天然药物提取工艺ppt课件色谱分离技术

第五节第五节 色谱分离技术色谱分离技术第五节 色谱分离技术1特点特点色谱分离技术最大的特点：色谱分离技术最大的特点：分离效率高分离效率高能分离各种能分离各种性质极其类似性质极其类似的物质；的物质；应用化学物质的分析鉴定的同时，应用化学物质的分析鉴定的同时，可用于大量物质的分离纯化制备；可用于大量物质的分离纯化制备；如：胰岛素注射药品如：胰岛素注射药品 以凝胶色谱以凝胶色谱去除胰岛素中的二聚体去除胰岛素中的二聚体特点色谱分离技术最大的特点：分离效率高2什么叫作色谱法：什么叫作色谱法：n色谱法色谱法（chromatographychromatography）又称层析法，）又称层析法，是利用混合物中是利用混合物中各个组分的化学、物理性各个组分的化学、物理性质的差异质的差异，基于基于被分离物质分子在两相被分离物质分子在两相（一为固定相，一为流动相）（一为固定相，一为流动相）中分配系数中分配系数的微小差别的微小差别进行分离。进行分离。一、色谱分离技术的基本概念与理论一、色谱分离技术的基本概念与理论什么叫作色谱法：一、色谱分离技术的基本概念与理论3什么叫作色谱法：什么叫作色谱法：n对一些结构性质相似化合物的分离，用经对一些结构性质相似化合物的分离，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以达到典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以达到分离目的时，用色谱法往往可以收到很好分离目的时，用色谱法往往可以收到很好的分离效果。的分离效果。一、色谱分离技术的基本概念与理论一、色谱分离技术的基本概念与理论什么叫作色谱法：一、色谱分离技术的基本概念与理论4 色谱分离过程：色谱分离过程：n被分离的各组分受到固定相的作用力不同被分离的各组分受到固定相的作用力不同（吸附、分配、分子间氢键结合力等）；（吸附、分配、分子间氢键结合力等）；n在流动相与固定相发生相对移动过程中，在流动相与固定相发生相对移动过程中，当待分离的混合物通过固定相时，由于各当待分离的混合物通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生作组分的理化性质存在差异，与两相发生作用的能力不同，在两相中的分配不同；用的能力不同，在两相中的分配不同；色谱分离技术的原理：色谱分离技术的原理：色谱分离过程：色谱分离技术的原理：5 色谱分离过程：色谱分离过程：n与固定相相互作用力越弱的组分，随流动与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞越小，向前移动的速相移动时受到的阻滞越小，向前移动的速度快，反之，与固定相相互作用力越强的度快，反之，与固定相相互作用力越强的组分，向前移动的速度越慢；组分，向前移动的速度越慢；n进行分部收集流出液，即可得到各单一组进行分部收集流出液，即可得到各单一组分，达到分离目的。分，达到分离目的。色谱分离技术的原理：色谱分离技术的原理：色谱分离过程：色谱分离技术的原理：6固定相固定相 流动相流动相色谱柱色谱柱被分离组分被分离组分固定相 7天然药物提取工艺ppt课件色谱分离技术8是色谱分离过程的一个是色谱分离过程的一个固定介质。固定介质。可以是固体物质可以是固体物质(如吸附剂、凝胶、离如吸附剂、凝胶、离 子交换剂等），子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶、纤也可以是液体物质（如固定在硅胶、纤 维素或树脂上的溶液），维素或树脂上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行这些基质能与待分离的化合物进行可逆可逆 的吸附、分配、溶解、交换等作用；的吸附、分配、溶解、交换等作用；它对色谱分离的效果起着关键的作用。它对色谱分离的效果起着关键的作用。1.固定相固定相是色谱分离过程的一个固定介质。1.固定相9在层析过程中，在层析过程中，推动固定相上待分离的推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界流体等超临界流体等都称为流动相。都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析称为展层剂。薄层层析称为展层剂。它是层析分离中的重要影响因素之一。它是层析分离中的重要影响因素之一。2.流动相流动相在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体10保留时间保留时间 待分离物质待分离物质从进样开始到组从进样开始到组分分流出浓度最大流出浓度最大时所经过的时间时所经过的时间，称为，称为该组分的色谱保留时间，用该组分的色谱保留时间，用t tR R表示。表示。保留体积保留体积 待分离物质待分离物质从进样开始到组从进样开始到组分流出浓度最大时分流出浓度最大时所用洗脱液的体积所用洗脱液的体积，称为该组分的保留体积，用称为该组分的保留体积，用v vR R表示。表示。3.保留时间和保留体保留时间和保留体积积保留时间 待分离物质从进样开始到组分流出浓度最大时所经过的11死时间死时间 非保留溶质从进样开始到流出非保留溶质从进样开始到流出色谱柱所经历的时间，称为死时间；色谱柱所经历的时间，称为死时间；用用t t0 0表示；表示；死体积死体积 非保留溶质从进样开始到流出非保留溶质从进样开始到流出色谱柱所用的洗脱液的体积，称为死色谱柱所用的洗脱液的体积，称为死体积；用体积；用v v0 0表示。表示。4.死时间和死体积死时间和死体积死时间 非保留溶质从进样开始到流出色谱柱所经历的时间，称为12调整保留时间调整保留时间 某种物质扣除死时间后的在某种物质扣除死时间后的在色谱柱上的保留时间称为该物质的调整保色谱柱上的保留时间称为该物质的调整保留时间；留时间；调整保留体积调整保留体积 某种物质扣除死体积后的在某种物质扣除死体积后的在色谱柱上洗脱所用的洗脱剂的体积称为该色谱柱上洗脱所用的洗脱剂的体积称为该物质的调整保留体积。物质的调整保留体积。5.调整保留时间和调整保留时间调整保留时间和调整保留时间调整保留时间 某种物质扣除死时间后的在色谱柱上的保留时间称为136.容量因子容量因子 表示某一溶质在色谱柱中任意位置达到表示某一溶质在色谱柱中任意位置达到平衡后，该溶质在固定相中量和在流动平衡后，该溶质在固定相中量和在流动相中的量之比。相中的量之比。7.7.塔板理论塔板理论 色谱柱的理论塔板数越大，塔板高度越色谱柱的理论塔板数越大，塔板高度越小，色谱柱的分离效率越高。小，色谱柱的分离效率越高。6.容量因子 148.8.分配系数分配系数 在一定的条件下，某种组分在在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用常用K表示表示。9.9.迁移率迁移率（比移值）（比移值）在一定条件下，在相在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用与流动相本身移动的距离之比值，常用R Rf f表示。表示。8.分配系数 在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含1510.10.分辨率分辨率（分离度）（分离度）11.11.操作容量操作容量（交换容量）（交换容量）在一定条件下，某种组分与固定相反应达在一定条件下，某种组分与固定相反应达到平衡时，存在固定相上的饱和容量。到平衡时，存在固定相上的饱和容量。操作容量大，与固定相的亲和力越大，加操作容量大，与固定相的亲和力越大，加入样量可越大。反之，相反。入样量可越大。反之，相反。10.分辨率（分离度）16正相色谱：正相色谱：是指固定相的极性高于流动相是指固定相的极性高于流动相u在层析过程中，非极性分子或极性小在层析过程中，非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中洗脱出。先从柱中洗脱出。12.正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱正相色谱：是指固定相的极性高于流动相12.正相色谱和反相色17反相色谱：反相色谱：是指固定相的极性低于流动相是指固定相的极性低于流动相u在层析过程中，极性大的分子比极性在层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快，而先从柱中洗小的分子移动的速度快，而先从柱中洗脱流出。脱流出。12.正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱12.正相色谱和反相色谱18根据不同的标准可以分为多类：根据不同的标准可以分为多类：A.根据固定相基质的形式分类：根据固定相基质的形式分类：纸层析：纸层析：以滤纸为基质；以滤纸为基质；薄层层析：薄层层析：是将基质在玻璃或塑料等光滑表面是将基质在玻璃或塑料等光滑表面 铺成一薄层，在薄层上进行层析；铺成一薄层，在薄层上进行层析；柱层析：柱层析：将基质填装在管中形成柱形，在柱将基质填装在管中形成柱形，在柱 中进行层析。中进行层析。13.层析法的分类层析法的分类根据不同的标准可以分为多类：13.层析法的分类19 B.B.根据流动相的形式分类：根据流动相的形式分类：液相层析：液相层析：流动相为液体的层析；流动相为液体的层析；气相层析：气相层析：流动相为气体的层析；流动相为气体的层析；13.层析法的分类层析法的分类 B.根据流动相的形式分类：13.层析法的分类20吸附层析：吸附层析：以吸附剂为固定相，根据以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸待分离物与吸附剂之间的吸附力不同附剂之间的吸附力不同达到分离目的；达到分离目的；分配层析：分配层析：是根据在一个由两相同时存在的溶剂系是根据在一个由两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的统中，不同物质的分配系数不同分配系数不同而达到而达到分离目的；分离目的；C.根据分离原理的不同分类：根据分离原理的不同分类：吸附层析：C.根据分离原理的不同分类：21凝胶过滤层析：凝胶过滤层析：以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据相，根据物质的分子大小进行分离物质的分子大小进行分离的的一种层析方法；一种层析方法；离子交换层析：离子交换层析：以离子交换剂为固定相，根据以离子交换剂为固定相，根据物质的物质的带电性质不同带电性质不同而进行分离的一种层析而进行分离的一种层析方法；方法；C.根据分离原理的不同分类：根据分离原理的不同分类：凝胶过滤层析：C.根据分离原理的不同分类：22亲和层析：亲和层析：根据根据生物大分子和配体之间的特异性亲生物大分子和配体之间的特异性亲 和力和力，将某种配体连接在载体上作为固，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析分离。大分子进行分离的一种层析分离。C.根据分离原理的不同分类：根据分离原理的不同分类：亲和层析：C.根据分离原理的不同分类：23色谱法色谱法 液相色谱法液相色谱法 气相色谱法气相色谱法平板色谱法平板色谱法 柱色谱法柱色谱法纸纸色色谱谱法法气气液液色色谱谱法法气气固固色色谱谱法法分分配配色色谱谱法法吸吸附附色色谱谱法法离离子子交交换换色色谱谱法法排排阻阻色色谱谱法法 超临界流体色谱法超临界流体色谱法亲亲和和色色谱谱法法薄薄层层色色谱谱法法色谱法 液相色谱法 气相色谱法平板色谱法 柱色谱法纸气气分吸24二、吸附色谱法二、吸附色谱法 (adsorption chromatography)1.1.原理：原理：吸附色谱为色谱固定相与流动相在吸附色谱为色谱固定相与流动相在 相对移动过程中，溶质和溶剂分子相对移动过程中，溶质和溶剂分子 在吸附剂表面上的活性位点相互竞在吸附剂表面上的活性位点相互竞 争的吸附过程。争的吸附过程。简单的说简单的说:依据吸附剂对混合物中各成分吸附依据吸附剂对混合物中各成分吸附 性能的不同，使各成分得到分离。性能的不同，使各成分得到分离。二、吸附色谱法 (adsorption chromat25n在天然有机化合物分离及精制工作中，在天然有机化合物分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以吸附现象利用得十分广泛。其中又以固固-液吸附用得最多液吸附用得最多.2.2.常用吸附剂：常用吸附剂：硅胶、硅胶、氧化铝、氧化铝、活性炭、活性炭、聚酰胺聚酰胺.在天然有机化合物分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其263.3.固固-液吸附可分为液吸附可分为:物理吸附物理吸附(表面吸附表面吸附)：硅胶、氧化铝及活性炭硅胶、氧化铝及活性炭 化学吸附化学吸附 半化学吸附：半化学吸附：聚酰胺层析聚酰胺层析3.固-液吸附可分为:274.4.物理吸附的特点：物理吸附的特点：无选择性无选择性;吸附与解吸是可逆的吸附与解吸是可逆的;速度快速度快;实际应用最多。实际应用最多。5.5.化学吸附的特点：化学吸附的特点：具有选择性；具有选择性；吸附十分牢固吸附十分牢固,有时甚至是不可逆的。有时甚至是不可逆的。化学吸附用得少化学吸附用得少.4.物理吸附的特点：286.6.半化学吸附的特点：半化学吸附的特点：介于物理吸附与化学吸附之间的吸附过介于物理吸附与化学吸附之间的吸附过程，其吸附力较弱。程，其吸附力较弱。半化学吸附有一定应用价值。半化学吸附有一定应用价值。如如:聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附属于半化学吸附。间的氢键吸附属于半化学吸附。6.半化学吸附的特点：29液液-固物理吸附色谱是运用较多的一种方法，固物理吸附色谱是运用较多的一种方法，u 特别适用于很多特别适用于很多中等分子量的样品中等分子量的样品（分子分子量小于量小于1000的低挥发性样品的低挥发性样品）的分离，）的分离，u 尤其是脂溶性成分。尤其是脂溶性成分。u 一般不适用于高分子量样品一般不适用于高分子量样品如蛋白质、如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物等的分离。多糖或离子型亲水性化合物等的分离。液-固物理吸附色谱是运用较多的一种方法，30吸附色谱的分离效果，决定于吸附色谱的分离效果，决定于u 吸附剂、吸附剂、u 溶剂、溶剂、u 被分离化合物的性质这三个因素。被分离化合物的性质这三个因素。吸附色谱的分离效果，决定于31天然药物提取工艺ppt课件色谱分离技术32（一）吸附色谱分离中常用的固定相（一）吸附色谱分离中常用的固定相1.1.氧化铝：氧化铝：是由氢氧化铝直接在高温下脱水制得是由氢氧化铝直接在高温下脱水制得,因在制备方法和处理方法的差别有因在制备方法和处理方法的差别有n碱性碱性n中性中性n酸性酸性（一）吸附色谱分离中常用的固定相1.氧化铝：33（一）吸附色谱分离中常用的固定相（一）吸附色谱分离中常用的固定相碱性氧化铝碱性氧化铝pH9-10：适合分离碱性和中性成分，适合分离碱性和中性成分，如生物碱；如生物碱；中性氧化铝中性氧化铝pH7.5：适合生物碱、挥发油、萜类、适合生物碱、挥发油、萜类、甾体等化合物；甾体等化合物；酸性氧化铝酸性氧化铝pH4-5：适合酸性物质，如酸性色素、适合酸性物质，如酸性色素、某些氨基酸等；某些氨基酸等；（一）吸附色谱分离中常用的固定相碱性氧化铝pH9-10：34氧化铝的吸附机理：氧化铝的吸附机理：表面上有铝醇基（表面上有铝醇基（Al-OH）羟基的）羟基的氢键作用而吸附化学物质。氢键作用而吸附化学物质。氧化铝的吸附机理：35氧化铝的活性与含水量密切相关：氧化铝的活性与含水量密切相关：活化：活化：在高温下去除水分，含水量低，在高温下去除水分，含水量低，活性增强，称为活化；活性增强，称为活化；去活化：去活化：加入一定量的水，含水量高，加入一定量的水，含水量高，活性降低，称为去活化。活性降低，称为去活化。氧化铝的活性与含水量密切相关：36a.a.硅胶，通常用硅胶，通常用SiO2 xH2O表示，是一表示，是一种坚硬、无定型链状和网状结构的硅酸种坚硬、无定型链状和网状结构的硅酸聚合物颗粒，约聚合物颗粒，约90的分离工作都可选的分离工作都可选用硅胶作为吸附剂。用硅胶作为吸附剂。2.硅胶硅胶a.硅胶，通常用SiO2 xH2O表示，是一种坚硬、无定37b.具有硅氧交联的结构，表面有许多的具有硅氧交联的结构，表面有许多的硅醇基硅醇基的多孔性的多孔性微粒。微粒。硅醇基是硅胶具有吸附能力硅醇基是硅胶具有吸附能力的活性基团。的活性基团。c.被分离物质由于被分离物质由于极性和不饱和程度不同和硅极性和不饱和程度不同和硅醇基相互作用的程度不同醇基相互作用的程度不同而达到分离目的。而达到分离目的。2.硅胶硅胶b.具有硅氧交联的结构，表面有许多的硅醇基的多孔性微粒。硅38d.d.硅胶的羟基存在于硅胶表面较小的空穴中，硅胶的羟基存在于硅胶表面较小的空穴中，因此因此空穴较小而比表面积大的硅胶吸附性空穴较小而比表面积大的硅胶吸附性能力强。能力强。n 水能与硅胶表面的羟基结合成水合硅醇水能与硅胶表面的羟基结合成水合硅醇基而使得硅胶失去活性；基而使得硅胶失去活性；n若将硅胶加热到若将硅胶加热到100左右加热，水能可左右加热，水能可逆地除去。逆地除去。d.硅胶的羟基存在于硅胶表面较小的空穴中，因此空穴较小而比表39n 活化：活化：将硅胶在将硅胶在100左右加热，可去除左右加热，可去除部分水分，增强吸附能力。部分水分，增强吸附能力。n 一般指将硅胶一般指将硅胶在在110加热加热30min，增强，增强吸附能力，称为活化。吸附能力，称为活化。天然药物提取工艺ppt课件色谱分离技术40湿法装柱法：湿法装柱法：即将硅胶混悬于装柱溶剂中，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比一般为径与长度之比一般为1:(20-30)。u硅胶最好一次倾入，硅胶最好一次倾入，否则由于不同粒度大否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一、使硅胶柱有明显小的硅胶沉降速度不一、使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离结果。的分段现象，影响分离结果。e.硅胶层析的装柱：硅胶层析的装柱：湿法装柱法：即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡41干法装柱：干法装柱：将所需硅胶一次性全部倾入柱将所需硅胶一次性全部倾入柱中，然后紧至硅胶高度不再变化即可。中，然后紧至硅胶高度不再变化即可。欲分离样品与吸附剂的比例为欲分离样品与吸附剂的比例为1:(30-60)e.硅胶层析的装柱：硅胶层析的装柱：干法装柱：将所需硅胶一次性全部倾入柱中，然后紧至硅胶高度不再42湿式加样：湿式加样：把样品溶解在少量低极性溶剂中，把样品溶解在少量低极性溶剂中，倾入柱顶后，样品均匀地吸附在吸附倾入柱顶后，样品均匀地吸附在吸附剂的表面，剂的表面，然后用不同的溶剂作洗脱展开。然后用不同的溶剂作洗脱展开。样品上柱？样品上柱？湿式加样：样品上柱？43湿式加样：湿式加样：*切忌切忌以强极性溶剂或非均相的悬浊体以强极性溶剂或非均相的悬浊体系样品直接加入注中，这将导致分离系样品直接加入注中，这将导致分离实验的失败。实验的失败。样品上柱？样品上柱？湿式加样：样品上柱？44干式加样干式加样:将样品选择适宜的溶剂溶解，将样品选择适宜的溶剂溶解，并加入适量的吸附剂充分搅拌均匀，并加入适量的吸附剂充分搅拌均匀，溶剂挥发尽，溶剂挥发尽，加适量的流动相拌匀再上柱或直接加适量的流动相拌匀再上柱或直接加到柱顶。加到柱顶。一般可保持较高的柱效率和实验重一般可保持较高的柱效率和实验重现性。现性。样品上柱？样品上柱？干式加样:样品上柱？45天然药物提取工艺ppt课件色谱分离技术46f.硅胶是一种酸性吸附剂，硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析，适用于中性或酸性成分的层析，如酚类、甾体和萜类等。如酚类、甾体和萜类等。分离效率与其粒度、孔径、和表面积有关分离效率与其粒度、孔径、和表面积有关 粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；硅胶表面积越大，与样品之间的相互作用硅胶表面积越大，与样品之间的相互作用 越强，吸附力越强越强，吸附力越强f.硅胶是一种酸性吸附剂，47同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物，当遇到较强的碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，483.3.活性炭活性炭a.a.是一种非极性吸附剂。具有非极性的表面是一种非极性吸附剂。具有非极性的表面b.b.活活性性炭炭主主要要用用于于分分离离水水溶溶性性成成分分，如如氨氨基基酸酸、糖糖类类及及某某些些甙甙。活活性性炭炭为为吸吸附附作作用用，在在水水溶溶液液中中最最强强，在在有有机机溶溶剂剂中中则则较较低低弱弱。故故水水的的洗洗脱脱能能力力最最弱弱，而而有有机机溶溶剂剂则则较较强强。例例如如以以醇醇-水水进进行行洗洗脱脱时时，则则随随乙乙醇醇浓浓度度的递增而洗脱力增加。的递增而洗脱力增加。3.活性炭a.是一种非极性吸附剂。具有非极性的表面493.3.活性炭活性炭c.c.活活性性炭炭对对芳芳香香族族化化合合物物的的吸吸附附力力大大于于脂脂肪肪族族化化合合物物，对对大大分分子子化化合合物物的的吸吸附附力力大大于于小小分分子子化化合合物物。利利用用这这些些吸吸附附性性的的差差别别，可可将将水水溶溶性性芳芳香香族族物物质质与与脂脂肪肪族族物物质质分分开开，单单糖糖与与多多糖糖分分开开，氨氨基基酸酸与与多肽分开。多肽分开。n吸吸附附力力不不容容易易控控制制，也也没没有有测测定定级级别别的的理想方法，理想方法，应用受到限制。应用受到限制。3.活性炭c.活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，504.4.聚酰胺聚酰胺a.a.聚酰胺是由有机酸和有机胺经聚而成的高聚酰胺是由有机酸和有机胺经聚而成的高分子材料，俗称尼龙、锦纶。吸附属于氢分子材料，俗称尼龙、锦纶。吸附属于氢键吸附，是一种用途十分广泛的分离方法，键吸附，是一种用途十分广泛的分离方法，极性物质和非极性物质都适用。极性物质和非极性物质都适用。b.b.它的化学性质很稳定，它的化学性质很稳定，除了在浓除了在浓HClHCl，热，热甲酸和苯酚等溶剂中可溶解外，不溶于水、甲酸和苯酚等溶剂中可溶解外，不溶于水、醉、丙酮、氯仿、苯、正己烷等各种极性醉、丙酮、氯仿、苯、正己烷等各种极性的与非极性的溶剂中。的与非极性的溶剂中。4.聚酰胺a.聚酰胺是由有机酸和有机胺经聚而成的高分子材料，51聚酰胺的色谱分离机理比较复杂。链聚酰胺的色谱分离机理比较复杂。链状的聚酰胺分子上有许多酰胺基团，状的聚酰胺分子上有许多酰胺基团，形成活性中心。形成活性中心。在非水体系溶剂中它和弱极性分子相在非水体系溶剂中它和弱极性分子相互作用，主要表现出吸附色谱的性能，互作用，主要表现出吸附色谱的性能，溶剂的洗脱能力从极性小到大而递增。溶剂的洗脱能力从极性小到大而递增。c.分离机理：分离机理：聚酰胺的色谱分离机理比较复杂。链状的聚酰胺分子上有许多酰胺基52但是在极性溶剂和水溶液中，由于酰胺但是在极性溶剂和水溶液中，由于酰胺基能与酸、酮、酮、醇、酚及胺等化基能与酸、酮、酮、醇、酚及胺等化合物生成氢键，合物生成氢键，因此对这类化合物，以生成氢键能力的因此对这类化合物，以生成氢键能力的强弱而实现选择性的分离。强弱而实现选择性的分离。c.分离机理：分离机理：但是在极性溶剂和水溶液中，由于酰胺基能与酸、酮、酮、醇、酚及53由于聚酰胺对物质的分离机理与硅胶等吸附由于聚酰胺对物质的分离机理与硅胶等吸附色谱法不同，所选用的展开剂与洗脱剂也不色谱法不同，所选用的展开剂与洗脱剂也不相同。相同。它对水溶液中样品的吸附能力最大，即水是它对水溶液中样品的吸附能力最大，即水是洗脱能力最差的溶剂；有机溶剂醇、丙酮和洗脱能力最差的溶剂；有机溶剂醇、丙酮和碱性溶液、甲酰胺等，使酰胺分子生成氢键碱性溶液、甲酰胺等，使酰胺分子生成氢键的能力减弱，所以其洗脱能力强。的能力减弱，所以其洗脱能力强。由于聚酰胺对物质的分离机理与硅胶等吸附色谱法不同，所选用的展54溶剂洗脱能力的顺序是：溶剂洗脱能力的顺序是：水乙醇甲醇丙酮稀碱水乙醇甲醇丙酮稀碱(NH4OH)溶液溶液甲酰胺甲酰胺DMF 由于在水溶液中，对极性有机物的吸附能力由于在水溶液中，对极性有机物的吸附能力强，恰好利用此性质，可对水中微量强极性强，恰好利用此性质，可对水中微量强极性有机物进行吸附、富集和分离。有机物进行吸附、富集和分离。溶剂洗脱能力的顺序是：55聚酰胺色谱的应用聚酰胺色谱的应用聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的（鞣质除外），分离效果好，是可逆的（鞣质除外），分离效果好，加以吸附容量又大，加以吸附容量又大，故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离备分离。聚酰胺色谱的应用聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的56聚酰胺色谱的应用聚酰胺色谱的应用对生物碱、萜类、甾体、糖类、对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有广泛的用途。物的分离也有广泛的用途。聚酰胺色谱的应用对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性57聚酰胺色谱的应用聚酰胺色谱的应用因为因为对鞣质的吸附特强，对鞣质的吸附特强，近乎不可近乎不可逆，故用于植物粗提取物的逆，故用于植物粗提取物的脱鞣质脱鞣质处理特别适宜。处理特别适宜。聚酰胺色谱有薄层色谱和柱色谱两聚酰胺色谱有薄层色谱和柱色谱两种方式。种方式。聚酰胺色谱的应用因为对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故用于植物58（二）吸附层析固定相的选择（二）吸附层析固定相的选择固定相选择的原则：固定相选择的原则：主要依据主要依据 被分离对象的性质被分离对象的性质、分离的目的、分离的目的、固定相的性质固定相的性质决定。决定。（二）吸附层析固定相的选择固定相选择的原则：59样品的溶解性样品的溶解性：一般情况下，一般情况下，u水溶解样品如糖类等，采用活性炭分离；水溶解样品如糖类等，采用活性炭分离；u黄酮类主要用聚酰胺分离；黄酮类主要用聚酰胺分离；u绝大多数有机化合物用硅胶和氧化铝作为绝大多数有机化合物用硅胶和氧化铝作为固定相分离。固定相分离。被分离对象的考虑因素包括：被分离对象的考虑因素包括：样品的溶解性：被分离对象的考虑因素包括：60样品的酸碱性样品的酸碱性：u硅胶略带酸性，适用中性和酸性物质硅胶略带酸性，适用中性和酸性物质分离；碱性物质与硅胶作用，易被吸分离；碱性物质与硅胶作用，易被吸附，分离效果差。附，分离效果差。u氧化铝略带碱性，适用碱性和中性物氧化铝略带碱性，适用碱性和中性物质分离；酸性物质与其吸附较牢，分质分离；酸性物质与其吸附较牢，分离效果差。离效果差。被分离对象的考虑因素包括：被分离对象的考虑因素包括：样品的酸碱性：被分离对象的考虑因素包括：61化合物的极性化合物的极性u化合物的极性取决于其分子中的官能团化合物的极性取决于其分子中的官能团的极性和分子结构，物质的结构不同，的极性和分子结构，物质的结构不同，其极性不同。其极性不同。u通常极性大的物质吸附能力强，应根据通常极性大的物质吸附能力强，应根据化合物极性的不同选择不同的分离介质化合物极性的不同选择不同的分离介质进行分离。进行分离。被分离对象的考虑因素被分离对象的考虑因素：化合物的极性 被分离对象的考虑因素：62官能团的极性强弱官能团的极性强弱官能团官能团极性极性R-COOH大大Ar-OHR-OHR-NH2,R-NH-R,R-N-R2R-CO-NR2R-CHOR-CO-RR-CO-ORR-O-R小小官能团的极性强弱官能团极性R-COOH大Ar-OHR-OHR63吸附剂对组分的作用吸附剂对组分的作用：u选用的选用的固定相必须和待分离对象不发生固定相必须和待分离对象不发生化学反应或不对被吸附分离的物质有破化学反应或不对被吸附分离的物质有破坏作用。坏作用。u如，酸性的硅胶不适合分离碱性物质；如，酸性的硅胶不适合分离碱性物质；碱性氧化铝不能用来分离酸性的酚类物碱性氧化铝不能用来分离酸性的酚类物质和黄酮类化合物等。质和黄酮类化合物等。被分离对象的考虑因素被分离对象的考虑因素：吸附剂对组分的作用：被分离对象的考虑因素：64（三）吸附层析流动相的选择（三）吸附层析流动相的选择在吸附柱层析分离中的流动相，在薄在吸附柱层析分离中的流动相，在薄层层析中的展开剂，由单一或混合溶层层析中的展开剂，由单一或混合溶剂构成。剂构成。吸附层析过程实际上是组分分子与流吸附层析过程实际上是组分分子与流动相分子竞争占据吸附剂表面活性中动相分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。心的过程。（三）吸附层析流动相的选择在吸附柱层析分离中的流动相，在薄层65（三）吸附层析流动相的选择（三）吸附层析流动相的选择所用流动相的选择应同时考虑所用流动相的选择应同时考虑u 被分离物质的性质、被分离物质的性质、u 吸附剂的活性、吸附剂的活性、u 展开剂的极性三个因素。展开剂的极性三个因素。（三）吸附层析流动相的选择所用流动相的选择应同时考虑66（三）吸附层析流动相的选择（三）吸附层析流动相的选择 分离分离极性较强的组分时极性较强的组分时：u 选用吸附剂活性较低的吸附剂，选用吸附剂活性较低的吸附剂，u 以以极性较强的流动相洗脱；极性较强的流动相洗脱；分离分离极性较弱的组分时极性较弱的组分时：u 选用吸附剂活性较高的吸附剂，选用吸附剂活性较高的吸附剂，u 以以极性较弱的流动相洗脱。极性较弱的流动相洗脱。（三）吸附层析流动相的选择 分离极性较强的组分时：67易挥发，易挥发，毒性小的溶剂，毒性小的溶剂，以便于除去溶剂，回收样品。以便于除去溶剂，回收样品。同时必须注意溶剂对样品中的各种组分同时必须注意溶剂对样品中的各种组分以及与吸附剂之间不发生化学反应。以及与吸附剂之间不发生化学反应。u洗脱液中各馏分的监测一般采用间断式洗脱液中各馏分的监测一般采用间断式定体积收集流出掖，控制流速定体积收集流出掖，控制流速1-31-3滴滴/秒。秒。流动溶剂应尽量选择：流动溶剂应尽量选择：易挥发，流动溶剂应尽量选择：68以吸附原理为主的以吸附原理为主的硅胶柱，硅胶柱，流动相的选择，流动相的选择，一般按溶剂的极性由小到大顺序加入一般按溶剂的极性由小到大顺序加入。常用的有机溶剂极性由小到大的顺序排列：常用的有机溶剂极性由小到大的顺序排列：正己烷石油醚环己烷四氯化碳苯正己烷石油醚环己烷四氯化碳苯甲苯氯仿乙醚乙酸乙醋丙酮甲苯氯仿乙醚乙酸乙醋丙酮 乙醇甲醇水乙酸甲酸。乙醇甲醇水乙酸甲酸。以吸附原理为主的硅胶柱，流动相的选择，一般按溶剂的极性由小到69（四）吸附层析操作技术（四）吸附层析操作技术按其操作方式分为：按其操作方式分为：n 柱层析柱层析n 薄层层析薄层层析 n经典的柱层析法：由于样品容量大，主要经典的柱层析法：由于样品容量大，主要用于天然产物的制备分离；用于天然产物的制备分离；n薄层层析：更适用于分离分析或少量样品薄层层析：更适用于分离分析或少量样品的分离制备。的分离制备。（四）吸附层析操作技术按其操作方式分为：70（四）吸附层析操作技术（四）吸附层析操作技术柱层析：柱层析：n将作为固定相的吸附剂装在一根层析柱中，将作为固定相的吸附剂装在一根层析柱中，从管顶加入流动相。从管顶加入流动相。n使流动相由上往下流过而使各种成分分离使流动相由上往下流过而使各种成分分离并依次流出层析柱的过程称为洗脱。并依次流出层析柱的过程称为洗脱。n在洗脱时，可在柱的下端依次收集洗脱液在洗脱时，可在柱的下端依次收集洗脱液进行检查。进行检查。（四）吸附层析操作技术柱层析：71柱层析的基本操作柱层析的基本操作:(1)(1)装柱装柱装柱的要求：装柱的要求：柱子装得均匀，不能分层，不能有气泡等柱子装得均匀，不能分层，不能有气泡等 否则要重新装柱；否则要重新装柱；柱子的选择：柱子的选择：柱子的直径和分离目的而定。柱子的直径和分离目的而定。一般柱子的直径一般柱子的直径:长度约为长度约为1 1:(10-50);:(10-50);且洗涤干净；且洗涤干净；柱层析的基本操作:(1)装柱72装柱过程：装柱过程：n关闭层析柱出水口，关闭层析柱出水口，装入装入1/3柱高的溶剂作柱高的溶剂作缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢倒入缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢倒入柱中，使其沉降约柱中，使其沉降约3cm高。高。n打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液（吸附均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液（吸附剂的多少根据样品的多少而定）。剂的多少根据样品的多少而定）。注意：注意：不可干柱、分层，否则需要重新装柱。不可干柱、分层，否则需要重新装柱。装柱过程：73柱层析的基本操作柱层析的基本操作:(2)(2)平衡平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的定的pH和离子强度）平衡柱子。和离子强度）平衡柱子。n方法：用恒流泵在恒定压力下走柱子方法：用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。柱层析的基本操作:(2)平衡74柱层析的基本操作柱层析的基本操作:(3)(3)加样加样 加样量的多少直接影响分离的效果。加样量的多少直接影响分离的效果。n加样量应加样量应少于少于20的操作容量，的操作容量，n体积应体积应低于低于5的床体积，的床体积，对于分析柱对于分析柱层析，一般不超过床体积的层析，一般不超过床体积的1。n加样时应缓慢小心将样品溶液加到固加样时应缓慢小心将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保定相表面，尽量避免冲击基质，以保证基质表面平坦。证基质表面平坦。柱层析的基本操作:(3)加样75柱层析的基本操作柱层析的基本操作 (4)(4)洗脱洗脱 【洗脱时切勿使溶剂流干！】【洗脱时切勿使溶剂流干！】洗脱的方式分为：洗脱的方式分为：u 简单洗脱、简单洗脱、u 分步洗脱、分步洗脱、u 梯度洗脱。梯度洗脱。柱层析的基本操作(4)洗脱 76柱层析的基本操作柱层析的基本操作 简单洗脱：简单洗脱：始终是用始终是用同样的一种溶剂洗脱同样的一种溶剂洗脱，直，直到层析分离过程结束。到层析分离过程结束。n适合适合被分离物质对固定相的亲和力被分离物质对固定相的亲和力差异不大，差异不大，n区带的洗脱时间间隔不长区带的洗脱时间间隔不长。柱层析的基本操作 简单洗脱：77柱层析的基本操作柱层析的基本操作 分步洗脱：分步洗脱：n按照按照递增洗脱能力顺序排列递增洗脱能力顺序排列的几种的几种洗脱液，洗脱液，进行逐级洗脱进行逐级洗脱。n适合适合混合物组成简单，各组分性质混合物组成简单，各组分性质差异较大或需快速分离。差异较大或需快速分离。柱层析的基本操作 分步洗脱：78柱层析的基本操作柱层析的基本操作 梯度洗脱：梯度洗脱：n洗脱能力是洗脱能力是逐步连续增加的逐步连续增加的，n梯度可是浓度、极性、离子强度和梯度可是浓度、极性、离子强度和pH等等n最常用的是浓度梯度。最常用的是浓度梯度。n混合物中各组分复杂且性质差异较小时混合物中各组分复杂且性质差异较小时可用。可用。柱层析的基本操作 梯度洗脱：79柱层析的基本操作柱层析的基本操作:(5)(5)收集、鉴定及保存收集、鉴定及保存n由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。定能代表一个纯净的组分。n每管的收集量不能太多，一般每管的收集量不能太多，一般5ml左右；左右；n如分离的物质性质相似，收集更少量如分离的物质性质相似，收集更少量/管。管。n在合并一个峰的各管溶液之前，在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。还要进行鉴定。柱层析的基本操作:(5)收集、鉴定及保存80柱层析的基本操作柱层析的基本操作:(6)(6)基质的再生基质的再生n许多基质可用反复使用多次，许多基质可用反复使用多次，可回收处理后再用，可回收处理后再用，n各种基质的再生方法都有各自的方法，各种基质的再生方法都有各自的方法，n根据不同的处理方法处理基质再生。根据不同的处理方法处理基质再生。柱层析的基本操作:(6)基质的再生81如：聚酰胺柱的再生如：聚酰胺柱的再生待样品中各组分从柱中洗脱后，待样品中各组分从柱中洗脱后，再进一步用甲醇：氨水再进一步用甲醇：氨水(1:1)充分洗涤柱充分洗涤柱子，将柱中吸附残留的样品全部解吸；子，将柱中吸附残留的样品全部解吸；再换用再换用pH3-4的的HCl水溶液通过柱子，水溶液通过柱子，使聚酰胺恢复原有的活性，重复使用。使聚酰胺恢复原有的活性，重复使用。如：聚酰胺柱的再生待样品中各组分从柱中洗脱后，82如：聚酰胺柱的再生如：聚酰胺柱的再生在以制备分离为目的的实验中，在以制备分离为目的的实验中，调节溶液的调节溶液的PH值尽量采用稀值尽量采用稀NaOH和和HCl，以免样品中引进其他的阳离子和阴离子，以免样品中引进其他的阳离子和阴离子，对样品的红外图谱产生干扰。对样品的红外图谱产生干扰。如用如用NH4OH溶液调节溶液调节pH时，在样品中引入时，在样品中引入了了NH4离子，在红外图离子，在红外图1400cm-1处会出现处会出现一尖锐的强蜂，干扰了样品的红外图谱。一尖锐的强蜂，干扰了样品的红外图谱。如：聚酰胺柱的再生在以制备分离为目的的实验中，83（五）吸附薄层层析（五）吸附薄层层析薄层层析：简便、快速、微量的层析方法。薄层层析：简便、快速、微量的层析方法。一般将一般将吸附剂涂布到平面吸附剂涂布到平面如玻璃片上，如玻璃片上，形形成成一一薄层固定相薄层固定相，在一个以展开剂饱和的密闭容器内，在一个以展开剂饱和的密闭容器内，展开剂依靠固定相的毛细作用和固定相作展开剂依靠固定相的毛细作用和固定相作相对移动，使物质发生分离相对移动，使物质发生分离；这种方法称薄层层析。这种方法称薄层层析。（五）吸附薄层层析薄层层析：简便、快速、微量的层析方法。84（五）吸附薄层层析（五）吸附薄层层析薄层层析用的吸附剂与其选择原则：薄层层析用的吸附剂与其选择原则：和柱层析相同，和柱层析相同，主要区别在于：薄层层析要求吸附剂的主要区别在于：薄层层析要求吸附剂的粒粒度更细度更细，一般应小于，一般应小于10um10um，粒度均匀粒度均匀用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活活度要求不宜过高度要求不宜过高，以，以IIIIIIIIII级为宜。级为宜。（五）吸附薄层层析薄层层析用的吸附剂与其选择原则：85（五）吸附薄层层析（五）吸附薄层层析薄层层析用的展开剂：薄层层析用的展开剂：展开距离随薄层的粒度粗细而定；展开距离随薄层的粒度粗细而定；u粒度越细，展开距离相应缩短；粒度越细，展开距离相应缩短；u一般不超过一般不超过10cm10cm，否则影响分离效果；，否则影响分离效果；（五）吸附薄层层析薄层层析用的展开剂：86（五）吸附薄层层析（五）吸附薄层层析薄层层析用的展开剂：薄层层析用的展开剂：当吸附剂的活度一定时，多组分样品的分当吸附剂的活度一定时，多组分样品的分离取决于展开剂的选择。离取决于展开剂的选择。u中草药化学成分在脂溶性成分中大致分中草药化学成分在脂溶性成分中大致分为：无极性、弱极性、中极性与强极性为：无极性、弱极性、中极性与强极性（五）吸附薄层层析薄层层析用的展开剂：87 薄层层析薄层层析 薄层层析88特殊薄层特殊薄层 n对于某些性质特殊的化合物的分离与对于某些性质特殊的化合物的分离与检出，需要采用一些特殊薄层检出，需要采用一些特殊薄层,包括：包括：荧光薄层荧光薄层 络合薄层络合薄层 酸碱薄层和酸碱薄层和PH缓冲薄层缓冲薄层 特殊薄层 对于某些性质特殊的化合物的分离与检出，需要采用一些89 荧光薄层荧光薄层原因：原因：n有些化合物本身无色，在紫外灯下也有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当的显色剂；不显荧光，又无适当的显色剂；荧光薄层原因：90 荧光薄层荧光薄层处理：处理：u可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析。薄层进行层析。展层后置于紫外光下照射，薄层板展层后置于紫外光下照射，薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显荧本身显荧光，而样品斑点处不显荧光，即可检出样品的层析位置。光，即可检出样品的层析位置。荧光薄层处理：91 荧光薄层荧光薄层常用的荧光物质多为无机物。常用的荧光物质多为无机物。u其一是其一是在在254nm紫外光激发下紫外光激发下显出荧光的，显出荧光的，如锰激化的硅酸锌。如锰激化的硅酸锌。u另一种为另一种为在在365nm紫外光激发下紫外光激发下发出荧光发出荧光 如银激化的硫化锌、硫化锆。如银激化的硫化锌、硫化锆。荧光薄层常用的荧光物质多为无机物。92 络合薄层络合薄层n常用的有硝酸银薄层，常用的有硝酸银薄层，n用来用来分离碳原子数相等而其中分离碳原子数相等而其中C=C双键数目不等的一系列化合物，双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、酸等。如不饱和醇、酸等。络合薄层常用的有硝酸银薄层，93 络合薄层络合薄层其主要机理其主要机理n由于由于C=C键能与硝酸银形成络合物键能与硝酸银形成络合物，n而而饱和的饱和的C-C键则不与硝酸银络合键则不与硝酸银络合。n因此在硝酸银薄层上，化合物可由于因此在硝酸银薄层上，化合物可由于饱和程度不同而获得分离。饱和程度不同而获得分离。络合薄层其主要机理94 络合薄层络合薄层层析时：层析时：n饱和化合物由于吸附最弱而饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高，最高，n含一个双键的较含两个双键的含一个双键的较含两个双键的Rf值高，值高，n含一个三键的较含一个双键的含一个三键的较含一个双键的Rf值高。值高。n在一个双键化合物中，顺式的与硝酸银在一个双键化合物中，顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行。络合较反式的易于进行。n因此，还可用来分离顺反异构体。因此，还可用来分离顺反异构体。络合薄层层析时：95 酸碱薄层和酸碱薄层和pH缓冲薄层缓冲薄层n改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄层改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层。时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层。如如硅胶带微酸性硅胶带微酸性：有时对碱性物质如生物碱的分离不好，有时对碱性物质如生物碱的分离不好，u 如不能展层或拖尾如不能展层或拖尾 可在铺薄层时，用稀碱溶液可在铺薄层时，用稀碱溶液0.10.5NNa0H溶液制成碱性硅胶薄层。溶液制成碱性硅胶薄层。酸碱薄层和pH缓冲薄层改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄96 （4 4）薄层层析法应用）薄层层析法应用 化学成分的预试化学成分的预试 化学成分的鉴定化学成分的鉴定 探索柱层分离的条件探索柱层分离的条件（4）薄层层析法应用 化学成分的预试97 化学成分的预试化学成分的预试u用薄层层析法进行中草药化学成分预试，用薄层层析法进行中草药化学成分预试，u可依据各类成分性质及熟知的条件，可依据各类成分性质及熟知的条件，u有针对性地进行。有针对性地进行。u由于在薄层上展层后，可将一些杂质分离，由于在薄层上展层后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠。选择性高，可使预试结果更为可靠。化学成分的预试用薄层层析法进行中草药化学成分预试，98 化学成分的鉴定化学成分的鉴定n以薄层层析法进中草药化学成分鉴定，最以薄层层析法进中草药化学成分鉴定，最好好要有标准样品进行共薄层层析要有标准样品进行共薄层层析。n如用数种溶剂展层后，标准品和鉴定品的如用数种溶剂展层后，标准品和鉴定品的Rf值、斑点形状颜色都完全相同值、斑点形状颜色都完全相同，则可作，则可作初步结论是同一化合物。初步结论是同一化合物。n但但一般需进行化学反应或红外光谱等一种一般需进行化学反应或红外光谱等一种仪器分析方法加以核对仪器分析方法加以核对。化学成分的鉴定以薄层层析法进中草药化学成分鉴定，最好要有99 探索柱层分离的条件探索柱层分离的条件在进行柱层分离时：在进行柱层分离时：n首先考虑选用何种吸附剂与洗脱剂。首先考虑选用何种吸附剂与洗脱剂。n在洗脱过程中各个成分将按何种顺在洗脱过程中各个成分将按何种顺序被洗脱，序被洗脱，n每一洗脱液中是否为单一成分或混每一洗脱液中是否为单一成分或混合体，合体，探索柱层分离的条件在进行柱层分离时：100 探索柱层分离的条件探索柱层分离的条件均可由薄层的分离得到判断与检验。均可由薄层的分离得到判断与检验。n通过薄层的预分离，还可以了解多组分样通过薄层的预分离，还可以了解多组分样品的组成与相对含量。品的组成与相对含量。n如在薄层上摸索到比较满意的分离条件，如在薄层上摸索到比较满意的分离条件，n即可将此条件用于干柱层析。即可将此条件用于干柱层析。探索柱层分离的条件均可由薄层的分离得到判断与检验。101中药的薄层色谱分析中药的薄层色谱分析中药的薄层色谱分析102组分移动的位置组分移动的位置溶剂前沿溶剂前沿RARxARf=RA/RxBCDRf值的范围为值的范围为0.35Rf0.15时，可达到分离目的时，可达到分离目的组分移动的位置溶剂前沿RARxARf=RA/RxBCDR103（5）制备薄层色谱）制备薄层色谱 PTLC n一种是流动相靠毛细管作用力流经固定相一种是流动相靠毛细管作用力流经固定相 （传统的制备型薄层薄层色谱传统的制备型薄层薄层色谱）n另一些方法是流动相靠外力强制流动，另一些方法是流动相靠外力强制流动，如离心薄层色谱和加压薄层色谱。如离心薄层色谱和加压薄层色谱。（5）制备薄层色谱 PTLC 一种是流动相靠毛细管作用力流经104（5 5）制备薄层色谱）制备薄层色谱 PTLC PTLC 吸附剂吸附剂:硅胶硅胶是最常用的吸附剂。是最常用的吸附剂。上样量与吸附剂的厚度有关。上样量与吸附剂的厚度有关。（5）制备薄层色谱 PTLC 吸附剂:105（5）制备薄层色谱）制备薄层色谱 PTLC 上样上样:是进行是进行PTLCPTLC分离的一个最关键的步骤。分离的一个最关键的步骤。上样前先用样品溶于少量溶剂，上样前先用样品溶于少量溶剂，u低挥发性溶剂可引起点样带变宽，低挥发性溶剂可引起点样带变宽，u最好选用挥发性溶剂最好选用挥发性溶剂（如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等）（如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等）样品浓度应样品浓度应在在5%-10%左右。左右。点样带尽可能狭窄，以获得更好的分离效果点样带尽可能狭窄，以获得更好的分离效果点样可用手工进行或自动点样仪。点样可用手工进行或自动点样仪。（5）制备薄层色谱 PTLC 上样:是进行PTLC分离的一106展开剂的选择及展开展开剂的选择及展开:在进行在进行PTLC之前应用分析型之前应用分析型TLC预预试验来确定展开剂。试验来确定展开剂。被分离物质的回收：被分离物质的回收：用合适溶剂溶解样品，浓缩即可。用合适溶剂溶解样品，浓缩即可。展开剂的选择及展开:107（六）大孔吸附树脂（六）大孔吸附树脂u大大孔孔吸吸附附树树脂脂是是一一种种具具有有多多孔孔立立体体结结构构人人工工合合成成的的聚聚合合物物吸吸附附剂剂，具具有有较较好好的的吸吸附附性性能能。它它的的吸吸附附作作用用是是通通过过表表面面吸吸附附、表表面电性或形成氢键。面电性或形成氢键。u大大孔孔树树脂脂吸吸附附分分离离技技术术是是采采用用特特殊殊的的吸吸附附剂剂，选选择择地地吸吸附附其其中中的的有有效效成成分分，去去除除无无效成分的一种提取精制的新工艺。效成分的一种提取精制的新工艺。（六）大孔吸附树脂大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成108 大孔吸附树脂的性质大孔吸附树脂的性质大大孔孔吸吸附附树树脂脂多多为为白白色色的的球球状状颗颗粒粒粒粒度度多多为为20-6020-60目目，通通常常分分为为非非极极性性、中中性性和和极极性性三三大大类类，根根据据极极性性大大小小还还可可分分为为弱弱极极性性、中等极性和强极性中等极性和强极性。常常用用的的为为苯苯乙乙烯烯型型和和丙丙烯烯腈腈型型，在在树树脂脂合合成成时时根根据据需需要要引引入入极极性性基基团团则则成成为为极极性性树树脂从而增强吸附能力。脂从而增强吸附能力。大孔吸附树脂的性质大孔吸附树脂多为白色的球状颗粒粒度多109 大孔吸附树脂的性质大孔吸附树脂的性质优点：优点：大孔吸附树脂的大孔吸附树脂的理化性质稳定，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂不溶于酸、碱及有机溶剂。对有机物的对有机物的选择性较好选择性较好，不不受受无无机机盐盐类类及及强强离离子子低低分分子子化化合合物存在的影响。物存在的影响。大孔吸附树脂