阪崎肠杆菌检验--课件

阪崎肠杆菌检验GB 4789.40-2010GB 4789.40-2010 Enterobacter Enterobacter sakazakii(ES)sakazakii(ES)2内容第一部分：一般特征第二部分：致病性第三部分：ESES的检验3m阪崎肠杆菌(Esakazakii)是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定条件下可引起人和动物致病。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50%以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。第一部分：一般特征1 1培养特征2 2生化反应3 3抵抗力4 4增殖能力与其他常与其他常见肠见肠杆菌相似杆菌相似5一、培养特征阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、血平板、麦康凯(MacConkey，MAC)琼脂、伊红美蓝琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。ESES在VRBGAVRBGA平板上首次划线分离时，3737培养24h24h可生成2 2种不同的形态学特征：1.1.干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。2.2.光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。6本实验室1.1.大多数分离株呈流蜡样，粉紫色、圆形、光滑、凸起、饱满，并散发出特殊气味；2.2.干燥、顶端发白的粉紫色菌落；3.3.从配方粉中初次分离到的该菌在VRBGAVRBGA平板上过夜培养后呈现特殊的菌落形态：菌落干燥、边缘有褶皱，极富弹性。传代后，菌落皱褶减少，延长培养时间，可见皱褶逐渐增加。7二、生化反应 8mDNASE-脱氧核糖核酸酶10注：90-100；()：75-89%；V ：25-74；()：10-24；：0-9三、抵抗力m耐热性 m渗透压m干燥 不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消毒过程能有效的灭活ESES。ESES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，增加PIFPIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF PIF（婴儿配方奶）中长期存活。11四、增殖能力 m66，2121，3737分别是13.7h13.7h，1.7h1.7h，191921min21minm研究发现，与本底相比，2525放置6h6h该菌的相对危险性可增加3030倍；2525放置10h10h可增加30 00030 000倍。m20042004年2 2月FAO/WHOFAO/WHO在日内瓦召开的PIFPIF中ESES专家研讨会上提出PIFPIF中微量的ESES（3 3 3 3 CFU/100gCFU/100gCFU/100gCFU/100g）污染也能导致感染的发生。12第二部分：致病性1 1易感人群2 2主要感染渠道3 3配方粉中ESES的污染状况4 4PIFPIF中ESES的来源及中毒发生的原因13一、易感人群婴儿：1.1.脑膜炎2.2.坏死性小肠结肠炎3.3.菌血症m严重的神经系统后遗症m高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出生体重等免疫力低下的婴儿。m死亡率：50%50%，20-50%20-50%成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等14二、主要感染渠道 ！乳品安全标准（报批稿）m婴儿配方食品m特殊医学用途配方食品0-6个月龄15第三部分食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验本标准修改采用1.ISO/TS 22964（1st edition 2006-02-01）Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakii2.FDA July 2002;Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula 17第一法：阪崎肠杆菌的检验第二法：阪崎肠杆菌的计数18第一法 阪崎肠杆菌的检验19阪崎肠杆菌检验程序 报 告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂361，24 h2h挑取蓝绿色菌落1mL+mLST-Vm 10mL440.5，24 h2h检样100 g/mL+BPW稀释液 900 mL361，18 h2h前增菌选择性增菌选择性分离生 化 鉴 定TSA251，48 h4h5.1 5.1 前增菌和增菌BPWBPW（合适时可选择无菌水）左图：未混合；右图：混合后。21mLST-VmmLST-Vm mLST-VmmLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤LSTLST中另加入适量的NaClNaCl和Vm Vm。研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏菌等）相比，菌等）相比，ESES具有较高的耐渗透压能力。加入具有较高的耐渗透压能力。加入0.5 M 0.5 M 的的NaClNaCl在保证在保证ESES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。细菌的生长。VmVm可有效地抑制可有效地抑制G+G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长。步抑制其他细菌的生长。225.2 5.2 分离 显色培养基的基本原理相似，二者都是根据ESES能产生-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlcXaGlc产生有色菌落。23m显色培养基对ESES的选择性较好，ESES形成的特征性菌落易于辨认，以DFIDFI为例：1.1.硫化氢指示剂可以区分硫化氢指示剂可以区分ESES和产生少量和产生少量-葡萄糖苷酶但葡萄糖苷酶但H2SH2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。阳性菌株（如普通变形杆菌）。2.2.ESES都可以在该平板上生长并产生都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落蓝绿色菌落3.3.其他常见菌在其他常见菌在DFIDFI平板的菌落颜色平板的菌落颜色a.a.白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等属的多种菌等b.b.黄色菌落：赫氏埃希氏菌黄色菌落：赫氏埃希氏菌c.c.黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种ESIA:ESIA:蓝色，蓝色，1-3mm1-3mm国产显色培养基国产显色培养基2426TSATSA：2525培养后典型ESES：黄色阴性对照E.coli E.coli ATCC 25922ATCC 25922：白色菌落27黄色素5.3 鉴定（生化反应）29商业生化鉴定系统的应用m推荐使用的ESES生化鉴定方法有很多，主要有API API 20E20E，ID ID 32E32E，Biolog Biolog GN2 MicroPlateGN2 MicroPlate，VITEK GNI+VITEK GNI+等。上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。m在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API 20EAPI 20E和Vitek GNI+Vitek GNI+。30API 20EAPI 20E生化鉴定板典型生化反应图示 31第二法 阪崎肠杆菌的计数323 3管MPNMPN法33m7.1 样品的稀释m7.1.1 固体和半固体样品：无菌称取样品100 g、10 g、1 g 各三份，加入已预热至44 分别盛有900 mL、m90 mL、9 mL BPW 中，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10 样品匀液，置36 1 培养18 h2 h。分别m移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 0.5 培养24 h2 h。m7.1.2 液体样品：以无菌吸管分别取样品100 mL、10 mL、1 mL 各三份，加入已预热至44 分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，轻轻振摇使充分混匀，制成1:10 样品匀液，置36 1 培养18h2h。m分别移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 0.5 培养24 h2 h。m7.2 分离、鉴定:同5.2，5.3。m8 结果与报告m综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查MPN 检索表，报告每100 g（mL）样品中阪崎肠杆菌的MPN 值（见附录中表B.1）。婴幼儿食品注意：在样品备注中填报该类产品的适宜人群。1.婴幼儿配方粉2.婴幼儿谷基辅助食品3.特殊医学用途婴儿配方食品 4.婴幼儿罐装辅助食品5.其他婴幼儿食品m婴儿：指012月龄的人。m较大婴儿：指6月龄12月龄的人。m幼儿：指12月龄36月龄的人。婴幼儿食品分类2010监测样品36谢谢大家！