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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 生物制品生产,1,主要内容,第一节,细胞大规模培养,第二,节,动物细胞制药,第三,节,植物次生代谢产物的生产,2,第一节,细胞,大规模培养,大规模培养技术是建立在实验室培养方法（贴壁培养法和悬浮培养法）的基础上，再利用固定化细胞、人工灌注、生物反应器技术等技术发展起来的。,一、细胞培养的操作方式,二、大规模细胞培养,系统,3,一、,细胞培养的操作方式,培养方式分为：,分批式,流加式培养,半,连续式,连续灌,注式,4,1,、分,批式,培养,指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。,5,分,批,式,培养特点,系,统密闭，只允许气体和挥发性代谢物质与外界交换。,培养基体积固定，当主要营养物质耗尽时，细胞即停止生长，又称为分批培养或间歇,培养，多在,3-5d/,批。,细胞数目、总重量、,DNA,含量呈“,S”,形,(,五个,时期,),变化。,为保证细胞不断增殖,，须在达到最,大重量时取,出,1/5,1/3,的培养液，转,移继,代培养。,是传统的、常用的方法，可直接放大。其工业反应器规模可达,12000L,。,6,7,2,、,半连续式（流加式）培养,指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不,变。,8,3,、,流加式培养,在分批式操作的基础上，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平。,由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态，是当前动物细胞培养工艺中占有主流优势的培养工艺。,9,4,、连续,灌注,式培养,是把细胞接种后进行培养，新鲜的培养,液不断从,反应器一,头加,入，从另一头不断取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不,断供应状,态。使反应条件处于一种恒定状,态。,10,连续灌注式培,养特点,1,）不断加入新培养基，保证了营养物质的充分供应。,2,）培养期细胞增殖速度快，细,胞生长速率长久地保持在对数,生长,期,，形,成一个稳定的培养状态。,3,）适用,于细胞大,规模工业化培,养。,4,）,由于连续培养需要的设备比较复杂，投入较大，且要维持细胞无菌状态，技术条件要求苛刻，因此,未得到广泛应用,。,11,12,开放式连续培养-,细胞随排出培养液一起流出且速度恒定。在稳定状态下流出细胞的速率等于培养系统中新细胞的增长速率。,封闭式连续培养-,新鲜培养液和老培养液以等量方式进出,，,而收集的细胞重新放入原培养系统中继续培养，故培养系统中细胞数量是在不断增加的。,13,14,二、大规模细胞培养方法,按供养方式分为三种：,搅拌式、气升式、旋转式,按,细胞固定分为,四种,：,悬浮培养、,微载体培养、,微囊化培养,、,微导管培养（中空纤维,培养,）。,15,机械搅拌式,(Spinner),机械搅拌式主要是通过不锈钢搅拌系统使培养物的混匀。在罐体顶端有一些传感器，监测培养物的温度、,pH,值、溶氧度,(DO),、葡萄糖消耗、,NH,3,、,NH,4,+,等参数。这种反应器培养规模可达,2 000 L,。,16,该系统优点：,（,1,）设计简单，操作方便，易于放大生产；,（,2,）细胞密度高，达到,10,7,/mL,以上；,（,3,）便于无菌操作，不易污染；,（,4,）氧的转换率高，能满足细胞在生长时所需的要求。,缺点：,对细胞损伤较大，产物含量不高。,17,气升,搅拌,式,气体从罐底的喷射管进入反应器的导流管。湍流温和而均匀，循环量大，细胞与培养液混合均匀。剪切力小，细胞的伤害小。喷射供氧，氧传递速率高，供氧良好。,适用于悬浮细胞分批培养,、,微载体和连续培养。,18,工作原理,反应器运转时，圆筒以30-60,r/min的速度转动，由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的气体成分均匀地分布到反应器内。,19,Celltech,公司采用气升式反应器培养杂交瘤细胞,，生产单克隆抗体。生产周期为,14,400h,。从10L逐级放大到10000L,。,17d生产抗体100g，,抗体合成大多数处于稳定期和衰退期，,比传统摇瓶提高约5倍。,20,通气搅拌式细胞培养反应器,21,22,23,旋转式细胞培养系统,20,世纪,90,年代中期，美国宇航局开发一系列旋转式细胞培养系统,(The rotary cell culture system,RCCS),，又叫回转式生物反应器,(Rotatingwall vessel biore-actor,RWVB),。,RCCS,是绕水平轴旋转、无气泡、膜扩散式气体交换的培养系统。,24,该反应器是将细胞种植到微载体后，将其移入,RCCS,圆柱状的培养容器内，加满培养液。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，并随容器一起旋转且不与容器壁和其它物体相撞。细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出,CO,2,。,由于系统无推进器、气泡或搅拌器,使破坏性应力减到最小。因此，细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长，得到类似人体内的培养产物,.,近年来已经广泛应用于微载体系统，至今已有近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。,25,26,悬浮培养,与微生物的肉汤培养基本相同。,悬浮培养细胞增殖快、产量高，没有接触抑制特性，是动物大规模培养的理想方法。,但只有极少数动物细胞适宜进行悬浮培养，适用于确立,细胞株（系）、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液和淋巴细胞,培养。,27,微载体培养,微载体为三维培养系统，细胞贴附于微载体上伸展和增殖，,微载体,悬浮于培养液中。,微载体培养具贴壁和悬浮培养的双重优点，有很大的比表面积，供单层细胞贴附和增殖。,悬浮微球使细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，,容易放大。,20世纪80年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原等。,28,理想的微载体所具备的性能：,质地柔软，微球间摩擦轻；,耐高温，可高压灭菌；,透明性，便于观察细胞生长；,细胞相容性，利于贴附和生长；,无毒性和惰性，对细胞无毒害，不产生有害物质，不吸附培养基；,低速即悬浮，静止即沉降，便于换液和收获；,微粒大小均匀；可回收重复,使用。,29,为了提高贴壁能力，对基质表面进行包埋，如血清蛋白、多聚赖氨酸处理，可加速贴壁过程。,悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。,将这些微载体悬浮在培养液中,，,大大增加细胞的贴壁面积，,可使,每毫升培养基达到1000万个,（10,8,）,细胞的密度,。,30,常用微载体,玻璃珠：,直径约,2,3,m,，密度,1.5 g/cm3,。在玻璃表面覆盖塑料或中空玻璃也可达到此密度。,葡聚糖微载体：,带正电，干粉在,pH7.2,的磷酸盐缓冲液中吸胀，清洗灭菌后使用。,Cytodex 2,：,电荷性大大下降，吸附能力很低，适合于蛋白质药物的生产。,纤维素微载体,DE52,和,DE53,：,适合多种细胞培养。,聚丙烯酰胺载体：,贴壁较快，亲水性。,31,多孔微载体：,直径,0.2,5 mm,，孔径,20,300,m,，达占总体积的,85%,，,极大地增加了比表面积，,可实现细胞的固定化，达到高密度培养。,广泛使用的有,：,Cellsnow,、,Cytocell,（纤维素基质）、,Verax,、,Cultisphere,（胶原）、,Cytoline 1,和,2,（聚苯乙烯）、,ImmobaSil,（硅橡胶）及,Siran,（玻璃）等。,主要用于搅拌、固定床和流化床反应器。,32,33,微囊化培养,利用固定化细胞技术，将一定量细胞与约4的褐藻酸钠混合后，滴到CaCl,2,溶液中，,构成,半透性微胶囊。,又称固定化细胞、大载体培养法。,34,1,）,细胞在微胶囊内生长，既吸收外界营养，又可排出自身代谢物,。,2,）细胞所受的,剪切力,损伤小，,细胞生长良好，纯度提高。,便于连续培养，提高,培养细胞的利用率；,3,）,细胞培养密度高，生长缓慢，有利于次生代谢产物的积累，提高,产量。,35,4,）次生代谢物直接分泌到培养液中，可简化分离、收获步骤，提高工作效率。如次生代谢物不分泌，,培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体。,5,）固定化细胞的氧气、营养供应与传递及细胞的遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。,这种培养方法是生产单克隆抗体、干扰素的一种有效培养方法。目前，美国药用产品大规模生产常用此法进行。,36,37,38,中空纤维（微导管）培养,是模拟体内细胞三维生长环境而发明的,。,将由硝酸纤维素或醋酸纤维素构成外径不超过1mm（1mm）的微导管平铺成层，,相当于体内的毛细血管,。,微导管表面贴壁生长细胞，,管内通无菌空气，管外浸泡在培养液中，,气体、,水分及其它营养物质可以通过微导管与细胞进行交换。,微导管表面的细胞密度可达,100万/cm,2,个。,细胞密度可达10,8,/m,L,。,39,接种孔 水套层 产物出口,培养基入口,产物出口,培养基入口,内膜,外膜,腔室,细胞,培养基分散后,灌入床层。纤维管壁薄，,半透膜，截留不同分子量。,纤维管的,空腔,组成的,内室,：灌流含氧气的培养基,纤维管之间的空间组成的,外室,：细胞生长。,40,细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。,细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。,在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流出来。此时虽然细胞停止分裂，但细胞的存活、健康和核形态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。,41,第二节 动物细胞生物制药,用,动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，特别是人源细胞的培养,，,在药物生产中的位置越来越重要。,一、表达蛋白的宿主系统,二、,生产用动物细胞的要求,三、常用动物细胞的特性,四、基因工程细胞构建和筛选,五、细胞库的建立,42,常见,的动物细胞培养产物,疫苗,小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗、风疹疫苗,单克隆抗体,IgG,、,IgM,、,IgA,等,免疫调节剂,细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、胸腺,肽,酶,胰蛋白酶、尿激酶、胶原酶、胃蛋白酶,激素,生长激素、促红细胞生成素,43,基因工程药物生产示意图,44,一、表达目的蛋白的宿主系统,总体分为：原核表达系统和真核表达系统。,常见的宿主系统,细菌、酵母、霉菌、丝状真菌、植物细胞、哺乳动物细胞,等。,45,原核表达系统,-,细菌,特点：繁殖快、易于培养，,限制：,表达的蛋白质缺乏转录后的修饰；,原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需要破碎细胞提取产物，给产物的分离纯化带来困难；,还易受外源毒素的污染。,46,真核表达系统,特点,表达后的蛋白有修饰作用，与人体自身分泌的天然蛋白非常近似；,动物细胞表达的蛋白都是胞外分泌，产物的分离纯化过程非常简单。,但是，动物细胞大规模培养比较复杂，目前仍处于发展完善阶段。,47,表达系统的选择,原核表达系统：一般,“,小分子、结构简单,”,的蛋白生产，且,蛋白转录后无需修饰,，如胰岛素；,真核表达系统：主要“,生产大分子、结构复杂的蛋白,”,，并且转录后的,修饰对蛋白的生物活性具有重要影响,，如组织型纤溶酶原激活剂,(tPA,）、促红细胞生成素等（,EPO,）等。,对既可用原核、可用真核表达的蛋白如,-,干扰素、人生长激素等，应综合考察生产的经济成本和技术难易程度等选择表达系统。,48,口蹄疫疫苗生产示意图,49,过去使用动物生产的生物制品，经常发生,过敏反应或病原体传染事件,。如脊,髓灰质炎疫苗,可能被猿猴肾病毒污染；用人血制备的某些生物制品可能被,肝炎或艾滋病病毒污染,。,采用细胞工程生产的产品能将致病因素降到最小：,动物细胞培养所用的细胞背景明确，经过严格的安全检测，消除了污染病原体的危险。,50,实例,EPO,的生产：,以前需要从,2500L,再生障碍性贫血病人的尿液中才能提取极微量的,EPO,用于实验室分析。现在，通过大规模培养基因工程细胞生产的,EPO,，已经治疗了成千上万的肾性贫血的病人。,胰岛素的生产：,过去从猪胰腺中提取胰岛素，但某些患者会引起抗原抗体反应。基因工程可以用人胰岛素基因生产人源化蛋白，克服免疫反应的缺点。,51,动物细胞表达系统的不足,细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他表达系统。,如,骨髓细胞MPG,-,11生产IgG,，,每个,细胞,1,分钟为,5pg，10L反应器，,细胞,密度为10,7,/m,L,，生产能力不到1,g/d。,连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。,52,动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。,需要添加氨基酸、,维生素,、,血清,、生长因子,等,，,培养基要求高，,生产,费用较高,。,53,原,代细胞,二倍体细胞系,转化细,胞系,二,、生产用动物细胞的要求,54,原代细胞,直接取自动物组织器官,，,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（10,9,/g）。,需要大量动物，费钱费劳力。,细胞质量不稳定。,常用,鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞,等,。,55,2.,二倍体细胞系,原代细胞经过传代,、,筛选克隆，从多种细胞成分中，挑选并纯化出具有一定特征的某种细胞株。,特点,正常细胞的染色体2n核型；,贴壁依赖接触抑制；,可传代培养50代；,无致瘤性。,56,3.,转化细胞系,通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。,转化过程可以是,自,发的,、,人工的,、,或,从肿瘤组织中,产生,。,57,三、常用动物细胞的特性,W1-38,人胚,胎,肺组织二倍体成纤维细胞系,。,核型为,2n=46。,贴壁生长，能产生胶原，同工酶为G6PD,-,B型。培养基用,EBM,加,10,%小牛血清，pH7.2,。,倍增时间为24h，有限寿命50代。,对很多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗,，目前,广泛,应,用。,58,MRC-5,正常男性肺组织中获得的人二倍体成纤维细胞系。核型为2n=46。,培养基,需,加小牛血清。有限寿命4246代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。,用于生产疫苗。,59,Namalwa,从患有淋巴瘤病,的,肯尼亚人获取，建成人的,类淋巴母细胞,系,。非整体核型,，,1214条标记染色体,，,单条X，无Y。,外源基因表达水平较高，培养基为RPMI1640,+,7%胎牛血清。可用无血清培养基高密度培养,。,悬浮生长,，,表达IgM,。,英国,Wellcome,公司用,Namalwa,细胞大规模生产,干扰素，反应器达,8000L,。用该细胞,生产,rhEPO,、,rhG,-CSF,、,tPA,等。,60,CHO-K1,从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型2n=2022。,贴壁生长，,也,可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。培养基,为,：,DEME,+,0,.1,mmol/L,次黄嘌呤,+,0,.,1mmol/L胸苷,+,10%,小牛血清,+,脯氨酸,。,分泌表达外源蛋白，蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。使用氨甲酰喋呤,可,增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。,61,BHK-21,从1,日龄,地鼠幼鼠肾脏中分离的成纤维样细胞,，,核型为2n=44,。,培养基为,DMEM,+,7,%胎牛血清。,用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。现已用于工程细胞构建。,62,Vero,从正常成年非洲绿猴肾脏分离,的,上皮细胞，贴壁生长，核型,2n=60,。,能适应灌流操作,，,进行连续培养,。,培养基,：M,199,+,5%胎牛血清,。,已有突变系能用无血清培养。,常用Vero E6增殖多种病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。,63,SP2/0-Ag14,通过融合的方法分离获得,。,培养基为DMEM,+,10%胎牛血清。能耐受8氮鸟嘌呤 20g/m,L，,但在HAT选择培养基中不能存活。,通常用于生产单,克隆,抗体,。,64,C127：,从小鼠乳腺瘤分离的上皮样细胞,。,贴壁生长。表达多种外源基因，其中EPO的水平达10 mg/L，生产rhGH已被批准上市。,3T3：,HIN Swiss小鼠胚胎培养中分离的细胞系,。,能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。,COS：,从SV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。,GH3,：,用于生长激素研究，,293,：,用于基因治疗的研究。,65,昆虫细胞株系,Sf-9,从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到,的,，是最常用的昆虫表达细胞。,通常用Grace培养基,+,3.3g/L 水解乳蛋白,+,3.3g/L酵母浸液,+,10%胎牛血清。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。,对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。生长快，能高效表达外源基因。用于高效表达外来蛋白制品。,66,其他,Sf21：,从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。,TN-5B1-4：,从粉纹夜蛾卵细胞中分离得到,的,。,无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比,Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。,67,四、基因工程细胞构建和筛选,在生产中采用更多,、,更有前景的是融合细胞及各种基因工程细胞,。,被用,于,构建工程细胞的动物细胞有：,CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9 等细胞。,68,1.,真核细胞基因表达载体的构建,使用的载体有两类：,病毒载体,-,牛痘病毒,、,腺病毒,、逆转录病毒,质粒载体,-,69,病毒,作为载体的优点：,双链DNA，易重组,；,插入78kb DNA不影响正常病毒粒子的形成,多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系,。,因此,，,用外源基因更换多角体蛋白基因,，,仍能形成有感染力病毒粒子,；,70,多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%30%；,用光学显微镜可看到多角体,，,可以此作为标记物，选阳性克隆。,如家蚕杆状病毒，可在蚕体表达外源基因。,71,质粒载体,与,微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。,大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。,抗生素抗性标记，原核细胞筛选。,动物细胞复制子，在宿主细胞中,稳定表达。还有丝状噬菌体复制子。,72,在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增,，,含有如下基本成分：,允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。,含有使基因表达的调控元件。,能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。,有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。,73,基,因的,导入和高效表,达细,胞,株筛选,74,基因载体导,入,动物细胞常用,的,方法,磷酸钙沉淀法,电穿孔法,磷酸钙沉淀法,溶解的DNA 加Na,2,HPO,4,和CaCl,2,形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA,-,磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。,电穿孔法,借助电穿孔仪的高压脉冲电场,，,使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。,75,化学转染是最常用的转染方法。,渗透性休克和,DMSO,等化学试剂能促进,DNA,进入细胞。转染试剂盒,已有,商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。,影响因素,细胞培养物的密度、,DNA,的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。,76,转染体筛选与分离,转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。,为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养2448小时，让细胞倍增12代，使转染DNA表达。再按1：15比例转移到选择性培养基上，每24天更换培养基，持续23周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。,在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要使用与之相对应的显性选择标记来分离转染细胞。,77,五、细胞库的,建立,必,须建立两个细,胞库,原始细胞库,生产用细胞库,78,原始细胞库,存有该细胞的详细挡案，包括：,该细胞系的历史,该细胞系的特性,对各种有害因子的检查结果,79,生产用细胞库,从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，,经培养扩增再分装储存形成,生产,细胞库,。,需,建立档案,，,进行无菌、无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代次数。,80,第三节,植物次生代谢产物的生产,随着植物细胞悬浮培养技术的发展及各种新型生物反应器的出现，植物细胞能像微生物细胞那样在发酵罐中大量连续培养，产生相当于几倍或几十倍该完整植株所产生的,次生代谢产物,。植物细胞培养的产物在医药、食品、化工、农业等领域得到了广泛应用。,如：人参愈伤组织在培养基中培养数周，所含粗皂苷的含量,可达19.3%，,而天然人参根中含量,仅为4.1%。,81,一、,次生代谢产物,二、,培养条件下次生产物积累的特性,三、,提高细胞次生产物产量的途径,四、,培养技术的选择,五,、,植物细胞培养的应用,82,一、,次生代谢产物,次生代谢产物,是代谢的最终产物，,并非一般生命活动所必需的产物。多是一类小分子有机化合物，如黄酮、色素、毒素、抗生素、生长素、生物碱等。,次生代谢产物分布具有种、属、器官、组织以及发育阶段的特异性，也就是说不同植物类型或同一植物不同生长阶段及组织部位产生的次生代谢产物及产量是不同的。,83,主要,分为三类,萜类、,酚类,、,含氮次级化合物,。,84,酚类,-,黄酮类,、醌类和简单酚类,黄酮类,结构：C6-C3-C6,生物合成前体：苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A,功效：,治疗,心血管和高血压的药物成分,。,醌类化合物,结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合,种类：苯醌、萘醌。,功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。,85,简单酚类,结构：,苯丙酸类、苯丙酸内酯和苯甲酸衍生物,分布：,广泛分布于维管植物。,功能：,许多,是,植物防御食草昆虫和真菌侵袭,的,保护剂。,常用的药物有：绿原酸、姜酚、,肉桂醛,等。,86,萜类化合物,单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分，有的具有重要的药用价值。萜类化合物已超过2万种。,倍,半,萜：抗疟疾药物青蒿素。,二萜生物碱：抗癌药物紫杉醇。,三萜,皂甙：人参皂甙。,甾体,皂甙：薯蓣皂甙。,87,含氮化合物,包括：生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷,合成：,从普通的氨基酸合成的。,分布：双子叶植物,种类：,主要有生物碱、含氰苷、,芥子油苷和非蛋白,、,氨基酸等,，有,5500种以上,。,88,二、,次生产物积累的特性,生长偶联型,-,产物合成与细胞生长成正比,。,如长春花碱的合成,、,烟草中烟碱合成。,中间型,-,产物仅在细胞生长下降时合成，,细胞,在,指数生长期或停止,期,产物都不合成,。如,蒽醌类物质、,莨菪烷类,的,合成等,。,非生长偶联型,-,产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁。,89,三、,提高细胞次生产物产量的途径,选择适宜的起始材料种类、部位,栀子,胚轴,银杏,子叶,当归,根,红豆杉,幼嫩的茎,茜草,叶柄,培养基,既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成及积累次生产物的需要。,90,前体（precursor）的应用,主要是,提高目的产物,的,产量,。,对某一目的产物来讲,，,可能有多种前体物质,。,同一种前体物质又可能有多条代谢路径,，,从而形成,不同的代谢产物,。,针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加,。,多数前体物质对细胞生长并不十分,有利，可能有,前体浓度过量产生,的,反馈抑制,。,91,激发子（elicitor）的应用,是指能够诱导植物细胞中某些反应，并形成细胞特征性自身反应的分子，也称诱导子。,非生物激发子,-,如辐射、金属离子、茉莉酸类似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。,生物激发子,外源激发子：,菌丝、微生物机体提取物及微生物产生的多糖、蛋白和脂肪酸等,。,内源性激发子：,来源于植物结构化合物。如降解细胞壁的酶、细胞壁碎片、寡聚糖等有机分子。,92,激发子促进次生产物积累,激发子对南方红豆杉细胞培养合成紫杉醇的影响,激发子,适宜浓度（,mM,）,与对照比提高产物效率（倍）,M-JA,0.1,7.0,花生四烯酸,0.1,6.5,硝酸柿胺,1.0,5.5,水杨酸,0.1,4.5,硝酸盐,0.01,3.0,93,四、,培养技术的选择,包括反应器的选择和培养方式的选择,。,培养技术的选择不仅要考虑细胞生长和产物积累的效率，同时还应考虑技术基础和生产成本。,如两相培养技术。,培养方式可采用,两步培养,，即,在生长培养基中培养细胞,，,在生产培养基中积累产物,。,94,两相培养,技术,指在植物细胞培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系由于分配系数不同而形成上、下两相，细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，,而,这些次生代谢物又通过主动或被动运输的方式释放到胞外，被另一相所吸附。,95,特点,可及时分离次生代谢物，减,少负反,馈抑制，提,高次,生代谢产物含量，而且有机相,可循,环使用，基本实现了植物组织的连续培养。,迄今为止，已有,18,种植物细胞应用此项技术获得成功。例,如添,加十六烷提取紫草素，可使产量提高,7,倍多,；添,加十六,烷可使孔雀草发根培养的噻吩分,泌量由原来的,1,提高至,70,。,96,举例,两相培养红豆杉细胞生产紫杉醇,紫杉醇为抗癌药，价,99%,纯度的,1500元/g,，,35%,的,138元/g,。,第,一相：,B,5,培,养基,第,二相：,5,(v/v),的松,油醇,产,物释放剂：,5,(v/v),二甲基亚砜。,10g(,鲜重,)/100mL,培,养基,/250mL,三角烧,瓶。,25,，,120rpm,，黑暗培养。,97,毛状根培养技术,发根土壤杆菌的Ri质粒转移并整合到双子叶植物基因组中诱导出毛状根,。,其,生长迅速,，分支多，且具有器官化的特征，遗传性、生理生化,特征稳定,，具有,更强的次生代谢物合成能力,，,可,建立培养系统。毛状根具有,很强的繁殖能力,，可以制成,人工种子,长期保存。,98,毛状根具有,生物转化,功能，可以产生许多新的化合物；能产生某些植物的愈伤组织不能合成的,新的有效成分,；,由于毛状根培养技术的高产，并且可从基因水平上对某些酶和特定次生代谢过程进行调控，因此，,被公认是生产植物次生代谢物的一条新途径。,目前诱导植物产生毛状根的种类已达,几十种,以上，且次生代谢产物生产水平达到相当于或高于原植株的水平。,99,举例,诱,导人参愈伤组,织生产人参皂苷,在,无外源激素的条件下,，毛状根生,长速度,为激,素诱导根的,2,倍,，人参皂苷的含量达干重的,0.95,，高于再生根,(0.91,),和天然栽培根,(0.4,),。,人参愈伤组织,100,101,青,蒿毛状根生产青蒿素,青,蒿为,双子叶植物药菊科,植物。,青蒿,素为治疗疟疾的首选药。,结构为倍半萜内酯类化合物,102,由,发根农杆菌,R1601诱导青蒿叶片产生青蒿毛状根,。,培养方法及条件,固体培养,：,2030 mm青蒿毛状根根尖,，在,MS固体培养基,上,，,添加30 L蔗糖,，,继代时,间,为15d,。,液体培养,：,每,升,MS培养液接种5 g 毛状根培养物,，,120-130 rpm，251,，12 hd光照,，,液体培养的继代时间为10 d。,反应器培养,：,MS,培养液400mL，接种量为0.8g,，,12 hd,光照,培养，25I。通气量为0.5 Lmin，通气时间为15 mln。,103,最大生物量10.3g/L，青蒿素产量达到179.1mg/L，青蒿素的含量为1.74。,104,提高次生代谢产物产率的方法,-,小结,1.,选育高效合成次生代谢产物能力的细胞。,2.,选择合适的培养基及培养,条件，寻,找最佳工艺条件实现工业化生产。,3.,提高次生代谢前体物质,浓度，寻,找增,加次,生前体物,质的途,径和调节方式，提,高产,量。,4.,降低次生代谢产物的浓度：固定化细胞培养、连续培养、两相培养技术等。,5.,设计合适的生物反应器：气升式反应器被认为是最适反应器。,105,五、,植物细胞培养的应用,1.,初级及次级代谢产物的生产。,有,400,种,左右。已实现工业化培养的有：烟草、人参、紫草、黄连等。,2.,天然植物色素的生产。,有叶黄素、胡萝卜素、花青素、单宁等。,3.,生物转化。,利用植物细胞氧化、还原、皂化、羟基化等多种酶源，使某种前体化合物生成为相应有用的产物。如：毛地黄细胞将,-,甲基毛地黄毒素羟基,化为,-,甲基地高辛，为临床多用强心药,。,106,举例,紫草细胞生物反应器生产紫草色素,紫,草宁（紫草红色素）,外用,治,疗皮肤癌、湿疹、带状疱,疹等；,内服治疗,病,毒性肝炎、肺癌、肝癌等。,1.,细胞来源,紫草细胞来自于紫草叶诱导的愈伤组织，经多次培养筛选获得。在固体培养基中培养的紫草细胞直接接种于液体培养基中悬浮培养，作为反应器培养的种子。,107,2.,培养过程,24,左右摇瓶培养紫草细胞作为种子，接种于装有,7L,细胞生长,的,B5,液,体培,养基,，,培养,14,天。,利用过,滤网放出培养液，并用适量无菌水冲洗残留在反应器内的培养液。然后加入,7L,紫草色素积累的培养液,(,M9),，培养,20,天，温度控制在,23-25,。培养过程中监测培养液酸碱度变化和电导率，以及紫草细胞浓度和色素含量变化。,3.,代谢产物,紫草色素形成与细胞生长基本同步。,108,自,然植物和细胞培养的紫草宁含量比较,生产方式 生产周期 紫草宁含量（干重）,完整植物,2,3,年,1,2,植物细胞培养,3,周,14,109,植,物次生代谢产品的市场潜能,产品成分用途年销售额（亿美元）,长春花碱治疗白血病,18,20,（美国）,奎宁治疗疟疾,5,10,（美国）,致热素杀虫剂,20,（全世界）,毛地黄心脏病药,20,55,（美国）,110,本章,小结,细胞规模化培养有可能成为新型生化工业的重要途径，细胞悬浮培养是细胞规模化培养的基础。,各种单细胞培养技术是细胞克隆的基础，也适用于植物花粉培养和原生质体培养,。,高等生物细胞规模化培养体系的建立必须于生物反应器的研制相匹配。,根据目的产物建立包括培养基、种细胞、培养方式等在内的一系列配套技术是商业化的前提。,111,Good bye!,Good bye!,112,紫杉醇：二萜类化合物,最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分离,广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症,。,NCI称其为过去15年中开发的最好的抗癌药物,，,20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一,，,汤姆森科技桂冠奖,。,目前主要来源于红豆杉属植物,。,紫杉醇简介,113,紫杉醇研发过程,年 代,进 展,1958,NCI,开始大规模植物药研发筛选,1967,发现紫杉醇抗癌活性,1968,从红豆杉中分离出紫杉醇,1971,完成结构鉴定,1979,发表作用机制,1983,临床,试验,1985,临床,II,期,1991,临床,III,期,1992,FDA,批准上市,Ramesh Panchagnula,International Journal of Pharmaceutics.1998(172)1-15.,114,市场需求,抗癌一线用药,销售额,年增长率,5,亿美元,理论需求量,2g/,人,500,万人,/,年,1000kg/,年,实际销量,350 kg/,年,紫杉醇供需相差十分悬殊,图,1,：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）,图,2,：国际紫杉醇销售额（亿美元）,115,紫杉醇开发的关键问题,上游产业药源问题,红豆杉主要原料植物,，,国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种之一,。,生长缓慢 分布有限 Taxol含量低,。,树皮中Taxol含量:0.00001-0.069%,，,3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人,下游制剂产业,药效（活性、水溶性）,安全性,生物相容性,116,人工栽培,采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗,。,寻找红豆衫的替代物,从红豆杉非树皮部位提取产紫杉醇的非红豆杉植物,。,优点：生长周期缩短,，,简便、直接,缺点：,1,、紫杉醇含量低生长缓慢,2,、提取工艺复杂,药源问题解决办法（一）,117,药源问题解决办法（二）,化学合成,全合成,1994,年获得成功现有六种途径,半合成,以,10-DAB,和,Baccatin,作为半合成原料获得紫杉醇,新方法用,10-DAT,缺点：,1,、合成过程烦琐复杂，几十步,2,、费用高，化学试剂昂贵,3,、总收率太低（,2%,）,优点：,1,、原料枝叶含量丰富、提取相,对容易，充分利用再生资源,2,、产率高,3,、最具实用价值可以工业化生产,4,、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造,缺点：合成过程相对复杂,（,11,步化学转化和,7,步分离）,118,药源问题解决办法（三）,生物方法,组织和细胞培养,微生物发酵,生物合成,研究阶段,：,红豆杉生物合成途径基本明确10种相关酶基因被克隆表达,，,利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量,优点：,1,、摆脱自然因素，可长期稳定,生长,2,、适应市场、方便调节,3,、成分简单，有利于分离纯化,4,、成本低、生长周期短,5,、为半合成提供原料,6,、有望工业化生产,缺点：,1,、产量低、不稳定,2,、工业化放大研究,119,紫杉醇水溶性很差,0.77,m,M,/L,使用增溶剂：聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇,存在问题,稳定性和水溶性较差（,7mm/L,）,过敏反应,产生沉淀,缺点：,1,、产量低、不稳定,2,、工业化放大研究,药效问题,120,
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