仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件

,School of Chemical Engineering,HFUT,合肥工业大学,化工学院,第八章 气相色谱法,第八章 气相色谱法,第一节 概述,气相色谱法,：,以气体为流动相的柱色谱分离技术。,一、GC分类,1.按固定相分：气固色谱、气液色谱,2.按分离原理分：吸附色谱、分配色谱,3.按柱子粗细分：填充柱色谱、毛细管柱色谱,第一节 概述 气相色谱法：以气体为流动相的柱色谱分离技术,二、气相色谱仪的组成,载气减压净化稳压 色谱柱检测器记录仪,进样,载气系统,进样系统,分离系统,检测系统,记录系统,二、气相色谱仪的组成 载气减压净化稳压,三、气相色谱法的特点和应用,占有机物20%,适于分析气体、易挥发的液体及固体,不适合分析不易气化或不稳定性物质,样品的衍生化使应用范围进一步扩大,三、气相色谱法的特点和应用占有机物20%适于分析,第二节 气相色谱法的基本原理,一、基本概念,二、塔板理论（平衡理论）,三、速率理论,热力学理论：塔板理论平衡理论 基础,动力学理论：速率理论Vander方程,理论基础,第二节 气相色谱法的基本原理一、基本概念热力学理论：塔板理,1色谱峰的区域宽度：色谱柱效参数,峰宽W：,正态分布色谱曲线两拐点切线与基线相交,的截距,标准差,：正态分布色谱曲线两拐点距离的一半,对应0.607h处峰宽的一半,注：小，峰窄，柱效高,半峰宽W,1/2,：,峰高一半处所对应的峰宽,注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积,1色谱峰的区域宽度：色谱柱效参数峰宽W：正态分布色谱曲线两,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,2流出曲线图,2流出曲线图,二、塔板理论,色谱柱每个H高度内有一块塔板,共有若干块塔板,组分,在每块塔板两相间分配达平衡，K小的先出柱,多次分配平衡，K有微小差异组分仍可获较好分离,（一）塔板理论四个基本假设,（二）色谱峰的二项式分布,（三）色谱峰的正态分布,（四）理论板数和理论塔板高度的计算,假想：,二、塔板理论 色谱柱每个H高度内有一块塔板,共有若干块塔板,（一）塔板理论的四个基本假设,1在柱内一小段高度内组分分配瞬间达平衡,（H理论塔板高度）,2载气非连续而是间歇式（脉动式）进入色谱柱，,每次进气一个塔板体积,3样品和载气均加在第0号塔板上，且忽略样品,沿柱方向的纵向扩散,4分配系数在各塔板上是常数,（一）塔板理论的四个基本假设1在柱内一小段高度内组分分配瞬,（二）色谱峰的二项式分布（N 较少）逆流分布,萃取法利用物质在互不相溶两相中溶解度的不同,（二）色谱峰的二项式分布（N 较少）逆流分布 萃取法利,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,（三）色谱峰的正态分布（N50次）近似对称分布,讨论：,（三）色谱峰的正态分布（N50次）近似对称分布讨论：,（四）理论板数和理论塔板高度的计算,理论塔板高度H,为使组分在柱内两相间达到 一次分配平衡所需要的柱长。,理论塔板数N,组分流过色谱柱时，在两相间 进行平衡分配的总次数。,（四）理论板数和理论塔板高度的计算 理论塔板高度H为使组,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,小结,1塔板理论的贡献：从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置，阐明了保留值与K的关系，提出了评价柱效高低的n和H的计算式。,在比较相似柱的柱效时有用；,须在给定条件，指定组分测定时才有意义。,2,小结1塔板理论的贡献：从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状,例:在柱长为2m的5%的阿皮松柱、柱温为100,0,C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定苯的保留时间为1.5min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数。,解：,例:在柱长为2m的5%的阿皮松柱、柱温为1000C，记录纸速,三、速率理论,（一）塔板理论优缺点,（二）Van Deemteer 方程式,三、速率理论（一）塔板理论优缺点,（一）塔板理论优缺点,成功处：,解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的t,R,阐明了保留值与K的关系,评价柱效（n，）,存在问题:,1）做出了四个与实际不相符的假设,忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程,2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的,影响因素,3）排除了一个重要参数流动相的线速度u，,因而无法解释柱效与流速关系,更无法提出降低板高的途径,（一）塔板理论优缺点成功处：存在问题:,（二）Van Deemteer 方程式,吸收了塔板理论的有效成果H，,并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,（二）Van Deemteer 方程式吸收了塔板理论的有效成,流速与柱效的关系,流速与柱效的关系,第三节 气相色谱柱,色谱柱组成,一、气液分配色谱柱,二、气固吸附色谱柱,柱管,填充剂,填充柱：24米柱长，26mm内径,毛细管柱：几十米几百米柱长,0.10.5mm内径,固体吸附剂气-固吸附色谱柱,载体+固定液气-液分配色谱柱,第三节 气相色谱柱色谱柱组成 一、气液分配色谱柱柱管 填充,一、气-液分配色谱柱,固定相：载体+固定液,（一）载体,（二）固定液,一、气-液分配色谱柱固定相：载体+固定液（一）载体,（一）载体,1作用：承载固定液的作用,2要求：,比表面积大（多涂渍固定液）,无吸附性（不吸附被测组分）,化学惰性（不与固定液发生化学反应）,热稳定性好,一定的机械强度,（一）载体1作用：承载固定液的作用2要求：,3分类：,（1）硅藻土类：具有一定粒度的多孔性固体微粒,红色：吸附力强，与非极性物质配伍,白色：吸附力弱，与极性物质配伍,（2）非硅藻土类：玻璃微球，石英微球，,氟塑载体，含氟化合物,4载体的处理方法钝化，减弱吸附性,酸洗：用于分析酸类和酯类,碱洗：用于分析胺类等碱性化合物,硅烷化：用于具有形成氢键能力的较强的化合物,表面釉化,3分类：4载体的处理方法钝化，减弱吸附性,（二）固定液,1要求：,（1）操作柱温下固定液呈液态（易于形成均匀液膜）,（2）操作条件下固定液热稳定性和化学稳定性好,（3）固定液的蒸气压要低（柱寿命长，检测本底低）,（4）固定液对样品应有较好的溶解度及选择性,2分类：,化学分类法,极性分类法,（二）固定液1要求：2分类：,一、化学分类法,A烃类：烷烃，芳烃,例 角鲨烷标准的非极性固定液,B硅氧烷类：,（a）甲基硅氧烷：,弱极性,甲基硅油（n400）甲基硅油230,0,C,甲基硅橡胶（n400）SE30，OV1 350,0,C,（b）苯基硅氧烷：,极性稍强（随苯基，极性）,甲基苯基硅油（n400）,甲基苯基硅橡胶（n400）：按苯基含量不同分,低苯基硅橡胶 SE52 含苯基5%，350,0,C,中苯基硅橡胶 OV17 含苯基50%，350,0,C,高苯基硅橡胶 OV25 含苯基75%，350,0,C,（c）氟烷基硅氧烷：,中等极性,（d）氰基硅氧烷：,强极性,一、化学分类法A烃类：烷烃，芳烃,C醇类,（氢键形固定液）,非聚合醇,聚合醇 聚乙二醇（PEG-20M250,0,C）,D酯类：,中强极性固定液,非聚酯类,聚酯类 丁二酸二乙二醇聚酯（PDEGS或DEGS）,C醇类（氢键形固定液）,二、极性分类法,a相对极性法,b固定液常数法（罗氏特征常数法和麦氏常数法）,二、极性分类法a相对极性法,3固定液的选择：,（1）按相似相溶原则选择,（2）按组分性质的主要差别选择,3固定液的选择：（1）按相似相溶原则选择,（1）按相似相溶原则选择,a按极性相似原则选择：,固定液与被测组分极性“相似相溶”，K大，选择性好,非极性组分选非极性固定液，,按沸点顺序出柱，低沸点的先出柱,中等极性组分选中等极性固定液，,基本按沸点顺序出柱,强极性组分选极性固定液,按极性顺序出柱，极性强的后出柱,注：,对于中等极性组分，若沸点相同，,则按极性顺序出柱，极性较强的后出柱,（1）按相似相溶原则选择a按极性相似原则选择：注：对于中等,b按化学官能团相似选择：,固定液与被测组分化学官能团相似，作用力强，,选择性高,酯类选酯或聚酯固定液,醇类选醇类或聚乙二醇固定液,b按化学官能团相似选择：,（2）按组分性质的主要差别选择,组分的沸点差别为主 选非极性固定液,按沸点顺序出柱,沸点低的先出柱,组分的极性差别为主 选极性固定液,按极性强弱出柱,极性弱的先出柱,例：苯（80.1,0,C），环己烷（80.7,0,C）,选非极性柱 分不开；,选中强极性柱 较好分离，环己烷先出柱,（2）按组分性质的主要差别选择 组分的沸点差别为主 选,二、气-固吸附色谱柱,固定相：,1）吸附剂硅胶，AL,2,O,3,（极性，吸附力强）,活性炭（非极性）,2）分子筛：吸附+分子筛,3）高分子多孔微球GDX,有机合成高分子聚合物,吸附+分配机制,装柱过程：,1）空柱管酸洗，碱洗，乙醚洗,2）固定液（组，出正峰,载=组，不出峰,载 ,He,N2,选氢气做载气,（3）T池，池体与热丝温差，灵敏度,保证T检 T柱，以免造成检测器污染,（4）浓度型检测器，A 1/u，,以A定量，应保持u一定 （峰面积定量依据）,4影响因素及注意事项（1）桥流，灵敏度,（二）氢焰检测器（FID）,1特点,2结构,3检测原理和离子化机理,4操作条件选择和注意事项,（二）氢焰检测器（FID）1特点,1特点：质量型检测器,优点：,专属型检测器（只能测含C有机物）,灵敏度高（TCD）,响应快,线性范围宽,缺点：,燃烧会破坏离子原形，无法回收,（制备纯物质，不采用）,1特点：质量型检测器优点：专属型检测器（只能测含C有机物）,2结构,2结构,3检测原理和离子化机理,检测原理：利用组分在氢焰中产生离子流进行检测,有机化合物离子对离子流流向阴、阳极放大记录,离子化机理：化学电离理论,氢焰自由基正离子,3检测原理和离子化机理 检测原理：利用组分在氢焰中,4操作条件选择和注意事项,1）载气的选择：,载气N,2,气,燃气H,2,气,助燃气空气,2）使用温度：高于柱温50100,0,C,3）注意问题：,质量型检测器，h u，,以h定量，应保持u恒定（峰高定量依据）,4操作条件选择和注意事项1）载气的选择：,三、检测器的性能指标,（一）噪声与漂移,（二）灵敏度,（三）检测限,三、检测器的性能指标（一）噪声与漂移,（一）噪声与漂移,1噪声：无样品通过时，由仪器本身和工作条件等,偶然因素引起基线的起伏称为（以噪声带衡量）,2漂移：基线随时间向一个方向的缓慢变化称为,（以一小时内的基线水平变化来表示）,（一）噪声与漂移1噪声：无样品通过时，由仪器本身和工作条件,（二）灵敏度,（响应值，应答值）,1浓度型检测器的灵敏度（,S,c,）,灵敏度越高，噪音越大,（二）灵敏度（响应值，应答值）1浓度型检测器的灵敏度（S,2质量型检测器的灵敏度（S,m,）,2质量型检测器的灵敏度（Sm）,（三）检测限,组分峰高为噪音二倍时的灵敏度 检测限小，仪器性能好,质量型检测器,浓度型检测器,（三）检测限 组分峰高为噪音二倍时的,第五节 分离条件的选择,一、分离度（分辨率）及影响因素,二、实验条件的选择,第五节 分离条件的选择一、分离度（分辨率）及影响因素,一、分离度（分辨率）及影响因素,1分离度定义式,2影响分离的因素（分离方程，分离度计算式）,一、分离度（分辨率）及影响因素1分离度定义式,1分离度定义式,分离度：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍,（衡量色谱分离条件优劣的参数）,讨论：,1分离度定义式分离度：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值,2影响分离的因素（计算式）,前提:,定义式基础上，相邻两组分的n一致（假设）,柱选择项,柱容量项,柱效项,2影响分离的因素（计算式）前提:定义式基础上，相邻两组分,a柱效项及其影响因素,影响色谱峰的宽窄主要取决于色谱柱性能及载气流速,a柱效项及其影响因素影响色谱峰的宽窄主要取决于色谱柱性能及,讨论：,增加柱效是提高分离度的一个直接有效手段,提高柱效、改善分离的途径：增加柱长；降低板高,根据速率理论，降低板高、提高柱效的方法是：,1）采用粒度较小、均匀填充的固定相（A项）,2）分配色谱应控制固定液液膜厚度（C项）,3）适宜的操作条件：,流动相的性质和流速，柱温等等（B项）,选用分子量较大、线速度较小的载气N,2,气，,控制较低的柱温,讨论：增加柱效是提高分离度的一个直接有效手段,b柱选择项及其影响因素,影响峰的间距主要受固定相性质，以及柱温影响,b柱选择项及其影响因素影响峰的间距主要受固定相性质，以及柱,讨论：,增大柱选择性是改善分离度的最有力手段,气相色谱中，柱选择性取决于固定相性质和柱温,选择合适的固定相使与不同组分的作用产生差别,才能实现分离,一般说，降低柱温可以增大柱的选择性,讨论：增大柱选择性是改善分离度的最有力手段,c柱容量项及其影响因素,影响峰位主要受固定相用量、柱温和载气流速的影响,c柱容量项及其影响因素影响峰位主要受固定相用量、柱温和载气,讨论：,综合考虑分离度、分离时间和峰检测几项因素,控制k的最佳范围 25,GC中，增加固定液用量和降低柱温可以增加 k,讨论：综合考虑分离度、分离时间和峰检测几项因素,k 影响峰位,n 影响峰宽窄,影响两峰间距,k 影响峰位n 影响峰宽窄影响两峰间距,如何根据具体情况改进分离度？,太小，两组分未分开,应改变固定相极性，降低柱温,k 太小，n 也太小，,应增大固定液用量，降低柱温,n 太小，许多组分未分开,应设法降低板高，提高柱效,如何根据具体情况改进分离度？太小，两组分未分开k 太小，n,二、实验条件的选择,色谱条件包括分离条件和操作条件,分离条件是指色谱柱,操作条件是指载气流速、进样条件及检测器,1色谱柱的选择,2柱温的选择,3载气与流速的选择,4进样条件的选择,二、实验条件的选择色谱条件包括分离条件和操作条件1色谱柱的,1色谱柱的选择（以气液分配色谱为主）,（1）固定相的选择,（2）柱长的选择,1色谱柱的选择（以气液分配色谱为主）（1）固定相的选择,（1）固定相的选择,固定液的选择:,1）按“相似相溶”原则：极性相似或官能团相似,2）按组分性质主要差别：,沸点相差大的选非极性固定液,沸点相差小的选极性固定液,3）柱温 1.5选择L，一般较短(0.66m),不可以无限延长柱子,（2）柱长的选择注：根据R1.5选择L，一般较短(0.6,例：两组分在1 m长柱子上的分离度为0.75，问使用,多长柱子可以使它们完全分离？,解：,例：两组分在1 m长柱子上的分离度为0.75，问使用解：,2柱温的选择,原则：,1）在能保证R的前提下，尽量使用低柱温，,但应保证适宜的t,R,及峰不拖尾，减小检测本底,2）根据样品沸点情况选择合适柱温,柱温应低于组分沸点50100,0,C,宽沸程样品应采用程序升温,2柱温的选择原则：,程序升温好处,改善分离效果,缩短分析周期,改善峰形,提高检测灵敏度,程序升温好处,3载气与流速的选择,选择载气应与检测器匹配,TCD选H,2,，He（u 大，粘度小）,FID选N,2,（u 小，粘度大）,选择流速和载气应同时考虑对柱效和分析时间的影响,3载气与流速的选择选择载气应与检测器匹配选择流速和载气应同,4进样条件的选择,气化室温度一般稍高于样品沸点,检测室温度应高于柱温3050,0,C,进样量不可过大，否则造成拖尾峰,注：,检测器灵敏度足够进样量尽量小,最大允许进样量使理论塔板数降低10%的进样量,4进样条件的选择气化室温度一般稍高于样品沸点 注：,例：已知物质A和B在一根30.0cm长的柱上的保留时间分别为,16.40和17.63min，不被保留组分通过该柱的时间为.30min，,峰底宽为1.11和1.21min，试计算,（1）柱的分离度（2）柱的平均塔板数（3）塔板高度,（4）达1.5分离所需柱长,解：,例：已知物质A和B在一根30.0cm长的柱上的保留时间分别为,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,第六节 定性定量分析,一、定性分析,二、定量分析,第六节 定性定量分析一、定性分析,一、定性分析,1利用保留值定性,1）已知对照物定性：定性专属性差,注：,不同组分如在某一色谱条件下保留值相同，应,更改色谱柱再检测，粗步推算是否为一个纯物质峰,2）相对保留值定性,3）利用保留指数定性：唯一可靠、准确、重复性好,2利用化学反应定性：收集柱后组分，官能团反应,定性鉴别（非在线）,3利用两谱联用定性：GC-MS，GC-FTIR,一、定性分析1利用保留值定性 3）利用保留指数,二、定量分析,以峰高或峰面积定量,（一）峰面积的测量,（二）定量校正因子,（三）定量方法,二、定量分析 以峰高或峰面积定量（一）峰面积的测量,（一）峰面积的测量,2非正常峰（不对称峰）,1对于正常峰,3自动求和（自动积分仪或色谱工作站）：,直接给出A，h，W,1/2,注：当色谱操作条件一定时，在一定进样量范围内,（不超载），W,1/2,与进样量无关,（一）峰面积的测量2非正常峰（不对称峰）1对于正常峰,（二）定量校正因子,1两种表示方法,（二）定量校正因子 1两种表示方法,2相对校正因子的测定,3注意事项：,相对校正因子与待测物、基准物和检测器类型有关，,与操作条件（进样量）无关,基准物：,TCD苯；FID丁庚烷,以氢气和氦气作载气测的校正因子可通用,以氮气作载气测的校正因子与两者差别大,2相对校正因子的测定3注意事项：,（三）定量方法,1归一化法,2外标法,3内标法,4内标对比法,（三）定量方法1归一化法,1归一化法,前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰,依据：组分含量与峰面积成正比,优点：,简便，准确,定量结果与进样量、重复性无关（前提柱子不超载）,色谱条件略有变化对结果几乎无影响,缺点：,所有组分必须在一定时间内都出峰,必须已知所有组分的校正因子,不适合微量组分的测定,1归一化法前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰优点,2外标法：以待测组分纯品为对照物，与试样中待测 组分的响应信号相比较进行定量的方法,a工作曲线法：i纯品工作曲线，同体积样品与之比较,前提：,进入检测器样品量与峰面积成正比,b外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量,前提：,截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近,c外标两点法：,前提：,选 取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度,外标法特点：,1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰,2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大,每次进样量应一致，否则产生误差,2外标法：以待测组分纯品为对照物，与试样中待测,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,3内标法：,无待测物纯品，加入样品中不含对照物，以待测组分和对照物的响应信号对比定量,对内标物要求：,a内标物须为原样品中不含组分,b内标物与待测物保留时间应接近且R1.5,c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质,内标法优点：,进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响,只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关,适合测定微量组分,内标法缺点：,制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子,3内标法：无待测物纯品，加入样品中不含对照物，,4内标对比法,（已知浓度样品对照法）配制等量加入内标物的样品溶液和对照品溶液,内标对比法特点：,不需要校正因子,进样量对结果影响不大,注：,对于正常峰，可以h代替A计算含量,4内标对比法（已知浓度样品对照法）配制等量加,例：内标法测定无水乙醇中微量水分,例：内标法测定无水乙醇中微量水分,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,第九章 高效液相色谱法,第一节 概述,高效液相色谱法：,以气相色谱为基础，在经典液相,色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,一、HPLC与经典LC区别,二、HPLC与GC差别,三、高效液相色谱仪流程图,四、特点,第九章 高效液相色谱法第一节 概述 高效液相色谱法：以气相,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段,柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀,常压输送流动相,柱效低（H，n）,分析周期长,无法在线检测,2HPLC：分离和分析,柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）,高压输送流动相,柱效高（H，n）,分析时间大大缩短,可以在线检测,一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检,二、HPLC与GC差别,相同,：兼具分离和分析功能，均可以在线检测,主要差别,：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象,GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，,高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及,高聚物的样品不可检测,占有机物的20%,HPLC：溶解后能制成溶液的样品，,不受样品挥发性和热稳定性的限制,分子量大、难气化、热稳定性差及高分子,和离子型样品均可检测,用途广泛，占有机物的80%,二、HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线,2流动相差别,GC：流动相为惰性气体,组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用,HPLC：流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、,改善分离度增加了因素，对分离起很大作用,流动相种类较多，选择余地广,流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用,选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相,可以增大分离选择性,3操作条件差别,GC：加温操作,HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,2流动相差别3操作条件差别,三、高效液相色谱仪流程图,1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）,2高压泵（输液泵）,3进样装置,4色谱柱分离,5检测器分析,6废液出口或组分收集器,7记录装置,三、高效液相色谱仪流程图1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）,第二节 基本理论和条件选择,热力学理论：塔板理论平衡理论,动力学理论：速率理论Vander方程,一、塔板理论,二、速率理论,三、HPLC法中分离条件的选择,第二节 基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论平衡,一、塔板理论,一、塔板理论,二、速率理论（与GC对比）,1),二、速率理论（与GC对比）1),2）涡流扩散项及其影响,2),讨论：,1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）,2）涡流扩散项及其影响2)讨论：,仪器分析第八章-气相色谱分析法、液相和离子色谱课件,3）,传质阻抗项及其影响,3）传质阻抗项及其影响,三、HPLC法中分离条件的选择,1.固定相与装柱方法的选择：,选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）,首选化学键合相，匀浆法装柱,2.流动相及其流速的选择：,选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min,3.柱温的选择：,选室温25,0,C左右,三、HPLC法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：,第三节 各类高效液相色谱法,一、液固吸附色谱法（LSC）,二、液液分配色谱法（LLC）,三、化学键合相色谱法（BPC）,第三节 各类高效液相色谱法 一、液固吸附色谱法（LSC）,一、液固吸附色谱法（LSC）,流动相为液体，固定相为固体吸附剂,1分离机制,：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性,中心能力的差异,分离前提,：K不等或k不等,一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，,2固定相：,与LC比，固定相粒径不同（10m）,（2）高分子多孔小球：YSG,原理：吸附+分配,蒹小孔凝胶作用,特点：柱选择性好，峰形好，柱效低,适用：分离弱极性化合物,（1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）,全多孔硅胶 无定形 YWG 56m 510,4,球形 YQG 34m 810,8,堆积硅珠 YQG 34 m 810,8,理想,原理：吸附,特点：峰易拖尾,适用：分离极性化合物,2固定相：与LC比，固定相粒径不同（17%分配色谱 硅胶失活载体,吸附的水固定液,3流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂 4影响k的,二、液液分配色谱法（LLC）,1,分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异,2,固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）,缺点：系统内部压力大，易流失，不实用,固定液极性NLLC,固定液非极性RLLC,3,正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）,极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱,适于分离极性组分,反相色谱固定液极性 固定相极性,底剂+有机调节剂（极性调节剂）,例：水 +甲醇，乙腈，THF,（二）反相键合相色谱1分离机制：疏溶剂理论,4流动相极性与k的关系：,流动相极性，洗脱能力，k，组分t,R,5出柱顺序：极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱,6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,4流动相极性与k的关系：,（三）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、,诱导力、或氢键作用力,2固定相：极性大的氰基或氨基键合相,3流动相：极性小（同LSC）,底剂 +有机极性调节剂,例：正己烷 +氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,（三）正相键合相色谱1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作,4流动相极性与k的关系：,流动相极性，洗脱能力，组分t,R,，k,5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱,6适用：,氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）,分离物质也相似,氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性,分析极性大物质、糖类等,4流动相极性与k的关系：,（四）离子对色谱和离子抑制色谱,1反相离子对色谱法,2反相离子抑制色谱,（四）离子对色谱和离子抑制色谱1反相离子对色谱法,1反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分,与其中的反离子形成中性离子对，增加k和t,R,，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱,四丁基季胺盐分析酸,2）影响k的因素,a与m的极性有关（同反相色谱）,b与R的链长有关：R长，极性小，t,R,，k,3）适用：较强的有机酸、碱,1反相离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流,2反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制,组分解离，增加其k和t,R,，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质,pH一定的缓冲溶液,2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关,选择流动相：应同时考虑极性及pH值,酸性物质加入酸HAc t,R,，k,碱性物质加入碱NH,3,H,2,O t,R,，k,调节pH范围：3.08.0,pH8.0 破坏键合相与载体的结合,pH3.0 腐蚀柱子,3）适用：极弱酸碱物质,pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,2反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相,第五节 高效液相色谱仪,1泵：,恒压泵：流量精度不稳,恒流泵：常用,2进样装置,1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）,GC系统压力较小，可以,HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）,2）阀进样：不必停泵，六通阀,第五节 高效液相色谱仪1泵：,3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm,柱效评价：色谱系统适应性试验,R，n，f,s,（拖尾因子）,柱再生：维护、保养、柱子的冲洗,4检测器,1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质,2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质,灵敏度高,3）示差折光检测器：利用折光率的差别,灵敏度低，温度要求严格,4）电化学检测器,5）化学发光,3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm,高效液相色谱仪器,high performance liquid chromatograph,高效液相色谱仪器 high,高效液相色谱仪流程示意,色谱柱,进样,高压泵,贮液泵,温度控制,记录仪,检测器,梯度洗脱装置,高压输液系统,分离系统,检测系统,进样系统,记录系统,高效液相色谱仪流程示意色谱柱进样高压泵贮液泵温度控制记录仪检,流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,HPLC仪器结构示意图（方框图）,流程及主要部件 process and main asse,2.主要部件,(1)高压输液泵,主要部件之一，压力：15035010,5,Pa。,为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。,应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2.主要部件(1)高压输液泵,(2)梯度淋洗（洗提、洗脱）装置,内（高压）梯度:,利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,外（低压）梯度:,一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,分离过程中按一定程序连续改变载液,中溶剂即流动相的配比和极性以提高,分离效果（类似GC中的程序升温）,(2)梯度淋洗（洗提、洗脱）装置,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态，,通常使用耐高压的六通阀进样装置，,其结构如图所示：,(3)进样装置 流路中为高压力工作状态，,(4)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，标准内径4.6或3.9 mm，柱长1530 cm，填料颗粒粒度510m,柱效7000-10000。发展趋势是减小填料粒度(35m)和柱径以提高柱效。,(4)高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，标准,(5)液相色谱检测器,a.紫外检测器(ultraviolet photometric detector),原理：朗伯比尔定律。,优点：应用最广，对大部分有机化合物有响应，灵敏度高，线性范围宽。是高效液相色谱仪的,标准配置,。它的最重要特征是对流动相的流速（脉冲）和温度变化不敏感，可用于,梯度洗脱,。其次，流通池可做的很小（1mm10mm，容积8L)。固定波长汞灯254、280nm,可变波长氘灯200450nm.光路长510mm。,缺点：对无紫外吸收的,组分不响应，而对紫外吸收,较大的溶剂如苯不能作流动,相使用。,双光路紫外检测器,(5)液相色谱检测器 a.紫外检测器(ultrav,b.光电二极管阵列检测器(photo-diode array detector;PDAD),光电二极管阵列检测器：,1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,b.光电二极管阵列检测器(photo-diode arra,c.示差折光检测器,（differential refractive index detector）,原理：通过连续检测参比池和样品池中流动相之间的折射率之差值来测定样品浓度（折射率差值与浓度呈正比）。,特点,：,通用型检测器（每种物质具有不同的折射率）；灵敏度低、对温度敏感、,不能用于梯度洗脱,。,结构：偏转式、反射式和干涉型三种,入射角不变时，,光速折射偏转,角是介质中成,分变化的函数。,c.示差折光检测器（differential refr,示差折光检测器,示差折光检测器,d.荧光检测器,（fluorescence detector）,特点,：,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,原理：有机共轭芳环分子受紫外光激发后发出荧光,。,结构：直角型结构,。,d.荧光检测器（fluorescence detecto,e.电导检测器（electrical conductivity detector）,原理：根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来,测定电离物质的含量。,特点,：,广泛用于离子色谱仪中。应用于能电离成离子物质的检测。响应受温度影响较大。,结构：,由一对平行的铂电极（表面镀铂黑以增加表面积）,和池体构成电导检测池，两电极构成电桥的一个测量臂。,e.电导检测器（electrical conductivi,4、实验过程（高效液相色谱法相关参数测定）,（,1,）实验目的,熟悉高效液相色谱仪性能检查及色谱柱参数测定的方法,了解仪器的一般使用方法,4、实验过程（高效液相色谱法相关参数测定）（1）实验目的,高效液相色谱法分离过程,进样口,检测器,色谱图,色谱柱,溶剂,高压泵,混合器,高压输送流动相,高效固定相,在线检测,色谱柱多次使用,高灵敏检测器,（2）实验,原理,高效液相色谱法分离过程进样口检测器色谱图色谱柱溶剂高压泵混合,仪器：高效液相色谱仪，ODS色谱柱，容量瓶等,试剂：苯（AR)，萘(AR)，苯磺酸钠(AR)，甲醇（色谱纯），重蒸馏水等,(3)仪器与试剂,仪器：高效液相色谱仪，ODS色谱柱，容量瓶等(3)仪器与,(4)液相色谱仪的构造,色谱柱系统,检测系统,进样系统,流动相,(4)液相色谱仪的构造色谱柱系统检测系统进样系统流动相,（5）实验步骤,实验条件,色谱柱：ODS 柱(15cm4.6mm，5m),流动相：MeOH-H,2,O（8020）,柱温：室温,检测器：UV 254nm,流速：0.8ml/min,（5）实验步骤 实验条件,操作步骤,1)观察流动相流路;,2)开电源开关；,3)启动泵;,4)设定压力上、下限;,5)设定分析流速及压力上下限；,（6）实验步骤,操作步骤（6）实验步骤,设定流速及压力上/下限,泵启动停止键,电源开关,输入信息,设定流速及压力上/下限 泵启动停止键电源开关输入信息,6)设定波长;,检测电源开关,波长设定键,零点调节键,输入信息,6)设定波长;检测电源开关波长设定键零点调节键输入信息,7)将进样阀手柄上下扳动几次，最后停在INJECT(采样)位置；,8)进样分析;,9)记录数据与数据处理;,10)分析结束后停泵，将进样阀手柄置LOAD位置；,11)停泵；,12)关闭电源开关,7)将进样阀手柄上下扳动几次，最后停在INJECT(采样)位,定性、定量重复性,（7）数据处理,1,2,3,4,5,平均值,SD,RSD,t,R,(苯),t,R,(萘）,t,R,A,苯,A,萘,A,苯,/A,萘,W,1/2,(苯),W,1/2,(萘）,定性、定量重复性（7）数据处理 1 2 3 4 5,（8）计算公式,R=,=,（8）计算公式R=,例题1：,在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即,R,=1.5 。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？,解：,r,21=100/85=1.18,n,有效 =16,R,2,r,21 /(,r,21 1)2=161.52(1.18/0.18)2,=1547（块）,L,有效 =,n,有效,H,有效 =15470.1=155 cm,即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,例题1：在一定条件下，两个组分的调整保留时间,例题2：,在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，计算分离度。要达到完全分离，即,R,=1.5，所需要的柱长。,解：,分离度,：,塔板数增加一倍，分离度增加多少？,例题2：在一定条件下，两个组分的保留时间分别为,