液相色谱基础理论课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,PPT课件,*,液相色谱原理应用,尚 飞,1,PPT课件,液相色谱原理应用尚 飞1PPT课件,液相色谱基础知识部分,液相色谱简介,液相色谱理论基础,2,PPT课件,液相色谱基础知识部分2PPT课件,高效液相色谱简介,3,PPT课件,高效液相色谱简介3PPT课件,色谱的发明人,俄国科学家：,M.,S.,Tswett,正式命名“色谱”的文献,4,PPT课件,色谱的发明人4PPT课件,经典液相色谱,Review,Stop,叶绿素,中的有,色物质,石油醚,淋洗剂,叶绿素,碳酸钙,颗粒,5,PPT课件,经典液相色谱Review石油醚5PPT课件,色谱法简介,色谱法（,Chromatography,）溯源,俄国科学家,1903,年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离,植物色素的新方法并见诸于俄文的文献,1906,年正式命名（见诸文献）,色谱法；,Chromatography,50,年代开始广泛研究和应用,主要是气相色谱及薄层色谱,高效液相色谱法的广泛应用始于,70,年代,6,PPT课件,色谱法简介6PPT课件,什么是高效液相色谱,High,Performance,Liquid,Chromatography,高效液相色谱法，简称：,HPLC,是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段：,高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器,在技术，理论及应用上处于迅速发展阶段,7,PPT课件,什么是高效液相色谱7PPT课件,应用领域,食品、,饮,料,化,工,生物技,术,、医,药,环,境,应用领域,8,PPT课件,应用领域食品、饮料化工生物技术、医药环境应用领域8PPT课件,HPLC,技术的发展趋势,高速化、高效化,高精度的高压泵、能走梯度洗脱；,高灵敏度的检测器、紫外,/,可见光检测器,二极管阵列检测器（,DAD,）,，荧光检测器，电喷雾检测器（,CAD,）以及示差、蒸发光散射检测,器等。,微粒硅胶为,LC,发展奠定了基础，现在的填料粒度大多为,10m,、,5,m,甚至,3,m,、亚,2,m,，填料的微粒化产生了快速柱，微粒柱提高,了分离效率和分析速度。,键合相填料的出现拓宽了,LC,在多领域的实用能力。,微径柱，毛细管柱，,Nano,柱提高灵敏度和分离效率,特种柱，专用柱增强了色谱分离的选择性,9,PPT课件,HPLC技术的发展趋势9PPT课件,HPLC,技术的发展趋势,自动化、智能化,由色谱工作站单点控制泵、自动进样器、检测器的操作程序并作色谱,数据处理和光谱信息处理，从而实现,24,小时无人操作。,二极管阵列检测器的作用可在色谱分析的同时作光谱确认,HPLC,与质谱仪的联用技术,10,PPT课件,HPLC技术的发展趋势10PPT课件,液相色谱系统：总体设计,泵（含脱气机）,自动进样器,色谱柱（放于柱温箱中）,检测器,系统控制软件（电脑）,控制软件,泵,自动进样器,色谱柱,检测器,11,PPT课件,液相色谱系统：总体设计泵（含脱气机）控制软件泵自动进样器色,Thermo UltiMate,3000,仪器配置,梯度泵,独特的柱温箱可放置两个柱,切换阀,脱气机和溶剂架,带温控选项的自动,进样器,可变波长或二极管矩阵,紫外可见光检测器,12,PPT课件,Thermo UltiMate 3000仪器配置脱气机和溶剂,高效液相色谱基础理论,13,PPT课件,高效液相色谱基础理论13PPT课件,色谱分离过程,流动相,色谱柱,流动相流动方向,色谱分离过程,固定相,固定相根据不同的相互作用原理和强度保留分析物,由于不同化合物与固定相和流动相之间的相互作用强度和机理不同，所以当,化合物流经色谱柱时就会被分分开。,14,PPT课件,色谱分离过程流动相色谱柱流动相流动方向固定相根据不同的相互,363,1,-,5,573,2,-,6,8,863,3,-,8,4,-,12,930,液相色谱图简介,600,140,0,1-Parabene_Summit_0710,2-Parabene_Summit_0710,mAU,UV_VIS_,Pump_Press,bar,Parabene,isocratic,70B,Sum,Parabene,isocratic,70B,Sum,保留时间,检测器信号,峰高,压力信号及,波动,100,500,400,300,200,130,0,120,0,110,0,峰面积,-50,90,0,100,0,min,1,2,Methanol:,70,0,%,Flow:,0,50,ml/min,%D:,0,0,%,%C:,0,0,%,基线,0,0,1,0,2,0,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8,0,9,0,10,0,11,0,12,0,13,0,14,0,15,0,15,色谱图：即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间,的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。,15,PPT课件,363 1-5,573 2-68,863 3-8,基础理论：术语介绍,色谱峰,Peak,色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线,峰底,Peak,Base,峰的起点与终点之间连接的直线,峰高,Peak,Height,峰最大值到峰底的距离,峰宽,Peak,Width,在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离,半（高）峰宽,Peak,Width,at,Half,Height,通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距,离,16,PPT课件,基础理论：术语介绍16PPT课件,基础理论：术语介绍,峰面积,Peak,Area,峰与峰底之间的面积,又称响应值,标准偏差；,Standard,Error,0.607,倍峰高处所对应峰宽的一半,拖尾峰,Tailing,Peak,后沿较前沿平缓的不对称峰,前伸峰,Leading,Peak,前沿较后沿平缓的不对称峰,鬼峰,Ghost,Peak,并非由试样所产生的峰；亦称假峰,17,PPT课件,基础理论：术语介绍17PPT课件,基础理论：术语介绍,基线,Baseline,在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线,基线飘移,Baseline,Drift,基线随时间定向的缓慢变化,基线噪声；,N,Baseline,Noise,由各种因素所引起的基线波动,谱带扩展,Band,Broadening,由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中,谱带宽度增加的现象,18,PPT课件,基础理论：术语介绍18PPT课件,基础理论：术语介绍,死时间，,t0,Dead,time,不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间,保留时间，,tR,Retention,time,组分从进样到出现峰最大值所需的时间,调整保留时间，,tR,Adjust,retention,time,保留时间减去死时间,死体积，,V0,Dead,volume,不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,保留体积，,VR,Retention,volume,组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,调整保留体积，,VR,Adjust,retention,volume,保留体积减去死体积,19,PPT课件,基础理论：术语介绍19PPT课件,不对称因子计算示意图,峰高,EP/USP,标准：,AIA,标准：,LW,RW,LW,10%,LW,5%,RW,10%,RW,5%,A=,0.951.05,：正常峰,A,1.05,：拖尾峰,20,PPT课件,不对称因子计算示意图峰高EP/USP标准：LWRWLW10%,色谱的分离度,色谱峰的完全分离是每一个色谱方法的目标。,21,PPT课件,色谱的分离度色谱峰的完全分离是每一个色谱方法的目标。21PP,分离度方程,k,是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱,是选择因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素,N,是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度,22,PPT课件,分离度方程 k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料,基础理论：塔板理论,固,流,动,塔板模型假设色谱柱是由大量分离,层构成的，这些分离层称之为理论,塔板,这些塔板实际是不存在的,，,他们只,是一种假设用来帮助描述色谱柱里,所发生的一切,定,相,相,在这些塔板里面，固定相和流动相,之间存在着一种平衡,分析物在这种平衡里面存在着一种,平衡系数,K,，定义为：,K,=,C,固定相,/,C,流动相,随着,K,的增加，分析物从色谱柱中,的流出时间就越长，即分析物的在,色谱柱内的保留时间越长,23,PPT课件,基础理论：塔板理论固流动塔板模型假设色谱柱是由大量分离定相相,concen,ntration,塔板理论数与柱效的关系,理论塔板数用来衡量色谱柱质量好坏,理论塔板数,(N),：理论塔板数越高，柱效越高,或者,理论塔板高度,(H),：理论塔板高度越大，柱效越低,高柱效色谱柱比低柱效色谱柱在同一保留时间峰更窄,理论塔板数越高，柱效越高,w,h,w,h,色谱柱长,time,(length),L,H,N,=,理论塔板数,理论塔板高度,24,PPT课件,concenntration塔板理论数与柱效的关系wh色谱,25,PPT课件,25PPT课件,t,=,0,2,4,6,8,10,常用,k,值范围,改变,k,值的方法,调节流动相的极性（比例）、,pH,、,容量因子对分离度的影响,t,0,t,t,R,=,k,=,固定相,流动相,t,R,-,t,0,t,0,k,值小,组分流出快，接,25,t,R,近死时间,分离度差,k,值大,分离度好,k,值更大,保留时间更长,峰会展宽，损失,20,15,10,5,0,minutes,灵敏度,2,k,1,且,=,1.01,R,s,=,1,若将,R,提高到,2,，以达到基线分离,方法,1,增加,N,方法,2,提高,需要提高,N,6400%,（,N,=,640,000,）,需要提高,1%,（,=1.02,）,提高分离度最有效的方法就是更换不同固定相类型的色谱柱,28,PPT课件,选择性是分离度的关键R 分离度例如:方法 1 增加,Rs,与,N,、,K,及,的关系图示,29,PPT课件,Rs与N、K及 的关系图示29PPT课件,液相色谱应用技术,戴安中国有限公司,30,PPT课件,液相色谱应用技术戴安中国有限公司30PPT课件,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同,?,注意文献方法的流动相,是否损害色谱柱,?,如色谱填料品牌不同，需要调整流动相,注意色谱柱的规格：内径、柱长,需要调整流速、进样量,注意梯度条件,了解系统的滞后体积（梯度）,31,PPT课件,使用文献方法注意点31PPT课件,如何建立一个,HPLC,方法必须具备如下条件,流动相类型,运行程序,梯度方法,等度方法,流速,进样量,色谱柱及柱温,检测器,32,PPT课件,如何建立一个HPLC方法必须具备如下条件32PPT课件,完整的,HPLC,方法（色谱条件）,所需的基本方法参数,液相色谱实验所需的基本参数,检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等,固定相：色谱柱类型及内径、长短,流动相：种类及配比，等度或梯度,流动相输送系统参数：流速,温度控制,进样量,33,PPT课件,完整的HPLC方法（色谱条件）所需的基本方法参数检测器,方法参数的选择及其影响,34,PPT课件,方法参数的选择及其影响34PPT课件,方法参数的选择及其影响,选择,HPLC,检测器,选择合适的色谱柱,反相色谱常用流动相,35,PPT课件,方法参数的选择及其影响35PPT课件,一）选择,HPLC,检测器,没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！,HPLC,检测器可以分为：,溶质性质检测器（选择型）,对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）,整体性质检测器（通用型）,不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）,36,PPT课件,一）选择HPLC检测器36PPT课件,选择液相色谱的检测器,通用检测器,灵敏度,线性范围,流速敏感,温度敏感,破坏性,选择性检测器,灵敏度,线性范围,流速敏感,温度敏感,破坏性,RI,ug,10,4,是,是,否,ABS,ng,10,5,否,否,否,ELSD,ng,否,否,否,是,FL,pg,10,3,否,否,否,CAD,ng,10,4,否,否,是,EC,fg,10,6,是,是,是,Cond,pg,10,5,是,是,否,MS,pg,10,3,是,是,是,37,PPT课件,选择液相色谱的检测器通用检测器RIELSDCADCo,理想的,HPLC,检测器,高灵敏度；可忽略基线噪音,宽的线性范围,对压力、温度及流速等变化不敏感,长时间操作的稳定性,低死体积,非破坏性,选择性,38,PPT课件,理想的HPLC检测器38PPT课件,6:1,灵敏度：信噪比,灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（,S/N,）,检测限（,LOD,）：,S/N,=,3,定量限（,LOQ,）：,S/N,=,10,好的信噪比有利于：,S,更好的色谱峰确认,更好的定量,更好地完成色谱峰纯度,/,均一性,N,39,PPT课件,6:1灵敏度：信噪比N39PPT课件,选择液相色谱的检测器,要考虑的因素：,你要分离的化合物,/,样品的化学特性,化学结构、分子量及紫外光谱等等,流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）,梯度还是等度,灵敏度需求,采样频率,是否有双检测的需求,40,PPT课件,选择液相色谱的检测器40PPT课件,吸光度（,UV/Vis,）检测原理,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收,定量基础：比耳定律，,A,KCL,优点：,1,）对温度和流速不敏感,2,）可用于梯度洗脱,3,）,灵敏度较高，,ng,级检测,缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质,41,PPT课件,吸光度（UV/Vis）检测原理41PPT课件,吸光度（,UV/Vis,）检测的应用,大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是,目前实验室中使用最多的检测器,多数公司售出的检测器中,75%,以上是吸光度检测器（包括紫外,/,可见检测,器和二极管阵列检测器,DAD,）,42,PPT课件,吸光度（UV/Vis）检测的应用42PPT课件,光电二极管矩阵（,Photo,Diode,Array,）,Photo,DiodeArray,简称：,PDA,或,DAD,43,PPT课件,光电二极管矩阵（Photo Diode Array）Phot,光电二极管矩阵检测器（,DAD,）的特点和用途,一种三维水平的吸光度检测器采集三维谱图,兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息,在收集色谱图的同时，得到光谱图,提供许多有用的功能,色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认,可以发现单波长检测时未测到的峰,任意波长的色谱再处理,光谱信息,光谱库的建立检索和拟合,44,PPT课件,光电二极管矩阵检测器（DAD）的特点和用途兼顾紫外检测器及,荧光（,Fluorescence,）检测原理,原理：发荧光的化合物吸收光（,UV,或,VIS,）使其分子达到激发态，当其,返回到基态时发射光的现象即荧光,优点：荧光检测器灵敏度高,pg,级检测,缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生,45,PPT课件,荧光（Fluorescence）检测原理 原理：发荧光的化,荧光检测器原理,46,PPT课件,荧光检测器原理46PPT课件,多环芳烃（PAH）,荧光检测器的应用,环境中的污染物,多环芳烃,(PAH),，多酚，氨基,甲酸酯等,食品、饮料,CH,3,H,3,C,CH,3,CH,3,食品中的毒素；例如：黄曲,霉毒素,OH,维生素,染料,维生素及衍生氨基酸,生物技术及制药,O,O,CH,3,O,O,O,O,O,NH,CH,3,H,3,C,O,CH,3,O,黄曲霉毒素,CH,3,氨基甲酸酯类杀虫剂,47,PPT课件,多环芳烃（PAH）荧光检测器的应用 食品、饮料CH3H,示差折光（,Refractive,Index,）检测,示差折光检测器（,RI,）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十,年代末、七十年代初）,通常被认为是一种通用检测器,检测溶液中所有被溶解的溶质,非特异性,任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值,S,R,48,PPT课件,示差折光（Refractive Index）检测SR48PP,示差折光（,RI,）检测,的原理,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样各组分浓度,优点：通用型检测器,缺点：,1,）对温度变化敏感,2,）不能用于梯度检测,3,）灵敏度低，,ug,级检测,49,PPT课件,示差折光（RI）检测 的原理49PPT课件,示差检测器的应用,示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都,可以检测,特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等,高分子化合物,GPC,GFC,分析以及复杂样品纯化,50,PPT课件,示差检测器的应用50PPT课件,蒸发光散射（,ELSD,）原理,用氮气把流动相吹成细雾状,流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉,蒸发的溶剂被从检测器中除去,溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交,被颗粒散射的光由光电倍增管（,PMT,）收集,PMT,的输出与溶质的存在量呈比例关系,51,PPT课件,蒸发光散射（ELSD）原理用氮气把流动相吹成细雾状51PP,ELSD,优点及应用领域,通用型,比流动相挥发性小的物质都能被检测,可以作梯度实验；,检测下限可到纳克级水平,对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相,应用领域：,碳水化合物,油脂及脂肪酸,未衍生的氨基酸,制药行业,表面活性剂,天然产物,52,PPT课件,ELSD 优点及应用领域52PPT课件,ELSD,缺点,不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）,要求使用雾化气源（典型的是氮气或空气）,不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化,破坏性技术,蒸发出的溶剂要引到户外或通风橱里,对挥发性化合物的检测不理想,一般得到的是非线性校正曲线,某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器,53,PPT课件,ELSD 缺点不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）,新型液相色谱通用型检测器：Corona电喷雾检测器,CAD(Charged,Aerosol,Detectors),是,ESA,独特的专利技术,近期发展最快的,HPLC,通用型检测技术,目前，世界上许多制药、化学、食品饮料和化妆品行业使用该检测器，,应用于开发和生产环节,54,PPT课件,新型液相色谱通用型检测器：Corona电喷雾检测器54PPT,CAD,检测器,Corona,“classic”,Corona,Ultra,55,PPT课件,CAD检测器Corona“classic”Corona U,10,Corona,CAD,电喷雾检测器原理图,1,3,2,4,6,8,9,5,7,56,PPT课件,10Corona CAD电喷雾检测器原理图46895756P,二）选择合适的色谱柱,色谱柱类型,反相柱,C18,、,C8,、苯基、内嵌极性基团等,正相柱硅胶、氨基柱、氰基、乙二醇柱等,离子交换色谱柱,WAX,、,WCX,、,SCX,等,特殊色谱柱：手性色谱柱,(,刷型、淀粉类、纤维素类、环糊精类等,),；,凝胶色谱柱；免疫亲和色谱柱等,规格,长度、内径、粒径、孔径等,品牌、批号,Acclaim,系列、,Zorbax,系列、,Atlantis,系列、国产色谱柱等,57,PPT课件,二）选择合适的色谱柱57PPT课件,对色谱柱要有足够的了解,掌握柱子分离机理,自己建立开发方法,58,PPT课件,对色谱柱要有足够的了解掌握柱子分离机理58PPT课件,根据分析物的分离机理分类,吸附色谱（正相色谱）,分配色谱（反相色谱）,离子交换色谱,体积排阻色谱,亲和色谱,59,PPT课件,根据分析物的分离机理分类59PPT课件,正相色谱柱,吸附色谱（正相色谱）,常见固定相类型,C,=,N,氰基柱,NH,2,氨基柱,Si-OH,硅胶柱,HO,OH,CHCH,2,乙二醇柱,以吸附为主要保留机理,(,相似相容,),常用非极性流动相，如正己烷、四氢呋喃等,极性小的化合物先被洗脱下来,60,PPT课件,正相色谱柱NH2Si-OHHO OH以吸附为主要,反相色谱柱,分配色谱（反相色谱）,常见固定相类型,O,Me,N,O,O,S,C,N,O,以“液,-,液分配”为主要分离机理,常用极性流动相，如甲醇、乙腈和水等等,极性大的化合物先被洗脱下来,61,PPT课件,反相色谱柱OMeOOCNO以“液-液分配”为主要分离,反相键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基,质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的70-80%,优点,固定相稳定，不易流失,应用广泛，可使用多种溶剂,消除硅羟基的不良影响,缺点,pH值不能小于2或大于8,同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,62,PPT课件,反相键合相色谱柱62PPT课件,不同类型色谱选择性差异,色谱柱,:,规格,:,如色谱图,5-m,150,mm,x,4.6,mm,4,6,5,流动相,:,温度,:,流速,:,进样量,:,CH,3,CN/25,mmol/L,磷酸盐,pH,3.3,(60/40,v/v),30,C,1,mL/min,5,L,检测,:,UV,206,nm,4,AU,峰,:,3,5,6,1.,尿嘧啶,2.,嘧啶,3.,苯酚,4.,N,N,-,二甲基苯胺,5.,甲苯,7.5,g/mL,50,50,50,60,6.,4,-,丁基苯甲酸,50,0,2,8,10,4,Minutes6,63,PPT课件,不同类型色谱选择性差异色谱柱:如色谱图,5-m465流动,不同品牌,C18,区别,4,2,3,Column:,Eluant:,Flow,rate:,如图所示,90%,MeOH,1,mL/min,品牌,B,2,3,4,2,1,Temperature:,Peaks:,30,C,1.,品牌,A,1,3,4,2.,3.,0,2,4,6,8,10,4.,Minutes,64,PPT课件,不同品牌C18区别42 3Column:如图所示品牌 B2,离子交换色谱柱,离子交换色谱,常见固定相类型,弱阴离子交换：结合阴离子,弱阳离子交换,结合阳离子,流动相常为不同,pH,的缓冲盐,常用来分析离子型化合物,溶质必须为带电状态才能具有离子交换的能力,65,PPT课件,离子交换色谱柱65PPT课件,小分子分析面临的挑战,RP,柱,(,如,C18),用途最广泛,但：,存在残余硅羟基作用,在中性淋洗液条件下，碱性化合物拖尾,对高极性（亲水性）化合物保留很弱,选择性有限,RP,柱,+,离子对试剂,分离亲水性带电化合物,平衡时间长,流动相复杂,(MS,不兼容,),IEX,柱,-,分离带电化合物,疏水性差，限制了使用,HILIC/NP,柱,-,分离高度亲水的化合物,疏水性差，限制了使用,66,PPT课件,小分子分析面临的挑战66PPT课件,混合模式固定相,定义,疏水性相互作用,+,离子交换作用,类型,WAX/RP,SAX/RP,WCX/RP,SCX/RP,两性离子,/RP,两性,/RP,优势,选择性可调节,流动相组成简单,可同时分离不同类型的化合物,67,PPT课件,混合模式固定相67PPT课件,各种不同的混合基质制作方式,硅,胶,硅,胶,硅,胶,I.,混合填料,Hypersil,Duet,C18/SAX,(Thermo,Scientific),II.,混合键合,Alltech,Mixed-Mode,(Grace),III.,“,内嵌,”,Primesep,Mixed-Mode,(SIELC),IV.,“,封尾,”,Acclaim,Mixed-Mode,(Dionex),反相,蓝色,;,离子交换,红色,68,PPT课件,各种不同的混合基质制作方式硅胶硅胶硅胶I.混合填料II,体积排阻色谱柱,体积排阻色谱,常见固定相类型,凝胶过滤色谱（,GFC,）：亲水性固定相,-,聚乙烯醇、硅胶等,凝胶渗透色谱（,GPC,）：疏水性固定相,-,聚苯乙烯,-,二乙烯基苯,化合物保留主要受色谱柱填料和尺寸影响,具有很好的预测效果，分子量大的化合物先出峰，分子量小的化合物后出峰,常用于测定高分子化合物的聚合度,常用于生物活性分子的分离,69,PPT课件,体积排阻色谱柱69PPT课件,亲和色谱柱,亲和色谱,常见固定相类型如右图所示，通过,固体载体连接一个具有识别能力的,配体,“,Lock,and,Key”(,锁与匙,),的识别,机理，专一性很强,常用于生化样品的纯化、分离,70,PPT课件,亲和色谱柱70PPT课件,三）反相色谱及常用流动相,反相色谱的主要类型，基于样品分子的极性分离,反相色谱的固定相（填料）为非极性，流动相为极性。用得最多约占,70-,80%,洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱,71,PPT课件,三）反相色谱及常用流动相71PPT课件,流动相极性,溶剂,极性,非极性,水,甲醇,异丙醇,乙腈,THF,乙酸乙酯,CH,2,Cl,2,CHCl,3,己烷,NH,3,X/ArOH/RCOOH,CNH,2,ROH,RCN,醛/酮,N(R),2,NO,2,卤代烷烃,烷烃,COOCH3,样品的官能团,CH3,72,PPT课件,流动相极性溶剂极性非极性水甲醇 异丙醇 乙腈TH,流动相洗脱强度,反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：,水,甲醇,乙腈,乙醇,丙醇,异丙醇,四氢呋喃,最常用的流动相组成“乙腈,-,水；甲醇,-,水”,正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：,正己烷,乙醚,乙酸乙酯,异丙醇,*,应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法,73,PPT课件,流动相洗脱强度 反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：73P,流动相的选择原则,样品易溶，且溶解度尽可能大,化学性质稳定，不损坏柱子,不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收,*,黏度低，流动性好,*,无毒或低毒，易于操作,易于从其中回收样品,易于制成高纯度，即色谱纯,废液易处理，不污染环境,74,PPT课件,流动相的选择原则样品易溶，且溶解度尽可能大74PPT课件,常用流动相,反相体系,有机相：,ACN,、,MeOH,等,水相：,H2O,、磷酸缓冲盐,(pH2,、,7,、,12),、醋酸缓冲盐,(pH4.5),、硼酸,缓冲盐,(pH9,、,13),、三羟甲基氨基甲烷,(Tris,，,pH8),等,改性剂：三氟乙酸,(TFA),、三乙胺,(TEA),等,正相体系,正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等,乙醇、异丙醇等,75,PPT课件,常用流动相75PPT课件,缓冲盐的选择,缓冲盐类型,挥发性：,TFA,、醋酸盐、甲酸盐、,TEA,等,非挥发性：磷酸盐、硼酸盐等,离子强度,弱极性化合物分离：,0,10,mM,中、高极性化合物分离：,20,30,mM,离子交换：,60,100,mM,pH,值,76,PPT课件,缓冲盐的选择76PPT课件,流动相,pH,对分析的影响,Acids,Base,中性化合物的保留与,pH,无关,酸、碱性化合物的保留受,pH,影响,可通过调节,pH,确定未知化合物的酸、碱性,77,PPT课件,流动相pH对分析的影响AcidsBase中性化合物的保留与,苯胺,2,mAU,啶,1,尿嘧,胺,4,对乙基苯,苯酚,3,-,甲苯,5,6,乙苯,流动相,pH,对分析的影响,WVL:254,nm,90,75,63,50,38,25,13,0,0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,min,10.0,-10,中性化合物：,甲苯,碱性化合物：,苯胺,pK,a,=9.9,酸性化合物：,苯酚,pK,a,=2.7,78,PPT课件,苯胺 2mAU啶 1 尿嘧胺 4 对乙基苯苯酚 3,mAU,流动相,pH,对分析的影响,50,NH,2,40,30,20,pH,6,pH,5,pH,4,pH,7,pH,8,T=40C,F=1mL/min,ACN/20mM,Phosphate,buffer/H,2,O,35/35/30,v/v/v,10,0,0,0,0,5,1,0,1,5,2,0,2,5,3,0,3,5,t,min,79,PPT课件,mAU流动相pH对分析的影响50NH 240pH 6pH,ce,mAU,Absorbanc,AU,bsorbance,m,Ab,1,2,MeOH,vs.,ACN,600,250,MPB,：,MeOH,1,-100,3.00,3.50,4.00,4.50,5.00,550,Retention,Time,min,1,2,250,2,MPB,：,ACN,3.00,3.50,4.00,4.50,5.00,-50,Retention,Time,min,压力：,MeOH-132bar,；,ACN-76bar,；,ACN,洗脱能力更强；,ACN,选择性更好,峰,1-,邻苯二甲酸丁基苄酯,(BBP),；峰,2-,邻苯二甲酸丁酯,(DBP),80,PPT课件,ce mAU AbsorbancAU bsorbanc,粘度曲线,25,o,C,20,o,C,79,Proprietary,&,Confidential,系统压力与流动相粘度直接有关,81,PPT课件,粘度曲线25oC20oC79Proprietary&Co,样品溶剂对分析的影响,样品溶剂洗脱能力须等于或小于流动相初始洗脱能力,3,2,4,5,6,1,A),样品溶剂：,ACN,1,2,3,4,1,2,3,4,5,6,0,1,2,3,4,B),样品溶剂：,ACN/H2O,50/50,(v/v),1,2,3,6,4,5,0,1,2,3,4,C),样品溶剂：,ACN/H2O,30/70,(v/v),t,min,样品溶剂洗脱能力须等于或小于流动相初始洗脱能力,82,PPT课件,样品溶剂对分析的影响324 5 61A)样品溶剂,mAU,Absorbance,流动相比例,200,1,2,4+5,3,WVL:210,nm,ACN：H,2,O,=,30：70,150,6,7,100,1,2,1+2,4,50,2,6,5,3,7,ACN：H,2,O,=,40：60,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0,-10,Retention,Time,min,有机相比例增加，出峰更快、压力不同、选择性不同,83,PPT课件,mAU Absorbance流动相比例200124+53,流速对分析结果的影响,0,450,300,150,1,mL/min,C5,C4,C1,C2,C3,Uracil,450,0,1,2,3,4,450,300,150,0,1.5,mL/min,0,1,2,3,4,450,300,150,0,2,mL/min,0,1,2,3,4,450,300,150,0,2.5,mL/min,0,1,2,3,4,300,150,0,3,mL/min,Time,min,0,1,2,3,4,流速增加，出峰更早，一般选择性不变,84,PPT课件,流速对分析结果的影响04501 mL/minC5C4C1,柱温对分析结果的影响,1,21C,7,2,3,4,5,6,1,3+4,6+7,0,5,10,15,20,25,30C,2,5,0,10,20,25,2,6,1,3,5,15,7,40C,5,4,0,5,10,15,20,t,min,25,柱温增加，出峰更早，选择性变化,85,PPT课件,柱温对分析结果的影响121C72345613+46+705,方法开发的具体步骤,86,PPT课件,方法开发的具体步骤86PPT课件,方法开发和优化的具体步骤,选定一根色谱柱（先用较短的柱子）,先用相对较高的流速,使用尽可能纯度高的标准品,先用高强度的洗脱液,调节,k,值改变保留值（普通反相,-,简单常用的方法）,调节,a,值改变选择性（方法优化）,通过改变流动相的,pH,值，使样品成中性,加入,“对离子”，使样品呈中性,选择更合适的柱子,调节柱长度，流速，梯度，改变柱效及分离速度,请记住,每次改变一个参数,87,PPT课件,方法开发和优化的具体步骤选定一根色谱柱（先用较短的柱子）,液相色谱的方法开发（一）,改变流动相比例及组成,（非极性和弱极性化合物）,88,PPT课件,液相色谱的方法开发（一）88PPT课件,改变流动相比例及组成（实例,1,）,非极性和弱极性化合物,色谱条件,流动相：洗脱强度由强到弱，改变容量因子,K,1.,有机相从,100%,开始逐渐降低,2.,走梯度,举例中：,乙腈,/,水，流速：,1ml/min,用不同的溶剂强度以,60/40,、,50/50,、,40/60,，由强渐弱,色谱柱：,C18,，,4.6mm,15mm,样品：,对羟基苯甲酸甲酯,(Methyl,Paraben),对羟基苯甲酸丙酯,(Propyl,Paraben),对羟基苯甲酸丁酯,(Butyl,Paraben),89,PPT课件,改变流动相比例及组成（实例1）色谱条件89PPT课件,改变容量因子,K,谱图,50/50,40/60,60/40,90,PPT课件,改变容量因子 K谱图50/5040/6090,调节,值改变选择性,同样强度的不同有机溶剂，改变了流动相,值,CH,3,CN,/,H,2,O,38:62,THF,/,H,2,O,28:72,MeOH,/,H,2,O,58:42,91,PPT课件,调节值改变选择性CH3CN/H2O 38:6,液相色谱的方法开发（二）,方法优化离子型化合物的色谱分离,92,PPT课件,液相色谱的方法开发（二）92PPT课件,方法优化,离子型化合物,离子抑制法,离子对色谱法,离子交换色谱柱,色谱峰拖尾,添加改性剂,使用梯度,93,PPT课件,方法优化93PPT课件,方法优化离子型化合物的色谱分离,多数化合物是离子型的！,使用反相柱,离子抑制色谱法：通过改变流动相的,pH,值，使样品成中性,离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性,使用离子交换柱：离子交换法,主要用于“强”阴、阳离子,使用疏水和离子交换混合模式柱子,主要用于“弱”阴、阳离子,94,PPT课件,方法优化离子型化合物的色谱分离 多数化合物是离子型的！9,方法优化离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的,pH,值，抑制样品离子的电离使样品成中性,适用于,弱酸性化合物,的分离,加入,TFA,磷酸盐等降低流动相的,pH,值，使样品降低离子化,仍使用硅胶基质,C18,填料,使用条件应在填料基质的范围内,硅胶柱的,pH,在,2-8,（较保险值,3-7,）内,95,PPT课件,方法优化离子抑制色谱95PPT课件,方法优化,离子抑制,O,R-C-O-H,10,9,8,7,6,5,4,3,k,弱碱,弱酸,2,1,0,O,R-C-O,-,2,4,8,6,pH,=,pKa,pH,离子抑制色谱法,96,PPT课件,方法优化 离子抑制O106k弱碱2O2486pH,方法优化,离子抑制,O,R,C,O,H,+,H,2,O,O,R,C,O,+,H,3,O,+,保留最弱,保留最强,O,R,C,O,和,O,R,C,O,H,pH,=,pK,a,O,R,C,O,高,pH,O,R,C,O,H,低,pH,97,PPT课件,方法优化 离子抑制OO保留最弱保留最强OOO,液相色谱的方法开发离子抑制色谱（实例,2,）,CHO,COONa,CHO,COOH,而在乙腈,/,水并且,pH=7,时，,OH,OCH,3,OCH,3,1,2,3,4,苯甲酸纳,苯甲醛,对甲氧基苯甲酸,多数组份保留时间很短，无,法完全分离。,三甲氧基-四羟基苯甲醛,98,PPT课件,液相色谱的方法开发离子抑制色谱（实例2）CHOCOONaC,方法优化离子抑制色谱的使用范围,下列情况下不能使用离子抑制方法：,一些酸在,pH,低于,2,时还保持离子化,一些碱在,pH,高于,7,时还保持离子化,可以有以下的选择,使用“离子对色谱法”,离子交换色谱柱,甚至要采用离子色谱仪分析,99,PPT课件,方法优化离子抑制色谱的使用范围99PPT课件,方法优化离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂,与样品中可电离的组份形成“对离子”,在反相色谱柱上分离离子型化合物,离子对试剂的类型,季铵盐、叔胺盐,（正离子），适用于弱酸,烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱,烷基长度不同，形成对离子的能力不同,100,PPT课件,方法优化离子对色谱法100PPT课件,方法优化,离子对,+,N,SO,3,Na,+,键合相,离子对试剂,+,N,H,2,PO,4,R,SO,3,样品,+,H,O,O,C,R,R,N,R,用季胺烷基三乙基胺分离酸,三乙胺,(TEA),磷酸四甲基铵,(TMA),四丁基溴化铵,用烷基磺酸盐分离碱,三氟乙酸,(TFA),七氟丁酸,(HFTBA),己烷磺酸钠,十二烷基硫酸钠,101,PPT课件,方法优化 离子对+SO3 Na+键合相离子对试剂+H,容量因子,方法优化,离子对,优化参数,离子对试剂的种类,离子对试剂的浓度,20,15,十二烷基,流动相组成，包括,pH,、,有机相含量等,10,辛基,5,0,己基,丁基,0,20,40,60,烷基硫酸钠,mM,102,PPT课件,容量因子方法优化 离子对20十二烷基 流动相组成，包括,NaO,3,S,NaO,3,S,SO,3,Na,SO,3,Na,液相色谱的方法建立离子对色谱（实例,3,）,光敏物质,1,3,6,8-芘四磺酸四钠盐,长激发态寿命，与其他物质组成光敏物质,未见相关色谱分析报道,离子型化合物,在C18柱上无保留，如右图,色谱分析,离子抑制法（不合适）,阴离子交换法（不理想）,8-,离子对色谱法（好）,1,3,6,8,芘四磺酸四钠盐,103,PPT课件,NaO 3SSO3Na液相色谱的方法建立离子对色谱（实例3,e,mAU,Absorbance,方法优化,离子对,600,NaO,3,S,SO,3,Na,色谱柱,:,流动相,A:,Acclaim,C18,，,120,，,4.6,*150,mm,*5,m,at,40,C,25,mM,四丁基溴化铵，,20,mM,KH,2,PO,4,，,pH,2.5,400,流动相,B:,流速,:,进样量,:,CH,3,CN,1.5,mL/min,5,L,200,NaO,3,S,SO,3,Na,检测,:,UV,282,nm,梯度：,Time,(min),B%,-5,20,0,5,20,70,t,0,0,-150,70,10,离子对色谱法,0.0,1.3,2.5,3.8,5.0,6.3,7.5,8.8,10.0,Retention,Time,min,104,PPT课件,e mAU Absorbance方法优化 离子对NaO,液相色谱方法建立三聚氰胺分析离子对色谱（实例,4,）,NH,2,N,N,N,NH,2,H,2,N,C18,柱上离子对色谱法,(,实例,4),SCX,强阳离子交换色谱柱,(,实例,5),疏水性作用,+,离子交换作用混合模式柱子,(,实例,6),105,PPT课件,液相色谱方法建立三聚氰胺分析离子对色谱（实例4）NNNNH,三聚氰胺,反相,C18,柱,离子对方法,GB/T,22338-2008,原料乳和乳制品中三聚氰胺检测方法,106,PPT课件,三聚氰胺 反相C18柱 离子对方法GB/T 22338-,12.653,1,-,1,560,2,-,三聚氰胺,-,14.5,527,3,-,15.5,三聚氰胺,反相,C18,柱,离子对方法,标准样,08,三聚氰胺,2,三聚氰胺加标,0.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5,20.0,UV_VIS_1,UV_VIS_1,UV_VIS_1,WVL:240,nm,min,1,-,221,#3,2,-,221,#7,30.0,3,-,221,#8,mAU,25.0,20.0,15.0,10.0,5.0,3,0.0,2,-5.0,1,-10.0,图A.1,标准，液体奶样品及加标三聚氰胺奶样品的,HPLC色谱图。,三聚氰胺保留时间14.56min,GB/T,22338-2008,原料乳和乳制品中三聚氰胺检测方法,107,PPT课件,12.653 1-1560 2-三聚氰胺-14.5,液相色谱的方法建立三聚氰胺分析,SCX,强阳离子交换色谱柱离子交换方法（实例,5a,）,GB/T,22338-2008,原料乳中三聚氰胺快速检测,（液相色谱法）,108,PPT课件,液相色谱的方法建立三聚氰胺分析GB/T 22338-200,三聚氰胺,SCX,强阳离子交换色谱柱,(,实例,5a),GB/T,22338-2008,原料乳中三聚氰胺快速检测（液相色谱法）,109,PPT课件,三聚氰胺 SCX强阳离子交换色谱柱(实例5a)GB/T,amine,mela,液相色谱的方法建立三聚氰胺分析,戴安混合模式,WCX,柱子的应用（实例,5b,）,50.0,mAU,A,三聚氰胺的分析,空白及加标奶粉：,Guard,column:,Anal.,Column:,Acclaim,Mixed-Mode,WCX-1,5,m,4.3,10,mm,Acclaim,Mixed-Mode,WCX-1,5,m,4.6,250,mm,45.0,40.0,Eluents:,NH4Ac,buffer,(10,mM,pH,4.3),CH3CN,；,(8,:,2,v/v),Column,Temp.:,30,C,Flow,Rate:,1.0,mL/min,Injection,Vol.:20,L,Detection:,UV,on,240,nm,C-grams:,1-,Milk,powder,sample,#,6,2-,Milk,powder,sample,#,6,spiked,with,4g/mL,melamine,standard,Peaks:,Melamine,35.0,30.0,25.0,20.0,15.0,O-,O-,O-,O-,O,C,O,C,O,C,O,C,O,C,O-,0.0,10.0,5.0,2,min,-5.0,1,Silica,Gel,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,-12.0,-0.0,WCX-1,110,PPT课件,amine mela液相色谱的方法建立三聚氰胺分析50.0,方法开发的其他因素,流速对柱效的影响,不同内径的色谱柱有自己的最佳流速,样品的进样量(浓度)对柱效的影响,样品的进样体积对柱效的影响,溶剂粘度对柱效的影响,以上因素均影响分离度,111,PPT课件,方法开发的其他因素以上因素均影响分离度111PPT课件,典型的流速,112,PPT课件,典型的流速112PPT课件,梯度洗脱方法介绍,113,PPT课件,梯度洗脱方法介绍113PPT课件,液相色谱泵,稳定平滑并且重现性好的流速,可靠且充分的溶剂混合,准确及重现的自动溶剂混合,准确及重现的梯度形成,有效的流速范围,制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑,滞后体积,梯度分析更为关注,目的：在任何情况下保持最高精度,114,PPT课件,液相色谱泵114PPT课件,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,溶剂,A,溶剂,A,泵,A,比例阀（溶剂混合点）,溶剂,B,溶剂,B,混合器,（溶剂混合点）,泵,B,A,高压梯度,混合器,泵,B,低压梯度,115,PPT课件,梯度的洗脱方式溶剂 A溶剂 A泵 A比例阀（溶剂混合点,梯度洗脱的特点,优点,缩短分析时间,增加分离能力,检测灵敏度提高,缺点,仪器设备要求二元以上泵,不适合某些检测方式,(RI),柱需再生平衡,116,PPT课件,梯度洗脱的特点116PPT课件,Org,%,O,k,梯度运行中发生了什么,?,增加有机改性剂的含量,分配转移到流动相,100,75,50,25,0,0,10,20,30,Time,(min),增加化合物的流速,117,PPT课件,Org%O k梯度运行中发生了什么?增加有机改性剂的含量,梯度方法开发,-,优化溶剂梯度,从尝试运行开始,-,一个平缓的梯度,5%,有机相,100%,有机相,流速,柱长,柱重新平衡时间,您必须确定,:,有机溶剂,初始组成,梯度时间,梯度陡度,梯度形状,118,PPT课件,梯度方法开发-优化溶剂梯度从尝试运行开始 -一个平缓,梯度形状,线性,步进,%B,time,凹形,凸形,119,PPT课件,梯度形状线性步进%Btime凹形凸形119PPT课件,对下列每种情况，您认为使用哪种梯度曲线能改善分离,?,用步进梯度或流速梯度,线性梯度,选凹形梯度曲线,线性梯度,选凸形梯度曲线,线性梯度,120,PPT课件,对下列每种情况，您认为使用哪种梯度曲线能改善分离用步进梯度或,梯度坡度对分析的影响,0,5,10,15,(mAU),60,40,20,0,V,G,=,22.5,mL,60,40,20,0,V,G,=,11.3,mL,0,5,10,15,0,60,40,20,0,5,10,15,V,G,=,6.8,mL,60,40,20,0,V,G,=,4.4,mL,t,(min),0,5,10,15,坡度越大，峰高增加、分离度降低、选择性变化,129,121,PPT课件,梯度坡度对分析的影响051015(mAU)VG=22.5,流动相缓冲液,pH,值从,pH,4.95,到,pH,4.45,递减时，氨基,酸衍生物的保留和分离呈,2,种变化趋势,S_,amion,acids-no,TEA,amion,acids-no,TEA,amion,acids-no,TEA,amion,acids-no,TEA,pH,pH,pH,pH,4.95-8,4.88-8,4.70-8,4.45-8,1,2,3,268,4,mAU,UV_VIS_1,UV_VIS,1,UV_VIS_1,UV_VIS_1,WVL:248,nm,0,-200,-400,7.5,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,42.6,-629,min,4,3,2,1,122,PPT课件,流动相缓冲液pH值从pH 4.95到pH 4.45递减时，氨,梯度平衡时间的影响（一）,10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复,123,PPT课件,梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色,梯度平衡时间的影响（二）,平衡时间6分钟,平衡时间7分钟,平衡时间8分钟,平衡时间9分钟,平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到,7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，,平衡充足。,124,PPT课件,梯度平衡时间的影响（二）平衡时间6分钟124PPT课,结论,充分用已知样品结构确定以哪种方法开始,普通反相,?,离子抑制,?,离子对,?,还是其他,观察流动相条件改变时色谱峰的移动,根据变化的方向及大小决定下一步干什么,改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！,色谱柱的改变影响最大,梯度洗脱有利于复杂样品的分离,125,PPT课件,结论125PPT课件,完善新开发的方法,日常使用的确认,:,流动相溶液稳定性实验,定量校正标准样品线性回归，方法线性范围,重现性精密度实验,RSD,(n,5),最小检出限,3,倍信噪比,加标回收率,多种类样品测定结果,126,PPT课件,完善新开发的方法 日常使用的确认:126PPT课件,非常感谢各位,同学,！,127,PPT课件,非常感谢各位同学！127PPT课件,