蛋白质的表达课件

Expression of proteinXuexi YangExpressionofproteinXuexiYan人工合成尿素人工合成尿素n n自然界的矿物等无机物千年万年，亘古不变，自然界的矿物等无机物千年万年，亘古不变，是没有生命的；而有机物不同，是有生命的。是没有生命的；而有机物不同，是有生命的。n n无机物无机物-有机物（生命）有机物（生命）n n动植物体内存在着一种生命力，只有依靠这种动植物体内存在着一种生命力，只有依靠这种生命力，才能产生出有机化合物，即有机物只生命力，才能产生出有机化合物，即有机物只能在有生命能在有生命生物生物体内产生。体内产生。n n化学家在实验室只能将有机物转化为新的有机化学家在实验室只能将有机物转化为新的有机物，而不能用无机物制造出有机物。物，而不能用无机物制造出有机物。2NH4Cl+AgCNONH4CNO+AgClNH4CNO（热）（NH2）2CO有机化学第一人有机化学第一人有机化学第一人有机化学第一人-维勒（维勒（维勒（维勒（1800-18821800-1882）人工合成尿素自然界的矿物等无机物千年万年，亘古不变，是没有生蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成胰岛素有生物活性的蛋白质蛋白质的生物合成胰岛素有生物活性的蛋白质InvitroInvitroInvitroInvitro：invitroproteinsynthesisinvitroproteinsynthesisinvitroproteinsynthesisinvitroproteinsynthesissystemsystemsystemsystemProkaryoticExpressionSystemProkaryoticExpressionSystemProkaryoticExpressionSystemProkaryoticExpressionSystem-E.E.coli,B.subtiliscoli,B.subtilis InvivoInvivoInvivoInvivoyeastyeastEukaryoticEukaryoticEukaryoticEukaryotic ExpressionSystemExpressionSystemExpressionSystemExpressionSystem insectcellsinsectcells mammaliancellsmammaliancells.ExpressionsystemInvitro：invitroprotein香蕉与奶牛香蕉与奶牛香蕉与奶牛.ProkaryoticExpressionSystemn nEscherichia.coli,becauseofthewealthofknowledgeregardingitsbiochemistryandgeneticscanbeconsideredagoodfirstchoiceforthepreparationofproteins.n nHowever,E.colimightnotyieldproteinsuitableforanalysis,thenothersystemsmustbeexamined.ProkaryoticExpressionSyst1.1.基因表达在原核生物与真核生物中的差别基因表达在原核生物与真核生物中的差别？n n原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。n n在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与因与因与因与RNARNARNARNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNAmRNAmRNAmRNA，与此同时，与此同时，与此同时，与此同时，mRNAmRNAmRNAmRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之完成，随之完成，随之完成，随之mRNAmRNAmRNAmRNA也被水解掉。也被水解掉。也被水解掉。也被水解掉。n n在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNAhnRNAhnRNAhnRNA，再加，再加，再加，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰工去掉内含子，外显子相连接，并修饰工去掉内含子，外显子相连接，并修饰工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5555和和和和3333末端后才形成末端后才形成末端后才形成末端后才形成mRNAmRNAmRNAmRNA。而。而。而。而mRNAmRNAmRNAmRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。化、形成高级结构。化、形成高级结构。化、形成高级结构。1.基因表达在原核生物与真核生物中的差别？原核生物表达系统和2.2.2.2.真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法 将将将将真真真真核核核核基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到1 1个个个个强强强强大大大大的的的的原原原原核核核核promotorpromotor和和和和SDSDs s的的的的下下下下游游游游,使使使使真真真真核核核核基基基基因因因因处处处处于于于于原原原原核核核核启启启启动动动动子子子子的的的的控控控控制制制制之之之之下下下下,转转转转录录录录物物物物由由由由于于于于原原原原核核核核SDSDs s能能能能与与与与核核核核糖糖糖糖体体体体rRNArRNA结结结结合合合合,可可可可在在在在原原原原核核核核表表表表达达达达.这这这这是是是是克克克克服服服服1,21,2困困困困难的好办法难的好办法难的好办法难的好办法.从从从从真真真真核核核核分分分分离离离离出出出出mRNAmRNA并并并并逆逆逆逆转转转转录录录录成成成成cDNA,cDNAcDNA,cDNA有有有有完完完完整整整整的的的的编编编编码码码码顺顺顺顺序序序序,但无内含子但无内含子但无内含子但无内含子是是是是采采采采用用用用伪伪伪伪装装装装办办办办法法法法将将将将真真真真核核核核基基基基因因因因插插插插到到到到原原原原核核核核基基基基因因因因某某某某密密密密码码码码之之之之后后后后,其其其其翻翻翻翻译译译译产产产产物物物物N N端端端端有有有有原原原原核核核核多多多多肽肽肽肽,这这这这样样样样表表表表达达达达的的的的融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白,可可可可躲躲躲躲避避避避细细细细菌菌菌菌蛋白酶降解作用蛋白酶降解作用蛋白酶降解作用蛋白酶降解作用.1.1.细细细细菌菌菌菌RNApolRNApol不不不不能能能能识识识识别别别别真真真真核核核核的的的的promotor,promotor,故故故故真真真真核核核核基基基基因因因因不不不不能能能能被被被被该该该该酶转录酶转录酶转录酶转录.2.2.从从从从真真真真核核核核转转转转录录录录的的的的mRNAmRNA缺缺缺缺乏乏乏乏SDSD序序序序列列列列,不不不不 能能能能 结结结结 合合合合 到到到到 细细细细 菌菌菌菌 核核核核 糖糖糖糖 体体体体rRNA,rRNA,因因因因此此此此不不不不能能能能被被被被翻翻翻翻译译译译成成成成蛋蛋蛋蛋白白白白.3.3.真真真真核核核核基基基基因因因因有有有有内内内内含含含含子子子子,而而而而原原原原核核核核细细细细胞胞胞胞缺缺缺缺乏乏乏乏真真真真核核核核细细细细胞胞胞胞转转转转录录录录后后后后加加加加工工工工系系系系统统统统,成成成成熟熟熟熟的的的的mRNAmRNA不不不不能能能能形形形形成成成成,不不不不能能能能表达真核蛋白表达真核蛋白表达真核蛋白表达真核蛋白;4.4.表表表表达达达达的的的的真真真真核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白在在在在原原原原核核核核细细细细胞胞胞胞中中中中不稳定不稳定不稳定不稳定,易被细菌蛋白酶降解易被细菌蛋白酶降解易被细菌蛋白酶降解易被细菌蛋白酶降解.2.真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法将真核3.3.大肠杆菌表达载体的组件大肠杆菌表达载体的组件n n复制起始点复制起始点复制起始点复制起始点 originofreplicationoriginofreplicationn n选择性基因选择性基因选择性基因选择性基因 selectionmarkerselectionmarkern n多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点 MCSMCSn n启动子启动子启动子启动子 promoterpromoterpromoterpromotern n终止子终止子终止子终止子 terminatorterminatorterminatorterminatorn n核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点 ribosomebindingsiteribosomebindingsiteribosomebindingsiteribosomebindingsite3.大肠杆菌表达载体的组件复制起始点originofrProkaryoticExpressionSystemProkaryoticExpressionSystem复制起始点n n保证载体可以正确复制和增殖n npBR322pBR322和和pUCpUC的复制起点，它们皆来源于的复制起点，它们皆来源于ColE1ColE1质粒质粒 n n质粒具有不相容性质粒具有不相容性 n n通常表达载体都会选用高拷贝的复制子通常表达载体都会选用高拷贝的复制子 复制起始点保证载体可以正确复制和增殖选择性基因n n至少有一个选择性基因，可用于转化体的确定，并可在培养过程中保持质粒的稳定性。n nLBLB倒板前加抗生素的温度倒板前加抗生素的温度 n n超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢功劳呢 选择性基因至少有一个选择性基因，可用于转化体的确定，并可在培多克隆位点多克隆位点 n n具有单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因的插入多克隆位点具有单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因的插入3.1启动子n n启动子启动子(promoter,(promoter,PP)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。n n-10-10-10-10区区区区（pribnowboxpribnowbox）和）和 -35-35-35-35区组成区组成区组成区组成n n分类n n转录形式转录形式n n组成型组成型n n诱导型诱导型n n强弱强弱n n取决于取决于-35-35区和区和-10-10区的碱基组成及其间隔序列。区的碱基组成及其间隔序列。3.1启动子启动子(promoter,P)是指能被RNA聚P tac=3P trp=11P lac启动子-35区序列-10区序列 P lacTTTACATATAAT P trp TTGACATTAACT P tacTTGACATATAAT启动子Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP负调节因子 lac IIPTG诱导启动子-LacLac表达系统以大肠杆菌lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统IPTG诱导启动子-LacLac表达系统 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平转录Lac表达系统正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与35、10序列的结合，进而促进Plac 介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPlacIPlacLac表达系统 lac UV5突变体 Plac UV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac 更易操作。Lac表达系统Lac表达系统 负调节因子 lac I在无诱导物情形下，lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNALac表达系统lacIP转录调控机理色氨酸启动子Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达IAA诱导启动子-TrpTrp表达系统以大肠杆菌trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统IAA诱导启动子-TrpTrp表达系统Trp表达系统 Ptrp OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA Ptrp Otrp去除色氨酸高效转录mRNA Ptrp Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶Trp表达系统Tac表达系统 tac 启动子是由 trp 的35序列和 lacUV5 的10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5 相似，但mRNA转录水平更高于trp 和lacUV5 启动子（P tac=3P trp=11P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac 启动子比用lacUV5 启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列 P lacTTTACATATAAT P trp TTGACATTAACT P tacTTGACATATAAT杂合启动子-TacTac表达系统启动子-35区序列-10区序列PL和PR 表达系统以l 噬菌体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统 在野生型l 噬菌体中，PL、PR 启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。温度诱导启动子-PL和PRPL和PR表达系统温度诱导启动子-PL和PRPL和PR 表达系统转录调控的机理由 l 噬菌体PE启动子控制的cI 基因的产物是PL、PR 启动子转录的阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL、PR 表达系统都选用温度敏感突变体cI 857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度（30）时以活性形式存在在较高温度（42）时失活脱落PL和PR表达系统T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。最常用启动子-T7T7表达系统最常用启动子-T7T7表达系统T7噬菌体编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。T7表达系统T7表达系统转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。T7RNA聚合酶T7启动子目的基因T7RNA聚合酶基因？启动子T7表达系统T7RNAT7启动子T7表达系统转录调控的机理化学诱导型噬菌体DE3是 l 噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其 int 基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。T7RNA聚合酶基因 lac启动子E.Coli（DE3）T7启动子目的基因T7RNA聚合酶IPTG诱导T7表达系统T7RNA聚合酶基因lac启动T7表达系统转录调控的机理温度诱导型 PL启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。T7RNA聚合酶基因 PL启动子E.Coli（CE6）T7启动子目的基因T7RNA聚合酶热诱导cI857T7表达系统T7RNA聚合酶基因PL启动子T7表达系统转录调控的机理 双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7RNA聚合酶热诱导T7启动子目的基因T7RNA聚合酶基因 PL启动子 cI857p15AoriKanRColE1oriAmpRT7表达系统T7RNA热诱导T7启动子3.2TheTerminator3.2TheTerminatorn n StopsRNAsynthesisatspecificpointsStopsRNAsynthesisatspecificpointsalongtheDNAtemplatealongtheDNAtemplaten n TheenzymestopspolymerisingnucleotidesTheenzymestopspolymerisingnucleotidesintoRNA,releasestheRNAchainandleavesintoRNA,releasestheRNAchainandleavestheDNAtoeventuallyreinitiateatanothertheDNAtoeventuallyreinitiateatanotherpromoter.promoter.n n Features:Features:-AdyadsymmetryintheDNA,centered15to20AdyadsymmetryintheDNA,centered15to20nucleotidesbeforetheendoftheRNAthisnucleotidesbeforetheendoftheRNAthisleadstoatranscriptthatcanformanhairpinleadstoatranscriptthatcanformanhairpinlooploop-RunofaboutsixAsintheDNAtemplatewhichRunofaboutsixAsintheDNAtemplatewhicharetranscribedintoUsattheendoftheRNAaretranscribedintoUsattheendoftheRNA3.2TheTerminatorStopsRNAHowcouldthesetwostructuralHowcouldthesetwostructuralfeaturescausetermination?featurescausetermination?Howcouldthesetwostructural强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子强化转录终止的必要性终止子强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2 以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子强终止子的选择与使用终止子核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）3.3核糖体结合位点核糖体结合位点3.3核糖体结合位点核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的68个核苷酸序列5UAAGGAGG3即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3端区域3AUUCCUCC5并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5端若干密码子的碱基序列核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点4.4.常见原核表达系统常见原核表达系统n n面面俱到面面俱到NovagenNovagenn n因为纯化爱上你因为纯化爱上你-GEGE（原安玛西亚）（原安玛西亚）n n更快克隆更快克隆InvitrogenInvitrogen4.常见原核表达系统面面俱到Novagen面面俱到面面俱到Novagen 面面俱到Novagen面面俱到面面俱到NovagenNovagenn n是否要用基因本身的起始密码子进行选择是否要用基因本身的起始密码子进行选择 n n是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体 n n你希望用蓝白斑筛选可以使用你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBluepETBlue系列载体系列载体 n n除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式式n nNovagenNovagen提供提供菌株种类菌株种类多种菌株多种菌株:BL21,Rosetta,Origami:BL21,Rosetta,Origamin n除了常用培养基除了常用培养基LBLB、TBTB、M9M9、M9ZBM9ZB等：可以直接进行过等：可以直接进行过夜培养培养基夜培养培养基OvernightExpressOvernightExpressAutoinductionAutoinductionSystemSystemn nNovagenNovagen还有表达双外源蛋白的载体还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1DNApCDFDuet-1DNA、pETDuetpETDuet-1DNA-1DNA、pRSFDuet-1DNApRSFDuet-1DNA：最多可以同时表达：最多可以同时表达8 8个外源蛋白个外源蛋白 n n有许多不同系列的载体、菌株供选择；与原核表达的各种有许多不同系列的载体、菌株供选择；与原核表达的各种相关产品都一应俱全相关产品都一应俱全：载体、菌株、培养基、检测表达的：载体、菌株、培养基、检测表达的抗体、纯化产品抗体、纯化产品 面面俱到Novagen是否要用基因本身的起始密码子进行选择抗性和标签抗性和标签抗性和标签n nBL21BL21BL21BL21:lonlon,ompTompT n nBL21(DE3):T7BL21(DE3):T7polymerasepolymerasen nRosetta:Rosetta:Rosetta:Rosetta:optimalcodonsoptimalcodonsn nOrigamiOrigamiOrigamiOrigami:thioredoxinreductase(trxB),:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)glutathionereductase(gor)n nRosetta-gamiRosetta-gamiRosetta-gamiRosetta-gami n nOrigamiB:OrigamiB:OrigamiB:OrigamiB:(IPTGconcentrationdependent)(IPTGconcentrationdependent)菌株种类菌株种类BL21:lon,ompT菌株种类菌株种类菌株种类n n蛋白酶缺陷型蛋白酶缺陷型都是都是lonlon蛋白酶和蛋白酶和ompTompT蛋白酶缺陷型，这包括有蛋白酶缺陷型，这包括有BL21,OrigamiBL21,Origami,Rosetta,Rosetta。可以保。可以保持蛋白的稳定不被降解。持蛋白的稳定不被降解。n n保证所有细胞以同样量进行表达保证所有细胞以同样量进行表达OrigamiOrigamiBB和和RosettaRosetta这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。蛋白这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。蛋白表达浓度可以随着表达浓度可以随着IPTGIPTG浓度而改变。通过对浓度而改变。通过对IPTGIPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。者大量表达。n n 二硫键形成与溶解性增强二硫键形成与溶解性增强NovagenNovagen专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gorgor）和）和/或硫氧还蛋白还原酶或硫氧还蛋白还原酶（trxBtrxB）缺陷型的，包括）缺陷型的，包括BL21trxBBL21trxB，OrigamiOrigami，OrigamiBOrigamiB和和Rosetta-gamiRosetta-gami。可以更。可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。n n稀有密码子的补给稀有密码子的补给RosettaRosetta是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNAtRNA。n n硒蛋氨酸标记硒蛋氨酸标记B834B834是来源于是来源于BL21BL21的蛋氨酸（的蛋氨酸（metmet）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性35S-met35S-met标标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。菌株种类蛋白酶缺陷型都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型因为纯化爱上你因为纯化爱上你:GE:GE（原安玛西亚）（原安玛西亚）n n作为蛋白纯化的专家作为蛋白纯化的专家,GE,GE的原核表达系统以便于产的原核表达系统以便于产物纯化而见长。融合表达系统的物纯化而见长。融合表达系统的pGEXpGEX是我们极为是我们极为熟悉的熟悉的GSTGST亲和纯化表达系统亲和纯化表达系统,其表达产物纯化体其表达产物纯化体系已经非常成熟。系已经非常成熟。n n选择表达系统的时选择表达系统的时，表达后的纯化方法是必需考，表达后的纯化方法是必需考虑的非常重要的问题。虑的非常重要的问题。因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）作为蛋白纯化的专家,GE因为纯化爱上你因为纯化爱上你:GE:GE（原安玛西亚）（原安玛西亚）n n通用电气医疗集团(GEHealthcare)n n安玛西亚：ECL，Sepharose、Sephadex因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）通用电气医疗集团(GEH因为纯化爱上你因为纯化爱上你:GE:GE（原安玛西亚）（原安玛西亚）因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）因为纯化爱上你因为纯化爱上你:GE:GE（原安玛西亚）（原安玛西亚）n nGST是一个高度可溶的蛋白，可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到一种促进表达量提高的作用。n n对于表达分子量小的目标蛋白来说选择GST就比6xHistag更有优势n nGST纯化填料的专一性则非常高因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）GST是一个高度可溶的蛋白因为纯化爱上你因为纯化爱上你:GE:GE（原安玛西亚）（原安玛西亚）n nGSTGST系列总共有系列总共有1313个载体。有个载体。有9 9个的多克隆位点是扩展过的，个的多克隆位点是扩展过的，有有6 6个限制性酶切位点。个限制性酶切位点。n n载体上都有将载体上都有将GSTGST切割下来的蛋白酶识别位点，可以分成切割下来的蛋白酶识别位点，可以分成T T系列、系列、X X系列和系列和P P系列，分别采用凝血酶系列，分别采用凝血酶ThrombinThrombin、XaXa因子因子蛋白酶以及蛋白酶以及GEGE的的PreScissionPreScission蛋白酶。蛋白酶。n npGEXpGEX所有载体都提供了三种不同的翻译读码框选择；都所有载体都提供了三种不同的翻译读码框选择；都是利用乳糖操纵子调控模式，启动子都是是利用乳糖操纵子调控模式，启动子都是PtacPtac。因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）GST系列总共有13个载体因为纯化爱上你因为纯化爱上你:GE:GE（原安玛西亚）（原安玛西亚）n n在表达后的检测和纯化方面，在表达后的检测和纯化方面，GEGE医疗的产品堪称医疗的产品堪称经典经典：WesternBlotWesternBlot检测表达，纯化亲和层析柱，检测表达，纯化亲和层析柱，即使即使GEGE医疗没有医疗没有66组氨酸标记的载体，但是组氨酸标记的载体，但是66组氨酸亲和纯化相关产品却绝对出色组氨酸亲和纯化相关产品却绝对出色 n n纯化是表达后绝对不可小视的一步。所以，纯化是表达后绝对不可小视的一步。所以，“因因为纯化爱上你为纯化爱上你”，就是选择，就是选择pGEXpGEX的最好理由吧！的最好理由吧！因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）在表达后的检测和纯化方面，更快克隆Invitrogenn nInvitrogenInvitrogen是是TATA克隆的创始者克隆的创始者n n定向定向TOPOTOPO克隆完全不需要酶切和传统连接反应，五分钟就克隆完全不需要酶切和传统连接反应，五分钟就可以做出一个克隆。可以做出一个克隆。n n其他载体主要用传统的酶切、链接方式做重组质粒，其他载体主要用传统的酶切、链接方式做重组质粒，InvitrogenInvitrogen的表达系统大量运用的表达系统大量运用TOPOTOPO技术和技术和GatewayGateway技术技术n nInvitrogenInvitrogen有四个原核表达系统：有四个原核表达系统：ChampionChampionpETpETExpressionSystemExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystemHisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystempBADInducibleBacterialSystem、pLSystempLSystem和和T7-T7-basedSystemsbasedSystems。几乎囊括所有启动子。几乎囊括所有启动子。更快克隆InvitrogenInvitrogen是TA克隆的5.5.表达前的分析比什么都重要表达前的分析比什么都重要 1.1.翻译起始位点2.2.GC含量3.3.二级结构4.4.基因或者蛋白的大小5.5.亲疏水性成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。5.表达前的分析比什么都重要翻译起始位点成功的实验都是一样6.6.避免外源基因表达蛋白降解的对策避免外源基因表达蛋白降解的对策 n n构建融合蛋白表达系统n n构建分泌蛋白表达系统n n构建包涵体表达系统n n选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统6.避免外源基因表达蛋白降解的对策构建融合蛋白表达系统7.7.大肠杆菌表达研究四重境界大肠杆菌表达研究四重境界 n n初次尝试扫盲篇n n乱棍打枣入门篇n n系统优化中级篇n n自成一体高手篇7.大肠杆菌表达研究四重境界初次尝试扫盲篇Eukaryotic ExpressionSystemn n1.YeastExpressionSystems1.YeastExpressionSystems1.YeastExpressionSystems1.YeastExpressionSystemsn n2.BaculovirusExpressionSystems2.BaculovirusExpressionSystems2.BaculovirusExpressionSystems2.BaculovirusExpressionSystemsn n3.AnimalcellsExpressionSystems3.AnimalcellsExpressionSystems3.AnimalcellsExpressionSystems3.AnimalcellsExpressionSystemsEukaryoticExpressionSystem1.1.酵母表达系统酵母表达系统n n酵母表达系统既具有原核表达系统操作简易、易于培养、酵母表达系统既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核表达生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点。系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点。n n最先被研究和应用的是酿酒酵母体系，但酿酒酵母系统由最先被研究和应用的是酿酒酵母体系，但酿酒酵母系统由于缺乏强有力的启动子、分泌效率差、表达质粒易于丢失于缺乏强有力的启动子、分泌效率差、表达质粒易于丢失等缺点，逐渐被甲醇酵母表达系统代替，其中毕赤酵母应等缺点，逐渐被甲醇酵母表达系统代替，其中毕赤酵母应用最为广泛。用最为广泛。1.酵母表达系统酵母表达系统既具有原核表达系统操作简易、易于1.11.1毕赤酵母表达系统的特点毕赤酵母表达系统的特点n n优点：n n1 1）含有强有力的）含有强有力的AOXAOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；醇可严格地调控外源基因的表达；n n2 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。n n3 3）发酵工艺成熟。已经有大规模工业化高密度生产）发酵工艺成熟。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺的发酵工艺 1.1毕赤酵母表达系统的特点优点：1.11.1毕赤酵母表达系统的特点毕赤酵母表达系统的特点n n缺点：缺点：n n利用易燃的甲醇做原料，表达产物的卫生安全利用易燃的甲醇做原料，表达产物的卫生安全性需要考虑性需要考虑n n筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限n n信号肽加工不完全，修饰功能欠完善以及内部信号肽加工不完全，修饰功能欠完善以及内部降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来了困难。了困难。1.1毕赤酵母表达系统的特点缺点：1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母（甲醇酵母（甲醇酵母（甲醇酵母（甲醇酵母（甲醇酵母（methylotrophic yeast)methylotrophic yeast)methylotrophic yeast)指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（毕赤酵母（毕赤酵母（毕赤酵母（毕赤酵母（毕赤酵母（Pichia pastorisPichia pastorisPichia pastoris)汉森酵母（汉森酵母（汉森酵母（汉森酵母（汉森酵母（汉森酵母（Hansenula ploymorphaHansenula ploymorphaHansenula ploymorpha)假丝酵母（假丝酵母（假丝酵母（假丝酵母（假丝酵母（假丝酵母（Candia boidiniiCandia boidiniiCandia boidinii)1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母（methylotr1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子A A A、目前已发现的、最强的真核启动子、目前已发现的、最强的真核启动子、目前已发现的、最强的真核启动子、目前已发现的、最强的真核启动子、目前已发现的、最强的真核启动子、目前已发现的、最强的真核启动子B B B、严谨调控型启动子、严谨调控型启动子、严谨调控型启动子、严谨调控型启动子、严谨调控型启动子、严谨调控型启动子 AOX1 AOX1 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX MOX MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导 1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子1.3毕赤酵母表达系统模式载体1.3毕赤酵母表达系统模式载体1.41.4选择标记选择标记n n营养缺陷型选择标记n nHis4His4、Ura3Ura3、Leu2Leu2n n抗性选择标记n nG418G418、AmpAmp1.4选择标记营养缺陷型选择标记2.2.杆状病毒表达系统杆状病毒表达系统n n杆状病毒只来源于无脊椎动物。杆状病毒只来源于无脊椎动物。n n基因组为单一闭合环状双链基因组为单一闭合环状双链DNADNA分子，大小为分子，大小为8080160kb160kb，其基，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。因组可在昆虫细胞核复制和转录。n n用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒毒毒毒 n n多角体基因缺失后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着多角体基因缺失后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。重组病毒不需要辅助病毒的功能。2.杆状病毒表达系统杆状病毒只来源于无脊椎动物。杆状病毒表达系统的原理杆状病毒表达系统的原理n nNPVNPV基因组巨大，不适于体外操作，需构建一个能与基因组巨大，不适于体外操作，需构建一个能与NPVNPV基因组基因组DNADNA重重组的转移载体质粒。组的转移载体质粒。n n转移质粒载体上含有多角体蛋白基因的启动子及多角体蛋白基因的旁转移质粒载体上含有多角体蛋白基因的启动子及多角体蛋白基因的旁侧序列。侧序列。n n将目的基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多将目的基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多角体基因启动子的控制之下。角体基因启动子的控制之下。n n重组转移载体与野生型病毒重组转移载体与野生型病毒DNADNA共转染昆虫细胞，目的基因通过细胞共转染昆虫细胞，目的基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。内同源重组而插入病毒基因组中。n n利用空斑形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒利用空斑形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒感染昆虫细胞，即可获得大量的外源基因表达产物。感染昆虫细胞，即可获得大量的外源基因表达产物。杆状病毒表达系统的原理NPV基因组巨大，不适于体外操作，需构杆状病毒表达系统的特点杆状病毒表达系统的特点n n重组蛋白具有完整的生物学功能：表达产物在结构及功能重组蛋白具有完整的生物学功能：表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。上接近天然蛋白。n n能进行翻译后的加工修饰：修饰的位点与天然蛋白在细胞能进行翻译后的加工修饰：修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。内的情况完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。n n表达水平高：与其它真核表达系统相比，最突出的特点就表达水平高：与其它真核表达系统相比，最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可达到细胞总蛋白是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可达到细胞总蛋白的的5050。n n能容纳大分子的插入片段：能容纳大分子的插入片段：n n能同时表达多个基因：既可采用不同的重组病毒同时感染能同时表达多个基因：既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。n n不足：非连续性表达；表达产物的糖基化相对简单，多不不足：非连续性表达；表达产物的糖基化相对简单，多不分支分支。杆状病毒表达系统的特点重组蛋白具有完整的生物学功能：表达产物n n与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的白质的正确折叠，提供复杂的N N型糖基化和准确的型糖基化和准确的O O型糖基化等多型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。n n与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平低、获得高表达细胞与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平低、获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产蛋白质的成本较高。生产蛋白质的成本较高。33哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质 n n表达需要转录后修饰的基因表达需要转录后修饰的基因n n研究蛋白的生物合成和体内细胞间的转运机制研究蛋白的生物合成和体内细胞间的转运机制n n表达大肠杆菌和酵母不能表达的含有内含子的基因表达大肠杆菌和酵母不能表达的含有内含子的基因序列序列n n 哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，应为首选。应为首选。应为首选。应为首选。哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统表达需要转录后修饰的基因哺乳动物细胞表达系统体外翻译系统体外翻译系统（Invitrotranslationsystem）又称之为体外蛋白）又称之为体外蛋白质合成系统质合成系统(invitroproteinsynthesissystem)，是一种细胞裂，是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDSPAGE后可检测出后可检测出翻译活性。翻译活性。常用翻译系统有以下几种：常用翻译系统有以下几种：1.兔网织细胞裂解物兔网织细胞裂解物(reticylocytelysatesystem)2.小麦胚抽提物小麦胚抽提物(wheatgermextract)3.两栖动物卵母细胞两栖动物卵母细胞4.原核体外翻译系统原核体外翻译系统 体外翻译系统体外翻译系统体外翻译系统（Invitrotranslationsy蛋白质的表达课件Commonlyconfrontedquestionsn nShouldtheprotein(s)beexpressedinShouldtheprotein(s)beexpressedinbacteria,inyeast,ininsectcellsorinbacteria,inyeast,ininsectcellsorinhumancells?humancells?n nWhichexpressionvectorshouldbeused?Whichexpressionvectorshouldbeused?n nIfbacterialexpressionisused,whichIfbacterialexpressionisused,whichstrain(s)shouldbechosen?strain(s)shouldbechosen?n nShouldoneexpressthefulllengthproteinShouldoneexpressthefulllengthproteinorafragmentthereof?orafragmentthereof?n nShouldtheproteinbetagged,andwhichShouldtheproteinbetagged,andwhichaffinitytagisthebest?affinitytagisthebest?n nWhatisagoodpurificationstrategy,andWhatisagoodpurificationstrategy,andwhatarethecommonpitfalls?whatarethecommonpitfalls?Commonlyconfrontedquestionn nUnfortunately,becauseeveryproteinisdifferent,therecanbenorightanswertoanyofthesequestionsapriori.Unfortunately,becauseeverypHowtochooseproteinexpressionsystemn nChoiceofhost(system)Choiceofhost(system)n nChoiceofvectorChoiceofvectorn nChoiceoftagChoiceoftagn nChoiceofstrainsChoiceofstrainsHowtochooseproteinexpressi1.Choiceofhostn nbacteria,fungi,plants,insectormammaliancellsgrowninculture,andtransgenicanimalsorplantsn n“MyExpressionSystemisBetterthanYours”Syndrome-Thereisnooneexpr