肌营养不良症与遗传优秀案例课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,肌营养不良症与遗传,肌营养不良症与遗传,1,优选肌营养不良症与遗传,2024/8/9,优选肌营养不良症与遗传2023/8/2,2,Dystrophie musculaire de Duchenne,DMD,，,杜氏肌营养不良，,假肥大型肌营养不良,Dystrophine（,Dys,）抗肌萎缩蛋白 缺失,Maladie monogenique,Htdit:XR,Duchenne,un neurologiste,franais,a donn une description complte de 13 maladies attaints,Dystrophie musculaire de Duche,3,Phnotype Clinique de la DMD,Les muscles jumeaux des jambs des,garons atteints apparaissent quils soient dvelopps,Mais asthniques,假性肌肥大,Tissu conjonctif et la graisse,Phnotype Clinique de la DMDLe,4,Phnotype Clinique de la DMD,1,2,ans normal,3 5 ans dveloppe une faiblesse musculaire,Ds lge de 12 ans confin en chaise roulant,Au-del de lge de 20 ans ne survivra,QI,智商,une chute modr denviron 20 points,Phnotype Clinique de la DMD1,5,Lab,Cratine kinase(niveau srique),血清浓度,50 100 fois la limite suprieure de la normale,dans les stades prcoces,Lab,6,Dystrophie musculaire de Becker,le gne de la dystrophie,Beaucoup plus attnu,缓和,Aprs lge de 16 ans parvient marcher,之后多年也可行走,Dystrophie musculaire de Becke,7,DMD,与,BMD,的差异,DMD,致死,BMD,存活率非常高,(70%),易产生 新的突变,DMD与BMD的差异DMD致死,8,PCR产物用PCR仪进行分析，DNA片段的缺失重复以及拷贝数以测序仪得到信号的有无及信号的峰高或面积进行计算,女性携带者正常x染色体的屏蔽效应，无法检出,随着流动相中乙腈浓度(离子对洗脱液的比值)的增加，DNATEAA与柱基质的疏水作用力逐渐减弱，最终被洗脱下来,药物治疗（对症治疗）：糖皮质激素治疗,P型：小脑蒲肯野细胞,在骨骼肌也有极少量的表达,由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，60%-70%可以直接通过southern印迹杂交技术或者PCR技术来测量胎儿的DNA得到,（2）父母都无病时，女儿则不会发病，儿子可能发病；,12 ans normal,BMD患者：可能缺失了一个或者几个基因序列,7 个组织特异性的启动子,Htdit:XR,3、由于DMD基因很大，需要6到8个cDNA探针，杂交反应才能覆盖整个DMD基因，要12周时间用来分析，劳动量大,Aprs lge de 16 ans parvient marcher,第二，一些家庭的一些成员的样本丢失了,（2）父母都无病时，女儿则不会发病，儿子可能发病；,90%携带者孕妇中产前诊断可能有至少95%的精确度,可直接检出DMDBMD的缺失型突变,Maladie monogenique,遗传,PCR产物用PCR仪进行分析，DNA片段的缺失重复以及拷贝,9,遗传特征,Htdit:XR,亲代,生殖细胞,子代,X,H,X,h,Y,X,H,X,H,X,h,Y,X,H,X,H,X,H,X,H,X,h,Y,X,H,Y,X,h,正常女性,正常男性,女性携带者,男性患者,遗传特征Htdit:XR亲代生殖细胞子代XH Xh,10,遗传特征,（,1,）系谱中常常只有男性患者,（,2,）父母都无病时，女儿则不会发病，儿子可能发病；,（,3,）由于交叉遗传，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常为本病患者；,（,4,）由于男性患者的子女都正常，故可见隔代遗传；,（,5,）女性患者的父亲一定是患者,母亲一定是携带者。,遗传特征（1）系谱中常常只有男性患者,11,DMD,男女差异,男性致死,1/3 nomutation,2/3 mre porteuse,女性携带者,Majorit,无任何临床表现，,70%,肌酸激酶,(Cratine kinase),增高,8%,轻微的肌肉症状,有些还有严重的近心端肌肉障碍。,女性很少患有,DMD,DMD 男女差异男性致死,12,母系镶嵌,某男性是家族中,DMD,的先证者,他的母亲没有携带突变基因,遗传位点上发生了新近的突变,大约,5%-15%,的这些发生的例子是由于母系生殖镶嵌,母系镶嵌某男性是家族中DMD的先证者,13,DMD,发病率较高,Garons nouveau-ns,：,1/3300,Un taux de mutation,：,1/10000,每天一个男性每,11-12,秒会产生,1,个新突变的精子（,8 x 10,7,par jour,）,DMD 发病率较高Garons nouveau-ns,14,基因与蛋白,基因与蛋白,15,灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷,占X 染色体全长的1.,multiplex probe ligation dependent amplification,生物化学检查CK血清浓度,Duchenne,un neurologiste franais,a donn une description complte de 13 maladies attaints,女性携带者正常x染色体的屏蔽效应，无法检出,99%的序列由内含子组成,（2）父母都无病时，女儿则不会发病，儿子可能发病；,Phnotype Clinique de la DMD,dystrophine蛋白的特点,BMD患者：可能缺失了一个或者几个基因序列,DMD 发病率较高,药物治疗（对症治疗）：糖皮质激素治疗,生物化学检查CK血清浓度,Maladie monogenique,Aprs lge de 16 ans parvient marcher,由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，60%-70%可以直接通过southern印迹杂交技术或者PCR技术来测量胎儿的DNA得到,其mRNA 序列长114 kb,B 型：大脑皮层、海马回神经元,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数,Gne DMD,人类最大的基因之一，,2300 kb,位于,X,p,占,X,染色体全长的,1.5%,99%,的序列由内含子组成,编码区包括,79,个外显子及,7,个组织特异性的启动子,其,mRNA,序列长,114 kb,主要表达于骨骼肌、心肌，少量表达于脑组织,灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷Gne DMD人类,16,7,个组织特异性的启动子,B(,脑皮质,),、,M(,肌组织,),、,P(,蒲肯野纤维,),、,R(,视网膜,),、,B3(,脑组织,),、,S(,施旺细胞,),和,G(,肌组织之外的多种组织器官,),B,型：大脑皮层、海马回神经元,P,型：小脑蒲肯野细胞,在骨骼肌也有极少量的表达,M,型：骨骼肌、心肌组织,同时在脑神经胶质细胞也有少量表达,7 个组织特异性的启动子,B(脑皮质)、M(肌组织),17,Dystrophin,抗肌萎缩蛋白,全长型,dystrophin,是一种,427 kDa,的棒状蛋白,长约,150 nm,分为,4,个区域，,氨基端区域,中央棒状区,富含半胱氨酸区域,羧基端区域,Dystrophin 抗肌萎缩蛋白全长型dystrophin,18,A.,位于,Xp21,黑色的竖线代表分布于整个基因上的,79,个外显子,黑色箭头指示各组织特异性启动子不同的启动位点,分别以不同的字母缩写来代表,B(,脑皮质,),、,M(,肌组织,),、,P(,蒲肯野纤维,),、,R(,视网膜,),、,B3(,脑组织,),、,S(,施旺细胞,),和,G(,肌组织之外的多种组织器官,),。,B.,不同形式的,dystrophin,蛋白及其区域组成,氨基端、中央棒状区域、富含半胱氨酸区域及羧基端区域,A.位于Xp21,黑色的竖线代表分布于整个基因上的79,19,DMD,患者：,60%,基因突变表现为缺失,一般在基因的,5,端和中央棒区两个区域,BMD,患者：可能缺失了一个或者几个基因序列,dystrophine,蛋白的特点,DMD,患者体内很少或者没有,BMD,患者体内有表达，但是仍然比正常人少,DMD患者：60%基因突变表现为缺失,20,肌营养不良症与遗传优秀案例课件,21,临床治疗,临床治疗,22,DMD,治疗,目前为止尚无治疗,DMD,的有效方法,药物治疗（对症治疗）：糖皮质激素治疗,短期口服激素治疗可增强骨骼肌力量和功能，并可能在更长时间内稳定骨骼肌力量和功能,基因治疗：利用不直接引起人类疾病，免疫原性较小的腺相关病毒（,AAV,）为载体，导入人工剪裁的,Dys,基因,修正肌肉组织,(,占全身体重,40,),的基因缺陷遇到各种各样的困难,康复治疗、矫形治疗、社会心理治疗等,DMD治疗目前为止尚无治疗DMD的有效方法,23,临床检测,临床检测,24,产前诊断和杂合子诊断,90%,携带者孕妇中产前诊断可能有至少,95%,的精确度,由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，,60%-70%,可以直接通过,southern,印迹杂交技术或者,PCR,技术来测量胎儿的,DNA,得到,在其余的基因缺失不能明确诊断出来的家庭中，可以通过键的标记来完成产前诊断,与患病男性结婚的女性中,75%,的女性：,DNA,检查、,CK,血清浓度检查,胎儿是否携带,25%,女性难检测：,第一，在病程的一些时期，基因缺陷是无法被检查出来的（可能情况就是等位基因是正常的或者突变的等位基因位于另外一条,X,染色体上）,第二，一些家庭的一些成员的样本丢失了,第三，两个标记基因之间的基因重组在,X,染色体传入下一代之前发生了（母系镶嵌）,产前诊断和杂合子诊断90%携带者孕妇中产前诊断可能有至少95,25,产前检测,生物化学检查,CK,血清浓度,基因诊断,多重,PCR,Southern blot,探针连接多重扩增,(MLPA),变性高效液相色谱,(DHPLC),抗肌萎缩蛋白的免疫组化,产前检测生物化学检查CK血清浓度,26,多重,PCR,方法,DMD,、,BMD,相关基因的缺失、重复,可直接检出,DMD,BMD,的缺失型突变,65,的患者为基因缺失所致,多重,PCR:,使用多对引物的,针对,DMD,基因的缺失热区，利用多对,PCR,引物在一个,PCR,管中同时扩增多个外显子，通过和正常对照相比较而判断外显子的缺失情况,多重PCR方法DMD、BMD相关基因的缺失、重复可直接检,27,多重,PCR,方法,优点：,1,、具有敏感、特异性强和可重复性好的优点,2,、需要的,DNA,量少、操作简单,局限性,:,1.,女性携带者,正常,x,染色体的屏蔽效应，无法检出,2.,多重,PCR,体系内，由于引物之间的相互竞争，有时也会出现个别片段扩增的假阴性结果。（对初次扩增呈阴性结果的片段进行再次扩增，以验证结果的准确性）,多重PCR方法优点：,28,Htdit:XR,灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷,dystrophine蛋白的特点,与患病男性结婚的女性中,（3）由于交叉遗传，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常为本病患者；,第二，一些家庭的一些成员的样本丢失了,90%携带者孕妇中产前诊断可能有至少95%的精确度,（3）由于交叉遗传，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常为本病患者；,短期口服激素治疗可增强骨骼肌力量和功能，并可能在更长时间内稳定骨骼肌力量和功能,由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，60%-70%可以直接通过southern印迹杂交技术或者PCR技术来测量胎儿的DNA得到,Cratine kinase(niveau srique)血清浓度,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数,P型：小脑蒲肯野细胞,在骨骼肌也有极少量的表达,Dystrophine（Dys）抗肌萎缩蛋白 缺失,将待测的DNA样品固定在固相载体(硝酸纤维膜或尼龙膜)上,其mRNA 序列长114 kb,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数,8%轻微的肌肉症状,有些还有严重的近心端肌肉障碍。,2、Soutllem杂交不能确定缺失的准确外显子范围，对检测女性重复突变(duplication)或三重重复(triplication)携带者存在困难,Ds lge de 12 ans confin en chaise roulant,与患病男性结婚的女性中,Southern blot,方法,DMD,、,BMD,相关基因的缺失、重复,是一种常用的,DNA,定量的分子生物学方法,原理,将待测的,DNA,样品固定在固相载体,(,硝酸纤维膜或尼龙膜,),上,与同位素标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相,DNA,的位置上显示出杂交信号,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数,Htdit:XRSouthern blot方法D,29,Southern blot,方法,优点：,Southern,杂交准确性高、特异性强,缺点：,1,、不经过靶片段的扩增,(PCR),，一般每个电泳通道需要,1030g,的,DNA,，在实际操作中就需较大量的,DNA,样品,2,、,Soutllem,杂交不能确定缺失的准确外显子范围，对检测女性重复突变,(duplication),或三重重复,(triplication),携带者存在困难,3,、由于,DMD,基因很大，需要,6,到,8,个,cDNA,探针，杂交反应才能覆盖整个,DMD,基因，要,1,2,周时间用来分析，劳动量大,4,、需要使用放射性同位素作为示踪物，会对工作环境带来污染,Southern blot方法优点：Southern杂交准确,30,多重探针连接依赖性扩增技术,MLPA,multiplex probe ligation dependent amplification,原理,针对所有需要检测突变的,DNA,序列，设计多对特异探针,固定在尼龙膜上,和待测样品,DNA,杂交然后洗膜（正常序列和探针杂交后不被洗脱）,利用连接酶把探针连接起来,使用一套通用引物进行,PCR,扩增,PCR,产物用,PCR,仪进行分析，,DNA,片段的缺失重复以及拷贝数以测序仪得到信号的有无及信号的峰高或面积进行计算,多重探针连接依赖性扩增技术 MLPAmultiplex p,31,优点：,可以在,1,个,PCR,管中完成多达,40,个外显子的缺失重复检测,专门用于,DMD,缺失重复检测的试剂盒，通过,2,个,PCR,反应就可以完成,79,个外显子及其非翻译序列的缺失重复突变筛查,灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷,优点：,32,DMD,患者,(A),及其母亲,(B),的,20-47,号外显子的,MLPA,检测结果,DMD患者(A)及其母亲(B)的20-47号外显子的MLPA,33,变性高效液相色谱,DHPLC,denaturing high performance liquid chromatography,原理,用离子对逆向层析法分离并检测异源双链,通过三乙基醋酸钠（,TEAA),作为桥分子，带正电的氨基与核酸分子带负电电荷的磷酸基相互作用，烷基端与色谱柱基质表面的疏水基团相连,不同大小的,DNA,片段所含的磷酸根数目不同，与固定相的结合力不同,随着流动相中乙腈浓度,(,离子对洗脱液的比值,),的增加，,DNA,TEAA,与柱基质的疏水作用力逐渐减弱，最终被洗脱下来,检测柱洗脱液在,260 nm,处的吸光度，样品中各成分在色谱图中显示为不同的吸收峰,优点,:,灵敏度高、分析快捷以及可以进行半自动化分析,变性高效液相色谱 DHPLCdenaturing high,34,生物化学检查CK血清浓度,50 100 fois la limite suprieure de la normale,2、Soutllem杂交不能确定缺失的准确外显子范围，对检测女性重复突变(duplication)或三重重复(triplication)携带者存在困难,Mais asthniques,Au-del de lge de 20 ans ne survivra,Duchenne,un neurologiste franais,a donn une description complte de 13 maladies attaints,灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷,可直接检出DMDBMD的缺失型突变,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数,多重PCR体系内，由于引物之间的相互竞争，有时也会出现个别片段扩增的假阴性结果。,BMD存活率非常高(70%),易产生 新的突变,P型：小脑蒲肯野细胞,在骨骼肌也有极少量的表达,12 ans normal,B(脑皮质)、M(肌组织)、P(蒲肯野纤维)、R(视网膜)、B3(脑组织)、S(施旺细胞)和G(肌组织之外的多种组织器官),Aprs lge de 16 ans parvient marcher,Htdit:XR,占X 染色体全长的1.,Cratine kinase(niveau srique)血清浓度,生物化学检查CK血清浓度,35,