线性,DNA,沉淀，,K,可中和,DNA,12,TE(pH8.0),10 mmol/L TrisCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0),RNA,酶（降解,RNA,）,作用：稳定,13,特点：小量质粒制备、最简便、快捷,应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）,测序、转染（细提）,质粒提取试剂盒,常用方法：小量碱裂解法,满足不同需要的试剂盒,纯化原理：离子交换柱层析等,小量制备质粒,kit,大量制备质粒,kit,去除内毒素制备质粒,kit,可用于大部分分生实验,14,四、实验步骤,接含,pUC18(,或,pET21a),质粒的单菌落于3,ml LB Amp,+,液体培养基中,37,0,C，190rpm,振荡培养过夜,取,1.5,ml,菌液入,1.5,ml,的离心管中,6000,rpm、,离心2,min，,弃上清，收集菌体,100,uL,溶液,I,悬浮菌体（,充分振荡,），室温10,min,加入,200,uL,溶液,II,（,轻轻混匀,），冰上静置5,min,裂解菌体,15,加入,150,uL,溶液,III,（,轻轻混匀,），冰上静置15,min,质粒,DNA,复性,12000,rpm，,离心15,min，,取上清,记录体积,到一新管,上清加等体积的酚：氯仿（,振荡混匀,）,12000,rpm，,离心15,min，,取上清记录体积到一新管,16,上清加2倍体积的无水乙醇（,充分混匀,），冰浴,30min,12000,rpm，,离心15,min,沉淀用75%乙醇1,mL,洗涤两次（,轻弹混匀、离心,）,12000,rpm，,离心10,min,晾干沉淀,沉淀用20,ul TE,溶解,沉淀法,17,吸附管用,BL 500ul,平衡,取上清加入吸附管,5000rpm,离心,5min,加,PW,漂洗液,500ul,，放置,2min,10000rpm,离心,5min,，晾干,加,3,0,ul TE,，,10000rpm,离心,5min,（收集到干净的,EP,管中）,吸附法,18,第二部分琼脂糖凝胶电泳,19,相关知识,电泳：泳动速度决定于？,琼脂糖凝胶,天然琼脂（,Agar）,是一种多聚糖，主要由琼脂糖（,Agarose ，,约占80）及琼脂胶（,Agaropectin）,组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收,，,因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,20,琼脂糖凝胶浓度与线性,DNA,分辨范围,21,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型,DNA,的移动速度依次为：共价闭环超螺旋,DNA（cccDNA）,直线,DNA（LDNA，2,条链发生断裂）开环的双链环状,DNA（ocDNA，1,条链发生断裂）,。,22,影响迁移率的因素,DNA,分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、,DNA,的构象、所加电压（一般5,V/cm,）,、,电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。,23,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测,DNA,的方法和技术。,24,二、实验原理,DNA,在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。,核酸为两性分子，在,pH3.5,时，整个分子带正电,pH8,左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。,在碱性环境下，相同碱基数量的双链,DNA,几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的,DNA,片段泳动速度不一样，可进行分离。,DNA,分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。,可以分离相对分子质量相同，但构型不同的,DNA,分子。,共价闭环超螺旋,DNA,（,cccDNA,）,直线,DNA,（,LDNA,，,2,条链发生断裂）开环的双链环状,DNA,（,ocDNA,，,1,条链发生断裂）。,25,质粒的电泳,质粒,DNA,的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环,质粒,DNA,的存在形式有3种:,1,、,共价闭环,DNA,:,常以超螺旋形式存在,2,、,开环,DNA,:,质粒,DNA,两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子,3,、,线性,DNA,:,因质粒,DNA,的两条链在同一处断裂而造成.,开环,超螺旋,线性,26,三、,仪器、材料与试剂,（一）仪器：稳流稳压电泳仪,（二）材料,1.自已提取的质粒,DNA,2.相对分子质量标准品,（三）试剂,15,TBE,储液,(pH8.0),使用时稀释 10倍，成,1TBE,。,2凝胶加样缓冲液（,loading buffer,）,3.,1%,琼脂糖,4. 10,mg/ml,溴化乙锭溶液（,EB），4,保存。用时稀释成,5,ug/ml,的,EB。,27,四操作步骤,琼脂糖（,1%,）凝胶电泳,称取一定量琼脂糖凝胶，按,1g,中,100ml,的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约,2min,，使琼脂糖溶解；,溶液冷至,60 ,，加入,EB,至终浓度为,0.5,g/ml,，混匀，注意戴手套操作；,将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为,0.3-0.5cm,，迅速插上梳子，检查有无气泡；,待凝胶完全凝固后（约,30min,），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳,buffer,，让液面高出胶面,1mm,；,在,DNA,样品（,20ul,）中加入,6 loading buffer,（,4ul,），混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压,100V,；,根据指示剂的位置，判断是否终止电泳,;,在紫外灯下凝胶成像仪上观察电泳结果。,28,五、实验结果与讨论,根据观察结果，绘图。,分析自提质粒的情况。,29,图,1,的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品,RNA,去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图,2,的结果较好。,30,六,注意事项,为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：,加入溶液,I,后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；,加溶液,II,裂解要完全,(,快速轻柔颠倒,510,次,),，使蛋白质和核酸变性；,加溶液,III,后,pH,要达到中性,(,轻柔振荡,510,次,),，使质粒,DNA,复性，这样才能使质粒,DNA,与染色体,DNA,完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。,31,