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Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响,主讲:房向东,The effect of Emodin on the human renal tubular epithelial to mesenchymal transition induced by albumin,大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响主讲:房向东T,研究背景,1,技术路线与方法,2,结 果,3,讨 论,4,结 论,5,概 要,研究背景1技术路线与方法2结 果3讨 论4结 论,蛋白尿不仅仅是肾脏损伤的生物学标志,还是加速肾脏疾病向终末期肾衰进展的主要危险因素之一。,研究背景,研究背景,肾脏损伤,蛋白尿,临床表现,反作用,物理损伤,诱导化学趋化因子、炎症因子,激活补体,促进细胞凋亡,损伤及加速纤维化机制,肾脏损伤蛋白尿临床表现反作用物理损伤诱导化学趋化因子、炎症因,1,、正常肾单位的丢失和肾结构的破坏,2,、成纤维细胞及肌成纤维细胞的大量增生,3,、细胞外基质的产生和积聚,病理变化,肾脏纤维化,研究背景,1、正常肾单位的丢失和肾结构的破坏 2、成纤维细胞及肌成纤维,肾间质纤维化,肾小球硬化,肾脏纤维化,肾间质纤维化是关键!,间质纤维化的程度更能预测肾功能的变化!,研究背景,肾间质纤维化肾小球硬化肾脏纤维化肾间质纤维化是关键!间质纤维,肾小管上皮细胞,-,肌成纤维细胞转分化(,TEMT,),在肾间质纤维化的发生发展中有着重要的作用,它被定义为,肾小管上皮细胞丢失了上皮表型,而获得新的肌成纤维细胞特征的过程,。,研究背景,转分化,ECM,ECM,ECM,上皮细胞,肌成纤维细胞,肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)研究背景,化学名:,3-,甲基,-1,,,3,,,8-,三羟基蒽醌,大黄素,传统的生物学作用:抗菌消炎、抗肿瘤、免疫抑制、保肝、,护肾,研究背景,保护肾脏作用:清除氧自由基及炎症因子、抗细胞增殖、促细胞外基质降解、阻滞,TEMT,化学名:3-甲基-1,3,8-三羟基蒽醌大黄素传统的生物学作,体内外研究发现大黄素可延缓糖尿病肾病、梗阻性肾病等肾脏纤维化发生,其中阻滞,TEMT,过程发挥重要地位。,研究背景,体内外研究发现大黄素可延缓糖尿病肾病、梗阻性肾病等肾脏,研究目的,白蛋白能否诱导,HK-2,细胞转发生转分化过程,、促进细胞外基质合成,大黄素对白蛋白产生的上述过程是否产生影响,?,?,研究目的白蛋白能否诱导HK-2细胞转发生转分化过程 大黄素对,技术路线与分组,空白对照组,大黄素对照组,大黄素干预组,白蛋白诱导组,HK-2,细胞,无处理因素,20g/ml,大黄素作用,0,、,12,、,24,、,48h,5mg/ml,白蛋白刺激时同时加入,20g/ml,大黄素作用,0,、,12,、,24,、,48h,观察各组细胞形态学变化,收集细胞总,RNA,半定量检测,-SMA,、,E-cadherin,、,FNmRNA,的表达,5mg/ml,白蛋白作用,0,、,12,、,24,、,48h,技术路线与分组空白对照组 大黄素对照组大黄素干预组白蛋白诱,各组,实验重复,3,次,所有数据以,xs,表示,行,方差齐性检验,,多组间计量资料采用单因素方差分析,用,SPSS12.0,软件对数据进行处理,以,P,0.05,为有显著性差异,P,0.01,有非常显著性差异,统计方法,各组实验重复3次,所有数据以xs表示,行方差齐性检验,多组,RT-PCR,正常,HK-2,细胞仅表达少量的,-SMA,、,FNmRNA,,,而,E-cadherinmRNA,的表达较强。,E-cadherin,-SMA,FN,M 0 12 24 48h,大黄素对照组上述因子的表达与正常对照组无差异,结 果,RT-PCR正常HK-2细胞仅表达少量的-SMA、FNmR,白蛋白诱导,HK-2,细胞表型转化及大黄素干预后的效果,白蛋白可诱导,HK-2,细胞发生表型转化,即,E-CadherinmRNA,的表达下调,,-SMAmRNA,的表达上调,与,0h,比较,,12h,后即有差异,,48h,后差异显著,,p,0.01,。而同时加入,20g/ml,大黄素作用后,其变化趋势明显减弱。,-SMA,白蛋白诱导,大黄素干预,M 0 12 24 48h,结 果,白蛋白诱导HK-2细胞表型转化及大黄素干预后的效果 白蛋白可,白蛋白诱导,HK-2,细胞表型转化及大黄素干预后的效果,E-cadherin,大黄素干预,白蛋白诱导,M 0 12 24 48h,M 0 12 24 48h,白蛋白诱导HK-2细胞表型转化及大黄素干预后的效果 E-ca,白蛋白诱导,HK-2,细胞分泌纤维连接蛋白(,FN,)的情况及大黄素干预后的效果,FN,的表达随白蛋白刺激时间延长而逐渐增多,在大黄素干预后其表达上调趋势亦明显减缓。,FN,白蛋白诱导,大黄素干预,M 0 12 24 48h,白蛋白诱导HK-2细胞分泌纤维连接蛋白(FN)的情况及大黄素,讨 论,蛋白尿与肾小管间质损伤,蛋白尿的水平反映了肾小球损伤的程度,MDRD,试验,把蛋白尿基础排出量作为独立的危险因素纳入加速慢性肾脏病进展的研究,临床研究发现,CKD,患者在应用,ACEI,、,ARB,类药物可非依赖降压作用减少尿蛋白量的排泄而延缓慢性肾脏病恶化速度,降尿蛋白和延缓,GFR,下降之间有着紧密的联系,蛋白尿的程度对,CKD,预后具有很强的预测价值。,讨 论蛋白尿与肾小管间质损伤蛋白尿的水平反映了肾小球损伤的,讨 论,蛋白尿与肾小管间质损伤,我们的实验结果发现,,5mg/ml,人纯化白蛋白刺激,HK-2,细胞一段时间内后,上皮细胞表型标志物,E-cadherinmRNA,表达下调,肌成纤维细胞表型物,-SMAmRNA,表达上调,且随白蛋白作用时间的延长表达水平逐渐增强。,结果表明,HK-2,细胞发生表型转变,介导了肾小管间质纤维化的发生。,讨 论蛋白尿与肾小管间质损伤我们的实验结果发现,5mg/ml,讨 论,TEMT,与肾小管间质纤维化,TEMT,在肾间质纤维化的发生发展过程中发挥重要作用,TEMT,过程包括:肾小管上皮细胞的黏附属性缺失,(E-,钙粘蛋白减少,),,肾小管基底膜的破坏,表达,-SMA,的肌成纤维细胞增多及其向间质迁移最终导致间质纤维化。,讨 论TEMT与肾小管间质纤维化TEMT在肾间质纤维化的发生,肾间质纤维化的另一决定因素是,ECM,合成与降解平衡的调节,肌成纤维细胞分泌,FN,参与,ECM,构成。,本研究选择,FN,作为观察,ECM,聚积的评价指标,TEMT,与肾小管间质纤维化,讨 论,肾间质纤维化的另一决定因素是ECM合成与降解平衡的调节 TE,我们实验结果发现正常肾小管上皮细胞因未发生明显转分化,其,FNmRNA,的分泌甚微,,而,5mg/ml,人白蛋白诱导,HK-2,细胞转分化的发生同时,检测到,FNmRNA,表达呈现时间依赖性增强,进一步参与肾间质纤维化的形成。,TEMT,与肾小管间质纤维化,讨 论,我们实验结果发现正常肾小管上皮细胞因未发生明显转分化,其FN,讨 论,大黄素阻滞,TEMT,在肾间质,纤维化中的作用,实验中,我们通过使用,20g/ml,大黄素与白蛋白共同作用,HK-2,细胞制造干预模型。,实验结果发现,经大黄素干预后,HK-2,细胞后其,E-cadherinmRNA,的表达亦有渐降趋势,,-SMA mRNA,表达上升,但在,48h,内其下降,/,上升趋势呈明显减缓,较白蛋白诱导组有明显差异。,大黄素部分阻滞了,HK-2,细胞的,TEMT,过程。,讨 论大黄素阻滞TEMT在肾间质实验中,我们通过使用20,讨 论,大黄素阻滞,TEMT,在肾间质,纤维化中的作用,而通过对,FNmRNA,表达情况的检测发现:经大黄素干预后,,FNmRNA,表达亦受到部分抑制。,原因可能为:,1,、大黄素阻滞了,HK-2,细胞的转分化发生,使得,Myof,细胞生成减少,进而减少了,FN,的表达和分泌来源;,2,、大黄素可抑制,Myof,细胞对,FN,的表达和分泌过程。,讨 论大黄素阻滞TEMT在肾间质而通过对FNmRNA表达情,!,20g/ml,大黄素可在,48h,内呈时间依赖性的减轻白蛋白诱导的,HK-2,细胞转分化过程,延缓肾间质纤维化的进展。,结论,!20g/ml大黄素可在48h内呈时间依赖性的减轻白蛋白诱,thanks,thanks,
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