病理学技术课件

病理学技术进展病理学技术进展病理学技术进展1 病理学的发展经历了大体器官病理学，细胞病理学，超微病理学，免疫病理学和分子病理学的发展阶段，正在向信息病理学前进。国际著名病理学家Karl Lennert教授有句名言：“技术是病理学之母”。回顾过去病理学的重大发展，无一不是新技术的发明与应用的结果。正如程天民院士指出的那样：“病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮，缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决定着病理学的发展。”病理学的发展经历了大体器官病理学，细胞病理学，超微病2病理学技术包括传统病理学（Formalin固定，石蜡切片，HE染色）现代技术病理学（PCR,原位杂交，流式细胞仪，生物芯片等）病理学技术包括3传统病理学（一）人体病理学的诊断和研究方法1 尸体解剖检查尸检或称尸解是验证死者生前诊断的准确性与治疗效果，阐明死亡原因，探讨肿瘤的发生发展规律，从而促进肿瘤学发展的重要研究方法之一。2 活体组织检查即用局部切取、钳取、细针穿刺、搔刮和摘取等手术方法，从活体内获取病变组织进行病理诊断。3 细胞学检查通过采集病变处的细胞，涂片染色后进行诊断。传统病理学4（二）实验病理学研究方法1 动物实验 运用动物实验的方法，可在适宜动物身上复制出某些人类疾病的动物模型。通过疾病复制过程可以研究疾病的病因学、发病学、病理改变及疾病的转归。2组织和细胞培养将某种组织或单细胞用适宜的培养基在体外培养，可研究在各种因子作用下细胞、组织病变的发生和发展。（二）实验病理学研究方法5现代技术病理学组织化学（特殊染色）通过应用某些能与组织细胞化学特异性结合的显色试剂，定位地显示病变组织细胞的特殊化学成分（蛋白质、酶、核酸、糖、脂），同时又能保存原有的形态改变，达到形态与代谢的结合。特殊染色在病理诊断工作中的有其独特的作用，诸如鉴定特殊化学成分、协助肿瘤分类等方面。由于科学技术的不断发展，特殊染色的种类和方法也在不断提高和发展。尽管目前病理学新技术层出不穷，并已逐步开展与应用，但很多特殊染色方法如网状纤维染色、PAS/AB和脂肪染色等在病理诊断工作中仍发挥着重要的作用。现代技术病理学6免疫组织化学 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞种某种化学物质的一门技术。常用各类肿瘤的抗原标记物上皮源性肿瘤标记物 角蛋白（keratin）上皮膜抗原（EMA）癌胚抗原（CEA）桥粒蛋白（desmoplankin）前列腺特异性抗原（PSA）甲胎蛋白（AFP）病理学技术课件7间叶源性肿瘤标记物 波形蛋白（vimentin）结蛋白（desmin）肌红蛋白（myoglobin）肌动蛋白（myoactin）第八因子相关抗原（factor）溶菌酶（lysozyme）-抗胰蛋白酶 -抗糜蛋白酶神经源性肿瘤标记物（包括神经内分泌源性）胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）神经微丝（neurofilament）S-100蛋白神经元特异性烯醇化酶（NSE）嗜铬粒蛋白（Chr）突触素（Syn）间叶源性肿瘤标记物8内分泌肿瘤标记物 垂体激素 促肾上腺皮质激素（ACTH）生长激素（GH）泌乳素（LH）促甲状腺激素（TSH）甲状腺球蛋白降钙素 胰岛细胞相关激素及胃肠道激素 胰岛素、胃泌素生长抑素等 血清素（serotonin）睾丸酮 人类绒毛膜促性腺激素（hCG）淋巴、造血系统肿瘤标记物白细胞共同抗原（LCA）B细胞（CD19，CD20）T细胞（CD45RO，UCHL-1）CD15CD30链链内分泌肿瘤标记物9细胞外基质抗原 胶原蛋白（collagen）层粘连蛋白（laminin LN）纤维连接蛋白（FN）细胞外基质抗原10免疫组织化学的作用及其意义对“未分化”恶性肿瘤的分类决定转移瘤的原发部位对不同器官与组织交界处肿瘤进一步分类对恶性间皮瘤的鉴别对白血病和淋巴瘤分类有助于发现微小转移灶与治疗和预后有关的免疫组化标记物免疫组化的局限性免疫组织化学的作用及其意义11电子显微镜技术亚细胞结构病理学，超微结构病理学 电镜技术的应用领域很宽，在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的研究和观察，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点。在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球肾炎及肌病的诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定，如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断与鉴别诊断；最早关于细胞调亡的形态学描述也是源于电镜的观察。随着电镜技术的不断发展，以及与其它方法的综合使用，还出现了免疫电镜、电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术及全息显微技术等新技术的应用。电子显微镜技术12肿瘤组织新生血管的扫描电镜观察箭头指向新生的血管内皮细胞肿瘤组织新生血管的扫描电镜观察13组织计量学与图像分析组织计量学（histometry）是用以测量组织的面积及各种组分如细胞核、细胞浆、血管、纤维组织、骨组织、骨组织形态比例的方法。形态计量学（morphometry）含义较广，包括平面测量学和体视学。体视学（stereology）是应用几何学等数学方法通过二维平面计算出细胞或组织立体性质三维结构的方法，又称立体计量学。传统的组织计量学是应用组织细胞的照片、投影图像，或用目镜标线直接测量特定面积中某组织或有形结构的面积、比例等，可以统称为图像分析（imageanaysis）组织计量学与图像分析14聚合酶链反应 聚合酶链反应，又称无细胞克隆技术，最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的，他因此荣获了1993年度诺贝尔化学奖。原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反应技术的一部分，后者是在体外酶促反应将某一特定DNA序列进行高效、快速扩增，它可将单一拷贝的待测核酸以指数的形式扩增而达到常规方法可检测的水平，但不能进行组织学定位。原位PCR技术是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸的技术。聚合酶链反应15原位分子杂交 原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项新技术，也称杂交组织化学、细胞杂交或原位杂交组织化学。其原理是，含有互补顺序的标记DNA、RNA片断，即探针，在适宜的条件下与细胞内的DNA、RNA形成稳定的杂交体。原位分子杂交16荧光原位杂交 近年来FISH所应用的探针种类不断增多，使该技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤研究。适用于FISH的标本可以是分裂期的细胞染色体、间期细胞，后者可以是冰冻切片、石蜡切片、细胞滴片或印片。FISH原理十分简单，就是用标记的荧光单链DNA（探针）与其互补的DNA（玻片上的标本）退火杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。荧光原位杂交17在FISH的基础又建立了比较基因组杂交技术（comparative genomic hybridization CGH），即将消减杂交与FISH相结合，用于检测两个（或多个）基因组间相对的DNA拷贝数变化，（如扩增、增益（gains）、复制和丢失等），并将这些异常定位于染色体上，因此称之为DNA拷贝数核型（DNA copy number karayotype）技术。对肿瘤病理研究主要有以下几个方面：（1）肿瘤染色体区DNA增益与丢失，所有肿瘤的丢失程度明显高于增益。（2）明确DNA增益和丢失的靶基因、CGA可以准确定位肿瘤基因，特别是发生在DNA增益的染色体位点。（3）应用CGH对肿瘤分期与分级进行有益的补充。（4）CGH有利于肿瘤诊断与鉴别诊断在FISH的基础又建立了比较基因组杂交技术（comparat18显微切割技术显微切割技术是90年代初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如PCR,PCR-SSCP及比较基因组杂交等。它尤其适用于肿瘤的分子生物学研究，如肿瘤的克隆性分析，肿瘤发生和演进过程中各阶段细胞基因改变的比较研究和肿瘤细胞内某些酶活性的定量检测等。方法：手工操作法激光捕获显微切割显微切割技术19左图：被切割细胞的定位右图：切割后组织切片上留下的空隙左图：被切割细胞的定位20流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry）是一种对细胞进行自动分析和分选的装置。其原理是将特殊处理的细胞悬液经过一细管，同时用特殊光线照射，当细胞通过时光线发生不同角度的散射，经检测器变为电讯号，再经过电子计算机分析处理绘出曲线或直方图等。流式细胞术21病理学技术课件22生物芯片技术生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的本质是进行生物信号的平行分析，它利用微点阵技术将成千上万的生物信息密码集中到一小片固相基质上，从而使一些传统的生物学分析手段能够在尽量小的空间范围内，以尽量快的速度完成。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。生物芯片技术23 按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。按照所检测的生物信号种类分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整的活细胞。按工作原理分类，有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生24基因芯片在肿瘤病理基因分类中有潜在作用，目前仍没有一种共同的方法来进行癌的新分类（“发现性分类”class discovery），或者将某个肿瘤划分到已知的分类中去（“预测性分类”class prediction）。在肿瘤研究中，通过用表达谱芯片对来源于不同个体（患者）不同组织、不同细胞周期、不同分化阶段、不同刺激（不同治疗阶段）的肿瘤细胞内的mRNA或逆转录后产物的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，从而对其表达的个体特异性、组织特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析与判断，发现某个或几个基因与肿瘤的关系。同时研究基因与基因之间的相互作用，对肿瘤个体可以研究肿瘤组织和正常组织基因表达在mRNA水平上的差异。基因芯片基因芯片在肿瘤病理基因分类中有潜在作用，目前仍没有一种共同的25一、基因分析芯片开发的动力一、基因分析芯片开发的动力遗传信息迅猛增长遗传信息迅猛增长 随着人类基因组（测序）计划（随着人类基因组（测序）计划（Human genome projectHuman genome project）的）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。快速的检测、分析就显得格外重要了。一、基因分析芯片开发的动力26相关学科与技术的高度发展和相互渗透 当代与信息产业相伴随的计算机、精密机械等科学技术是大规模解析基因信息的基础，而基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。相关学科与技术的高度发展和相互渗透27科学的发展人类的进步要求进行大规模基因信息的解析 鉴于基因芯片的多种用途和其远大的发展前景，不少生命科学研究机构和生物技术公司都先后参与了这项技术的研究。据不完全统计目前仅国内就有十多家单位从事该技术的研究与开发工作，全世界估计至少有二三十家。它已象半导体技术一样成为一个重要的产业方向。当前已正被广泛地应用于诸多领域，包括生物医学、临床诊断学和基因组学研究。科学的发展人类的进步要求进行大规模基因信息的解析28二、基因分析芯片的简要描述 1.什么是基因芯片 基因芯片指对数以千记的DNA片段同时进行处理分析的技术，诸如基因组DNA突变谱和mRNA表达谱的检测等（Trends in Biotechnology)。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。二、基因分析芯片的简要描述292.基因芯片技术的主要特点 技术操作简单 自动化程高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本相对低2.基因芯片技术的主要特点303 基因芯片的主要类型 鉴于信号的获取与解读具有通用性，所以此处不予特别介绍。从点阵的制备方法来分主要有两类：原位合成型与“点膜”型。原位合成型 指根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。聚合之后芯片片基的制作即告结束。该方法有两类：光引导原位聚合技术与压电打印原位聚合技术。3 基因芯片的主要类型31 光引导原位聚合技术的简要过程为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取择适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。优点：合成效率高，点阵密度高 缺点：设备昂贵，技术复杂，反应产率低 光引导原位聚合技术的简要过程为：首先使支持物32病理学技术课件33 压电打印原位聚合技术其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。即，将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探针。优点：设备廉价，技术相对简单，反应产率高 缺点：点阵密度低，易产生交叉污染 压电打印原位聚合技术其装置与普通的彩色喷墨打34“点膜”型 合成工作用传统的DNA固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷，以便能够牢固地结合寡核苷酸分子。该方法是目前大多数中小型公司所采用的方法。优点：设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活性高 缺点：点阵密度低“点膜”型35从支持物来分主要有：薄膜型如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。这种类型“芯片”的点阵是通过“点膜”形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如CloneTech公司）。玻片型这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。当前具有此类产品研制能力的公司很少（如Affimetrix公司）。从支持物来分主要有：36 微板型这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量测 试 孔 的 小 型 酶 联 免 疫 检 测 板（如 P E公 司 等）。37 集成电路型 将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）集成电路型 将杂交技术与微电子技术结合于一384.基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定检测样品 的制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析4.基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定基因组序列分析与39三、基因芯片的主要应用1 基因表达检测 拟南芥、酵母基因表达研究等2 突变检测 BRCA基因外显子11、CFTR基因、-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等3 基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等4 基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图 三、基因芯片的主要应用405 杂交测序6 Etc.5 杂交测序41蛋白质芯片又称蛋白质微点阵，它是继基因芯片之后发展起来的对基因功能产物表达水平检测的技术。蛋白质芯片也是在一个载体上点布高密度不同种类的蛋白质，再用荧光标记的已知抗体或配体与待测样本中的抗体或配体一起同芯片上蛋白质竞争结合，在扫描仪上读出荧光强弱，再经计算机分析计算出待测样本结果。可适合于蛋白表达的大规模，多种类筛查，并能用于受体配体，多种感染因促的筛查和肿瘤的诊断。蛋白质芯片又称蛋白质微点阵，它是继基因芯片之后发展起来的对基42组织芯片制备技术是适应组织学研究的需要而产生的。它将基因、蛋白水平的研究与组织形态学特征相结合，使应用同一实验指标同时快速研究大量不同组织样本的设想成为现实，减少了实验误差，同时可以上百倍地提高病理组织学研究的效率、节约实验材料和试剂，对于原始病理资料的保存和大样本的回顾性研究具有重大的意义。组织芯片制备技术是适应组织学研究的需要而产生的。它将基因、蛋43激光扫描共焦显微细胞仪 激光扫描共焦显微细胞仪，又称黏附细胞分析及筛选激光细胞仪。他是对黏附的活细胞，用荧光染料进行特定标记后，借助荧光定量方法，运用激光和计算机技术，对活细胞内物质含量及其变化规律进行准确定量、细胞筛选、细胞手术和三维结构重建等项分析。可使黏附细胞的荧光作定量、定位、定性及定时分析，并进一步对黏附细胞进行分选及各种激光显微操作，在病理学研究中具有广泛的应用前景。激光扫描共焦显微细胞仪44激光扫描共聚焦显微技术的主要功能1细胞，组织光学切片2三维图像重建3对活细胞的长时间观察4细胞内酸碱度及细胞离子的定量测定5荧光漂白恢复技术6细胞间通讯的研究7细胞膜流动性测定和光活化技术等功能激光扫描共聚焦显微技术的主要功能45体外培养的人骨髓间充质干细胞左上图为抗PCNA-FITC的免疫荧光染色；右上图为抗flk-1-TexasRed的免疫荧光染色；下图为合成图体外培养的人骨髓间充质干细胞46转染pcDNA3-GFP的B16细胞左侧荧光图像，右侧DIC图像转染pcDNA3-GFP的B16细胞47荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。一、实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR481.Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。1.Ct 值的定义492.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10SDcycle6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系1，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。2.荧光域值（threshold）的设定504.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。4.荧光化学51病理学技术课件522）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧53二内标在传统定量中的意义1几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。二内标在传统定量中的意义543）PCRELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCRELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。3）PCRELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增552内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。2内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即P56三内标对荧光定量PCR的影响1实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。三内标对荧光定量PCR的影响572内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。2内标对实时荧光定量PCR的影响58综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今59谢谢大家60