食品中细菌菌落总数的测定-课件

食品中细菌菌落总数的测定一、目的1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。2 2、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义 。二、原理 细菌数量的表示方法由于所采纳的计数方法不同而有两种:菌落总数和细菌总数。1、菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以CFU/g(mL)来表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。按国家标准方法规定,即在需氧情况下,36 1,36 1培养482482h,能在平板计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。因此厌氧或微需氧菌、有特别营养要求的以及非嗜中温的细菌,由于现有条件不能满足其生理需求,故难以繁殖生长。菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数,也不能区分其中细菌的种类,只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数,因此有时被称为杂菌数,需氧菌数等。2菌落总数测定的卫生学意义(1)菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志,也能够应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。(2)食品中细菌菌落总数越多,则食品含有致病菌的估计性越大,食品质量越差;菌落总数越小,则食品含有致病菌的估计性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验,才能对食品做出较全面的评价。3 3、细菌总数指一定数量或面积的食品样品、经过适当的处理后,在显微镜下对细菌进行直截了当计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直截了当显微镜数。通常以1g或1mL样品中的细菌总数来表示。三、材料1、食品检样2、培养基平板计数培养基,无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液3、其它无菌培养皿,无菌吸管,电炉、恒温培养箱等。四、流程1 1、检样 2 2、做几个适当倍数的稀释液3、选择23个适宜稀释度各1 mL,1 mL,分别加入灭菌平皿内 4 4、平皿内倾注151520 mL20 mL琼脂培养基,混匀5 5、36 136 1培养482482小时或(242)(242)小时6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量7 7、计算菌落总数 报告 五、步骤(一)取样、稀释和培养1、以无菌操作取检样25g(mL),放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理12min,制成1:10的均匀稀释液。2、用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内,振摇试管或反复吹打混合均匀,制成1:100的稀释液。3、另取1mL灭菌吸管,按上项操作顺序,制10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。4、依照标准要求或对污染情况的估计,选择23个适宜稀释度,分别在制作10倍递增稀释的同时,以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml稀释液(不含样品)加入两个灭菌平皿内作空白对比。5、稀释液移入平皿后,将冷却至46琼脂培养基注入平皿约1520ml,并转动平皿,混合均匀。6、待琼脂凝固后,翻转平板,置361温箱内培养482h,水产品301温箱内培养723h。如样品中估计含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4毫升),凝固后培养。(二)菌落记录方法做平板菌落数记录时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数。到达规定培养时间,应马上计数。假如不能马上计数,应将平板放置于0 04,4,但不要超过24h24h。1 1、平皿菌落数的选择 选取菌落数在3030300300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采纳两个平皿,大于300300的可记为多不可计。2、其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采纳,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又特别均匀,则能够计算半个平板后乘以2,以代表一个平板的菌落数。3、当平板上有链状菌落生长时,如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限,则应作为一个菌落计,如存在有几条不同来源的链,则每条链均应按一个菌落计算,不要把链上生长的每一个菌落分开计数。(三)菌落总数的计算 1 1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)g(mL)中菌落总数结果。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g/g或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平均菌落数380380525218181010-3-35 5、2x102x104 42 252652620520532321010-3-3,10,10-4 (-4 (1 1、5656)2 2、6x106x105 53 3271271606012121010-2 2 (2 2、2 2)2 2、7x107x104 44 428428415215237371010-2-2,10,10-3-39 9、0 x100 x104 45 5262612125 51010-2-22 2、6x106x103 36 6无法计数5685683123121010-4-43 3、1x101x106 6 2 2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,应以两者比值决定。若其比值小于2 2,应报告两者的平均数;若大于等于2 2,则报告稀释度较小的菌落数。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g/g或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平均菌落数380380525218181010-3-35 5、2x102x104 42 252652620520532321010-3-3,10,10-4-42 2、6x106x105 53 3271271606012121010-2 22 2、7x107x104 44 428428415215237371010-2-2,10,10-3-39 9、0 x100 x104 45 5262612125 51010-2-22 2、6x106x103 36 6无法计数5685683123121010-4-43 3、1x101x106 63、若所有稀释度的平板菌落数均300,则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g/g或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平均菌落数380380525218181010-3-35 5、2x102x104 42 252652620520532321010-3-3,10,10-4-42 2、6x106x105 53 3271271606012121010-2 22 2、7x107x104 44 428428415215237371010-2-2,10,10-3-39 9、0 x100 x104 45 5262612125 51010-2-22 2、6x106x103 36 6无法计数5685683123121010-4-43 3、1x101x106 64、若所有稀释度平板菌落数均30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。5、若所有稀释度平板均无菌落生长,则应按300,有的又30,则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。(四)菌落计数报告方法1、菌落数在1100时,按四舍五入报告两位有效数字。2、菌落数100时,第三位数字按四舍五入计算,取前面两位有效数字,为了缩短数字后面的零数,也能够10的指数表示。3 3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。4 4、若空白对比上有菌落生长,则此次检测结果无效。5 5、称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。注意事项1、无菌操作操作中必须有“无菌操作”的概念,所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品假如有包装,应用75%75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。2 2、采样的代表性 如系固体样品,取样时不应集中一点,宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨,液体样品须经过振摇,以获得均匀稀释液。3 3、稀释液 样品稀释液主要是灭菌生理盐水,或磷酸盐缓冲液(或0、1蛋白胨水),),后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品(如酱油)进行稀释,能够采纳灭菌蒸馏水。4 4、每递增稀释一次即换用1 1支1ml1ml灭菌吸管。5 5、倾注用培养基应在4646水浴内保温,温度过高会影响细菌生长,过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴,应以皮肤感受较热而不烫为宜。6 6、倾注培养基的量规定不一,从121220ml20ml不等,一般以15ml15ml较为适宜,平板过厚可影响观察,太薄又易于干裂。倾注时,培基底部如有沉淀物,应将底部弃去,以免与菌落混淆而影响计数观察。7、为使菌落能在平板上均匀分布,检液加入平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min,以防止细菌有所死亡或繁殖。8、培养温度一般为37(水产品的培养温度,由于其生活环境水温较低,故多采纳30)。培养时间一般为48h,有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度,琼脂平板培养48h后,培养基失重不应超过15。9 9、为了幸免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆,不易分辨,可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板,不经培养,而于4 4环境中放置,以便计数时作对比观察。六、结果1、将实验测出的样品数据以表格的方式报告。2、对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。报告方式样品稀释液及菌落数选择稀释度报告(CFU/g,ml)10-210-310-4样品名称原始数据计算公式报告平均七、考虑1、什么是细菌菌落总数(cfu)？2、细菌菌落总数测定的卫生学意义是什么？3、倒培养基后,为什么要倒置培养？4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在461的温度？酱油(GB/T2717-2003):细菌菌落总数:30000CFU/mL大肠菌群:30MPN/100mL肠道致病菌:不得检出全脂奶粉、脱脂奶粉(GB5410-1999):特级一级二级细菌菌落总数:200003000050000(CFU/ml)大肠菌群409090(MPN/100g)肠道致病菌:不得检出不得检出不得检出巴氏杀菌乳(GB5408、1-1999)细菌菌落总数:30000CFU/mL大肠菌群:90MPN/100mL肠道致病菌:不得检出感谢您的聆听！