资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达,绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达,概览,GFP,pEGFP-N3,和,pET-28a,实验内容,实验目的,实验原理,实验过程,概览GFP,GFP,绿色荧光蛋白,(GreenFluorescent Protein,简称,GFP),GFP绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Pro,GFP,基因来源于,Jellyfish Aequorea Victoria,,,是,Shimomura,等于,1962,年发现的蛋白质,由,238,个氨基酸组成,分子量约为,27Kd,。,GFP,在包括热、极端,PH,和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定,在荧光显微镜下,用波长约,490 nm,的紫外线激发后,即可观察到绿色荧光,直接、简捷、便于检测;,无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响,保证了极高的检出率;,蛋白本身性质稳定;,可在多种异源生物中表达且无细胞毒性;,其基因片段长度较小,(,约,717 bp),,,易于构建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持荧光激发活性,EGFP,是一种优化的突变型,GFP,,,使其产生的荧光较普通,GFP,强,35,倍,大大增强了其报告基因的敏感度。,EGFP,与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子。,GFP基因来源于Jellyfish Aequorea Vic,GFP,丝氨酸酪氨酸甘氨酸 生色基团,蛋白质折叠,生色基团得以“亲密接触”,经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。,GFP丝氨酸酪氨酸甘氨酸 生色基团,绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达课件,GFP,蓝光、绿光与黄光,基因克隆,变体,GFP蓝光、绿光与黄光,GFP,分子标记,药物筛选,融合抗体,生物传感器,信号传导,标记!,GFP分子标记标记!,pEGFP-N3,真核细胞表达载体,,pEGFP-N3,载体上携带有,EGFP,蛋白表达基因,很强的复制能力,高效的功能强大的启动子,SV40,和,PCMV,多克隆位点,具有,neo,基因,可以采用,G418,来筛选已成功转染了该载体的靶细胞,pEGFP-N3真核细胞表达载体,pEGFP-N3载体上携带,pEGFP-N3,pEGFP-N3,pET-28a,pET-28a,pET,系统(,pET-28a,),原核蛋白表达引用最多的系统,在任何,E.coli,表达系统中,基础表达水平最低,真正的调节表达水平的“变阻器”控制,提供各种不同融合标签和表达系统配置,具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌,许多载体以,LIC,载体试剂盒方式提供,用于迅速定向克隆,PCR,产物,许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化,pET系统(pET-28a)原核蛋白表达引用最多的系统,E.Coli BL21,(,DE3,)表达菌株,表达载体和宿主菌的选择,E.Coli BL21,(,DE3,)是表达宿主菌,E.Coli BL21(DE3)表达菌株表达载体和宿主菌的选,实验内容,得到重组质粒,pET-28a-GFP,转入表达菌株,E.Coli BL21,(,DE3,),经培养后用,IPTG,进行三个时间梯度的诱导,表达,GFP,,紫外线下观察,实验内容得到重组质粒pET-28a-GFP,实验目的,掌握重组蛋白的基因表达和蛋白检测设计思想,学习分子生物学实验主要操作技术,实验目的掌握重组蛋白的基因表达和蛋白检测设计思想,实验原理,实验原理,实验器材与仪器,实验仪器,实验材料,实验试剂,实验器材与仪器实验仪器,实验思路,实验思路,实验步骤,将,pET-28a-GFP,重组质粒转化入表达菌株,制备,BL21,(,DE3,)菌株的感受态细胞,10uL BL21,(,DE3,)菌液接入,3mL LB,液体培养基,摇床培养过夜,二次活化:,1:50,比例接入新的试管摇床培养,2h,1.5mL,冰上,10min,实验步骤将pET-28a-GFP重组质粒转化入表达菌株二次活,4,度,,4000r/min,离心,2min,收集细胞,弃培养液,加入预冷的,Cacl2,液,600uL,,轻悬,冰上,20min,,,4,度,,4000r/min,离心,2min,弃上清液,加入预冷的,Cacl2,液,500uL,,轻悬,冰上,5min,,,4,度,,4000r/min,离心,2min,弃上清液,加入预冷的,Cacl2,液,300uL,,轻悬,即可,4 度,4000r/min离心2min收集细胞弃培养,将,pET-28a,-GFP,重组质粒转入,BL21,(,DE3,)菌中,300uL,分成,3,份,,2,份分别加入重组质粒,2uL,,轻匀,冰上,30min,;,1,份平行操作(对照),42,度水浴热击,90S,,迅速冰上冷却,5min,两管中分别加入,LB,液体培养基,100uL,,匀,,37,度振荡培养,3060min,涂平板:,a,)分别取,50,、,100,、,150uL,加入重组质粒的感受态细胞悬液涂布于含抗生素的平板,b,)抗生素板,+IPTG+100uL,重组质粒的感受态细胞悬液,c,)对照组感受态细胞,100uL+,抗生素平板,d,)正面向上放置片刻,后,37,度倒置培养,20h,将pET-28a-GFP重组质粒转入BL21(DE3)菌中,IPTG,诱导重组蛋白的表达,重组阳性克隆菌接至,3mL LB,(,Kan,)液体培养基中,,37,度培养,16h,过夜菌,1:50,比例接种至,4,支试管中(每支试管含,3mL LB(Kan),),扩大培养,2h,,测量,A600,值为,0.5,,停止,分别使用,IPTG,(最后总浓度为,1mmol/L,)诱导,0,2,4h,离心并照相,IPTG诱导重组蛋白的表达重组阳性克隆菌接至3mL LB(K,Wish a good result!,Wish a good result!,参考资料,周先碗 朱玉贤 主编,基础分子生物学实验,北京大学出版社,2010,年,11,月第一版,参考资料
展开阅读全文