食品安全快速检测技术微生物快速检测专题课件

食品安全快速检测技术微生物快速检测专题项目八项目八 食品中微生物食品中微生物的快速检测的快速检测概述概述l常常见见的的食食源源性性病病原原体体:沙沙门门菌菌、副副溶溶血血性性弧弧菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、肉肉毒毒梭梭菌菌、大大肠肠埃埃希希菌菌、产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌(魏魏氏氏梭梭菌菌)、猪猪囊囊尾尾蚴蚴、旋旋毛毛虫虫、黄黄曲曲霉霉等。等。l常常用用微微生生物物快快速速检检测测方方法法有有即即用用型型纸纸片片法法、生生物物化化学学技技术术、选选择择鉴鉴定定用用培培养养基基法法、分分子子生生物物学学检检测测技技术术、ATP生生物物荧荧光光技技术术、LAMP法法、免免疫疫分分析析检检测测技技术术、细细菌菌直直接接计计数数法法、噬噬菌菌体体鉴鉴定定技技术术、全全自动微生物分析系统自动微生物分析系统等。等。快速检测快速检测菌落总菌落总数数一次性菌落总数测试一次性菌落总数测试片片l l我我我我国国国国细细细细菌菌菌菌性性性性食食食食物物物物中中中中毒毒毒毒中中中中，70%70%80%80%是是是是由由由由沙沙沙沙门门门门菌引起的。菌引起的。菌引起的。菌引起的。在在食食品品生生产产、加加工工、储储存存、运运输输、销销售售等等各各个个环环节节中中都都有有污污染染微微生生物物的的可可能能。一一旦旦污污染染，微微生生物物将将大大量量繁繁殖殖而而引引起起食食品品腐腐败败变变质质，或或导导致致食食源源性性感感染染和和食物中毒。食物中毒。食品中病原菌的快速检测面临的主要问题食品中病原菌的快速检测面临的主要问题l l(1)分离、富集待测病原菌；分离、富集待测病原菌；l l(2)提提高高检检测测的的速速度度和和准准确确性性，同同时时检检测测多多目目标微生物。标微生物。食品微生物快速检测技术的发展趋势食品微生物快速检测技术的发展趋势l(1)绘制各种菌落图谱，开发在线检测软件，提高检测效率绘制各种菌落图谱，开发在线检测软件，提高检测效率l(2)定量测定微生物细胞特征和性能，定量测定微生物细胞特征和性能，l(3)克克服服分分子子生生物物学学方方法法的的缺缺点点，简简化化检检测测程程序序，使使食食源源性性病病毒毒的的检检测测方方法法向向自自动动化化、快快速速化化、灵灵敏敏度度高高、特特异异性性强强、重复性好以及简易易行重复性好以及简易易行l(4)试验条件标准化及检测的高精度和高灵敏度发展。试验条件标准化及检测的高精度和高灵敏度发展。微生物学概念微生物学概念l l 菌落：是是指指细细菌菌在在固固体体培培养养基基上上生生长长繁繁殖殖而而形形成成的的能能被被肉肉眼眼识识别别的的生生长长物物，它它是是由由数数以以万万计计相相同同的的微微生生物物集集合合而而成成。当当样样品品被被稀稀释释到到一一定定程程度度，与与培培养养基基混混合合，在在一一定定培培养养条条件件下下，每每个个能能够够生生长长繁繁殖殖的的细细菌菌细细胞胞都都可可以以在在平平板板上上形成一个可见的菌落。形成一个可见的菌落。l l菌 落 形 成 单 位 叫 做 CFU（Colony-Forming Units）：是形成菌落的菌落个数，不等于细菌个数。）：是形成菌落的菌落个数，不等于细菌个数。l两两相相同同细细菌菌靠靠得得很很近近或或贴贴在在一一起起，那那么么经经过过培培养养这这两两个个细细菌菌将将会会形形成成一一个个菌菌落落，此此时时就就是是2个个细细菌菌，1CFU。菌菌落落总总数数往往往往采采用用的的是是平平板板计计数数法法，经经过过培培养养后后我我们们数数出出平平板板上上所所生生长长出出的的菌菌落落个个数数，从从而而计计算算出出每每毫毫升升或或每每克克待待检检样样品品中中可可以以培养出多少个菌落，于是以培养出多少个菌落，于是以CFU/ml或或CFU/g报告之。报告之。l l菌落总数：是是指指在在一一定定条条件件下下（如如需需氧氧情情况况、营营养养条条件件、pH、培培养养温温度度和和时时间间等等），每每克克（每每毫毫升升）检检样样所所生生长长出出来来菌落菌落的的总数总数。微生物学概念微生物学概念用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。食品菌落总数严重超标，会破坏食品的营养成分，加速食品腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品，容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安全。食品中菌落总数食品中菌落总数纸片法纸片法细菌在测试片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（30300个）的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。案例案例夏夏夏夏令令令令时时时时节节节节是是是是各各各各类类类类冷冷冷冷饮饮饮饮产产产产品品品品的的的的销销销销售售售售旺旺旺旺季季季季，某某某某市市市市消消消消保保保保委委委委近近近近期期期期对对对对该该该该市市市市流流流流通通通通领领领领域域域域的的的的冰冰冰冰淇淇淇淇淋淋淋淋进进进进行行行行了了了了比比比比较较较较试试试试验验验验。检检检检测测测测显显显显示示示示，2222件件件件样样样样品品品品中中中中，有有有有1010件件件件不不不不符符符符合合合合标标标标准准准准。其其其其中中中中，冰冰冰冰雪雪雪雪皇皇皇皇后后后后(DQ)(DQ)、酷酷酷酷圣圣圣圣石石石石、多多多多乐乐乐乐星星星星等等等等多多多多个个个个知知知知名名名名品品品品牌牌牌牌因因因因大大大大肠肠肠肠菌菌菌菌群群群群超超超超标标标标等等等等原原原原因因因因上了上了上了上了“黑榜黑榜黑榜黑榜”。据据据据专专专专家家家家分分分分析析析析，大大大大肠肠肠肠菌菌菌菌群群群群超超超超标标标标的的的的主主主主要要要要原原原原因因因因是是是是二二二二次次次次污污污污染染染染。如如如如加加加加工工工工器器器器具具具具没没没没有有有有定定定定期期期期清清清清洗洗洗洗消消消消毒毒毒毒，操操操操作作作作人人人人员员员员在在在在上上上上完完完完卫卫卫卫生生生生间间间间后后后后洗洗洗洗手手手手不不不不彻彻彻彻底底底底，个个个个人人人人卫卫卫卫生生生生状状状状况况况况未未未未达达达达标标标标，直直直直接接接接影影影影响响响响最最最最终终终终产产产产品的卫生状况。品的卫生状况。品的卫生状况。品的卫生状况。检测意义检测意义l l概概念念：大大大大肠肠肠肠菌菌菌菌群群群群系系系系指指指指一一一一群群群群能能能能发发发发酵酵酵酵乳乳乳乳糖糖糖糖、产产产产酸酸酸酸或或或或醛醛醛醛，并并并并产产产产生生生生-半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶需需需需氧氧氧氧或或或或兼兼兼兼性性性性厌厌厌厌氧氧氧氧的的的的革革革革兰兰兰兰氏氏氏氏阴阴阴阴性性性性无芽孢杆菌。无芽孢杆菌。无芽孢杆菌。无芽孢杆菌。l l来来源源：该该该该菌菌菌菌主主主主要要要要来来来来源源源源于于于于人人人人畜畜畜畜粪粪粪粪便便便便，故故故故以以以以此此此此作作作作为为为为粪粪粪粪便便便便污污污污染染染染指指指指标标标标来来来来评评评评价价价价食食食食品品品品的的的的卫卫卫卫生生生生质质质质量量量量，推推推推断断断断食食食食品品品品中中中中有有有有否污染肠道致病菌的可能。否污染肠道致病菌的可能。否污染肠道致病菌的可能。否污染肠道致病菌的可能。l l意意义义：大大大大肠肠肠肠菌菌菌菌群群群群存存存存在在在在于于于于食食食食品品品品中中中中，表表表表明明明明未未未未作作作作有有有有效效效效的的的的消消消消毒毒毒毒处处处处理理理理、加加加加工工工工后后后后保保保保存存存存条条条条件件件件不不不不良良良良或或或或消消消消毒毒毒毒后后后后又又又又受受受受到到到到污污污污染染染染。快快快快速速速速检检检检验验验验这这这这些些些些细细细细菌菌菌菌，有有有有助助助助于于于于食食食食品品品品的的的的卫卫卫卫生生生生管管管管理理理理，维护消费者的食用安全。维护消费者的食用安全。维护消费者的食用安全。维护消费者的食用安全。步骤步骤大肠菌群测试大肠菌群测试纸片法纸片法l将将乳乳糖糖、显显色色剂剂和和选选择择性性培培养养基基加加载载在在纸纸片片上上，经经培培养养后后能能够够在在纸纸片片上上生生长长并并发发酵酵乳乳糖糖产产酸酸的的即即为为大大肠肠菌菌群群阳阳性性，记记录录每每个个稀稀释释度度大大肠肠菌菌群阳性纸片数，根据大肠菌群群阳性纸片数，根据大肠菌群MPNMPN表查出相应的大肠菌群数。表查出相应的大肠菌群数。l若若纸纸片片变变黄黄或或在在黄黄色色背背景景上上呈呈现现红红色色斑斑点点为为大大肠肠菌菌群群阳阳性性纸纸片片。纸纸片片保保持持紫紫兰兰色色不不变变或或在在紫紫兰兰色色背背景景上上呈呈现现红红色色斑斑点点，但但周周围围没没有有黄黄色色均均为大肠菌群阴性纸片。为大肠菌群阴性纸片。加水的纸片大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌革兰氏染色电子显微镜下的出血性大肠杆菌细菌细菌大肠菌群检测试剂盒大肠菌群检测试剂盒图1加样后排气泡图2 大肠菌群阳性（左）大肠菌群阴性（右）图3 大肠菌群试管阳性（左）大肠菌群试剂盒阳性（右）方法原理：与国标法相同。事先将浓缩乳糖胆盐培养基、亚硒酸盐胱氨酸方法原理：与国标法相同。事先将浓缩乳糖胆盐培养基、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、增菌液、GN增菌液、增菌液、7.5%氯化钠培养基、包被在试剂盒中，随时取用氯化钠培养基、包被在试剂盒中，随时取用观观察察结结果果：样样液液变变为为黄黄色色为为产产酸酸、集集气气窗窗中中有有气气泡泡为为产产气气，既既产产酸酸产产气气的的样样品品为为阳阳性性结结果果，见见图图2 2、图、图3 3。根据试剂盒的阳性管数，参照国标。根据试剂盒的阳性管数，参照国标GB/T4789.3-2003GB/T4789.3-2003的方法查的方法查MPNMPN检索表报告结果。检索表报告结果。操作步骤操作步骤 1.样 品 处 理：按 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB/T4789.3.4.5.10-2003。l2.加加样样：将试剂盒放在台面上，打开盒盖，用无菌吸管吸取3个1：10稀释液10mL分别加入试剂盒3个大发酵培养基孔内，用无菌吸管吸取3个1mL分别加入试剂盒3小发酵培养基孔内。另用无菌吸管取1：10稀释后的样品1mL注入到9mL灭菌生理盐水中（1：100）取此管3个1mL稀释液加入到试剂盒另3个小发酵培养基孔内。另用无菌吸管吸取稀释后的样品3个4mL分别加入致病菌增菌管（孔）（A、B、C）孔内。l3.排气泡:加样后集气窗内如有气泡存在，可将试剂盒以3045度角倾斜，（图1）必要时可轻轻用力在桌面敲击数下即可排出集气窗内气泡。l4.培养：将加样后的试剂盒置36 1温箱中，培养1824h。样品处理样品处理注意事项注意事项l1加入样品后不需摇匀，平拿平放。l2 加样时可用一次性无菌塑料吸管，将样品稀释液加至试剂盒所标刻度处。l3 在培养箱中取试剂盒时应平托出来，不要倾斜以免由于试剂盒的倾斜将阳性管集气窗中的气泡排出而影响结果。l4 试剂盒为一次性无菌用品，供一次性使用。实验四实验四 食品中菌落总数测试食品中菌落总数测试l本章学习要求l了解食品安全微生物指标了解食品安全微生物指标l掌握食品中菌落总数测试的快速检测技术掌握食品中菌落总数测试的快速检测技术菌落总数测试片l测测试试片片检检测测方方法法有有操操作作简简单单，检检测测周周期期短短等等优优点点，它它一一旦旦投投入入使使用用，将将大大大大缩缩短短检检测测周周期期，简简化化实实验验操操作作并并取取得得较较大大的的经经济济收收益益，目目前前已已被被国国内内很很多多食食品品工工厂厂所所认认可可并并使使用用。位位 列列 美美 国国 前前 100强强 的的 80多多 家家 食食 品品 厂厂，都都 在在 使使 用用 3M Petrifilm测试片来进行微生物的检测测试片来进行微生物的检测原理原理测试片是美国测试片是美国3M3M公司公司发明的一种进行菌落计数的干膜，发明的一种进行菌落计数的干膜，采用可再生的水合物材质，由上下两层薄膜组成。上层采用可再生的水合物材质，由上下两层薄膜组成。上层聚丙烯薄膜含有粘合剂、指示剂及冷水可溶性凝胶；下聚丙烯薄膜含有粘合剂、指示剂及冷水可溶性凝胶；下层聚乙烯薄膜含有层聚乙烯薄膜含有细菌生长所需的营养琼脂培养基细菌生长所需的营养琼脂培养基。细。细菌在测试片上生长时，细胞代谢产物与上层的指示剂菌在测试片上生长时，细胞代谢产物与上层的指示剂TTCTTC发生氧化还原反应，将指示剂还原成红色非溶解性产物发生氧化还原反应，将指示剂还原成红色非溶解性产物三苯甲，从而使细菌着色。故测试片上红色菌落判断为三苯甲，从而使细菌着色。故测试片上红色菌落判断为菌落总数。具体方法详见行业标准菌落总数。具体方法详见行业标准SN/T 1897-2007SN/T 1897-2007食品食品中菌落总数的测定中菌落总数的测定PetrifilmPetrifilm测试片法。测试片法。测测试试片片法法适适合合于于各各类类食食品品及及食食品品原原料料中中菌菌落落总总数数的的测测定定，也也可可用用于于检检测测食食品品加加工工容容器器、操操作作台台和和其其他他设备表面的菌落总数。设备表面的菌落总数。使用方法菌落总数测试片的使用方法如图：3 操作方法3.13.1样样品品处处理理。无无菌菌称称取取样样品品25mL25mL（g g）放放入入含含有有225mL225mL灭灭菌菌磷磷酸酸缓缓冲冲液液稀稀释释液液（或或生生理理盐盐水水）的的取取样样罐罐或或均均质质杯杯内内，制制成成1:101:10的的样样品品匀匀液液，必必要要时时用用1mol/LNaOH1mol/LNaOH或或1mol/LHCl1mol/LHCl溶溶液液调调节节样样品品匀匀液液pHpH至至6.66.67.27.2。用用1mL1mL灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1:101:10样样品品匀匀液液1mL1mL，注注入入含含有有9mL9mL稀稀释释液液的的试试管管内内，振振摇摇后后成成为为1:1001:100的的样样品品匀匀液液，以以此此类类推推，做做出出1:10001:1000等等稀稀释释度度的的样样品品匀匀液液，每每次次换换一一支支吸管。吸管。3.23.2接接种种。一一般般食食品品选选2 23 3个个稀稀释释度度进进行行检检测测，含含菌菌量量少少的的液液体体样样品品（如如饮饮用用纯纯水水和和矿矿泉泉水水等等）可可直直接接吸吸取取原原液液进进行行检检测测。将将菌菌落落总总数数测测试试片片置置于于水水平平实实验验台台面面，揭揭开开上上层层膜膜，用用无无菌菌吸吸管管吸吸取取1mL1mL样样品品匀匀液液慢慢慢慢均均匀匀地地滴滴加加到到纸纸片片上上，然然后后再再将将上上层层膜膜缓缓慢慢盖盖下下，静静置置10s10s左左右使培养基凝固，每个稀释度接种两片，同时做一片空白阴性对照。右使培养基凝固，每个稀释度接种两片，同时做一片空白阴性对照。3.33.3培培养养。将将测测试试片片叠叠在在一一起起放放回回原原自自封封袋袋中中并并封封口口，透透明明面面朝朝上上，水水平平置置于于恒恒温温培培养养箱箱内内，堆堆叠叠片片数数不不超超过过1212片片。一一般般食食品品培培养养温温度度为为36361 1，培培养养151524h24h；水水产产品品培培养养温温度为度为30301 1，培养，培养48h48h。4 4 结果判读细细菌菌在在测测试试片片上上生生长长后后会会显显示示红红色色斑斑点点，选选择择菌菌落落数数适适中中（3030300300个个）的的测测试试片片进进行行计计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。7.27.2磷酸缓冲液稀释液的配制与灭菌磷酸缓冲液稀释液的配制与灭菌贮贮存存液液：称称取取34.0g34.0g的的磷磷酸酸二二氢氢钾钾溶溶于于500mL500mL蒸蒸馏馏水水中中，用用大大约约175mL175mL的的1mol/L1mol/L氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液调调节节pHpH至至7.27.2，用用蒸蒸馏馏水稀释至水稀释至1000mL1000mL后贮存于冰箱。后贮存于冰箱。稀稀释释液液：取取贮贮存存液液1.25mL1.25mL，用用蒸蒸馏馏水水稀稀释释至至1000mL1000mL，分分装装于于适适宜宜容容器器中中，121121高高压压灭灭菌菌1515分分钟钟，或或者者放放入入消消毒毒碗碗柜中消毒。柜中消毒。7.3 7.3 生生理理盐盐水水的的配配制制与与灭灭菌菌：取取8.5g8.5g分分析析纯纯氯氯化化钠钠溶溶解解到到1000mL1000mL蒸蒸馏馏水水或或纯纯净净水水中中，先先煮煮开开后后进进行行分分装装，取取9mL9mL加加入入到到10mL10mL洁洁净净试试管管中中，盖盖上上硅硅橡橡胶胶塞塞或或棉棉纱纱塞塞，放放入入红红外外线消毒柜中消毒。线消毒柜中消毒。THANKS谢谢聆听谢谢！谢谢！