长期毒性作用及其试验方法-课件

第十第十五五章章长期毒性作用及其试验方法长期毒性作用及其试验方法 long-term toxicity impact and test method 2024/7/271 第一节第一节 基本概念和目的基本概念和目的 第二节第二节 试验设计原则及方法试验设计原则及方法2024/7/272 第第一一节节基基 本本 概概 念念 和和 目目 的的2024/7/273 长期毒性试验是指试验动物连续多日接触较大长期毒性试验是指试验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的中毒效应剂量的药物所引起的中毒效应，为观察这种中毒效为观察这种中毒效应而设计的毒理学试验称之为应而设计的毒理学试验称之为长期长期(慢性慢性)毒性毒性试验试验。一、定义一、定义 急性毒性试验急性毒性试验是为观察是为观察和评价急性毒性的和评价急性毒性的有害作用有害作用或中毒反应或中毒反应而设计的一种毒理学试验而设计的一种毒理学试验。研究药物一次或。研究药物一次或2424小小时内多次给予时内多次给予受试受试药物药物后，一定时间内后，一定时间内所产生的所产生的毒毒性性反应反应。2024/7/2745/20123给给 药药 的的 期期 限限 不不 同同长期毒性试验与急性毒性试验长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别的根本差别2024/7/2756/20123给给 药药 的的 期期 限限 不不 同同给给 药药 的的 剂剂 量量 范范 围围 不不 同同长期毒性试验与急性毒性试验长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别的根本差别2024/7/276 蓄积作用蓄积作用 (accumulation action)(accumulation action)当较长时间连续、反复给药当较长时间连续、反复给药时，如果时，如果给药的给药的时间间隔和剂量超过机体消除药物的能力时间间隔和剂量超过机体消除药物的能力，就会，就会出现药物进入机体的速度出现药物进入机体的速度 (或总量或总量)超过排除的超过排除的速度速度 (或总量或总量)的现象的现象，此，此时药物就有可能在体时药物就有可能在体内逐渐增加并贮存起来内逐渐增加并贮存起来，即，即蓄积作用蓄积作用。2024/7/277 蓄积作用蓄积作用的表现形式的表现形式作用量积蓄作用量积蓄功能性蓄积功能性蓄积2024/7/2789/20123给给 药药 的的 期期 限限 不不 同同给给 药药 的的 剂剂 量量 范范 围围 不不 同同观观 察察 的的 毒毒 效效 应应 不不 同同长期毒性试验与急性毒性试验长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别的根本差别2024/7/279二、目的与意义二、目的与意义2024/7/27101预测受试物可能引起的临床不良反应预测受试物可能引起的临床不良反应2判断受试物反复给药的毒性靶器官或组织判断受试物反复给药的毒性靶器官或组织提示临床试验中需重点监测的指标提示临床试验中需重点监测的指标43推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围为临床试验中的解毒或解救措施提供参考为临床试验中的解毒或解救措施提供参考5长期毒性试验的目的2024/7/2711 了解实验动物能耐受的最大剂量，找出了解实验动物能耐受的最大剂量，找出完全无毒的安全界量，这个界量是判断一个待完全无毒的安全界量，这个界量是判断一个待选新药是否有进一步开发研究的价值以及能否选新药是否有进一步开发研究的价值以及能否过渡到临床试用的重要依据，同时，也可为其过渡到临床试用的重要依据，同时，也可为其它毒性实验和临床初始剂量的选择提供依据。它毒性实验和临床初始剂量的选择提供依据。因此长期毒性试验是临床前安全性评价的主要因此长期毒性试验是临床前安全性评价的主要内容，它与急性毒性试验、生殖毒性以及致癌内容，它与急性毒性试验、生殖毒性以及致癌性等毒理学研究有着密切的联系，是新药报批性等毒理学研究有着密切的联系，是新药报批临床时重点审评项目之一，是药物从药学研究临床时重点审评项目之一，是药物从药学研究进入临床试验的重要环节。进入临床试验的重要环节。长期毒性试验的长期毒性试验的意义意义2024/7/2712第二节第二节试试 验验 设设 计计 原原 则则 及及 方方 法法2024/7/2713一、一般原则和要求一、一般原则和要求基本原则基本原则全面、严谨、合理全面、严谨、合理整体性整体性随机随机、对照对照、重复重复2024/7/2714一、一般原则和要求一、一般原则和要求基本原则基本原则整体性整体性长期毒性试验不能与药效学、药代动长期毒性试验不能与药效学、药代动力性和其他毒理学研究割裂，试验设力性和其他毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其他药理毒理研究的试计应充分考虑其他药理毒理研究的试验设计和研究结果。长期毒性试验的验设计和研究结果。长期毒性试验的结果应该力求与其他药理毒理试验结结果应该力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。果互为印证、说明和补充。2024/7/2715一、一般原则和要求一、一般原则和要求总体总体原则原则n n选用两种实验动物选用两种实验动物选用两种实验动物选用两种实验动物n n三个剂量三个剂量三个剂量三个剂量n n给药途径应与临床拟用途径相同给药途径应与临床拟用途径相同给药途径应与临床拟用途径相同给药途径应与临床拟用途径相同2024/7/2716一、一般原则和要求一、一般原则和要求总体总体原则原则 至少在两种动物体上进行至少在两种动物体上进行至少在两种动物体上进行至少在两种动物体上进行，兼顾雌雄性别。兼顾雌雄性别。兼顾雌雄性别。兼顾雌雄性别。n n选用两种实验动物选用两种实验动物选用两种实验动物选用两种实验动物2024/7/2717一、一般原则和要求一、一般原则和要求总体总体原则原则n n三个剂量三个剂量三个剂量三个剂量剂量至少分为高、中、低三个档次剂量至少分为高、中、低三个档次剂量至少分为高、中、低三个档次剂量至少分为高、中、低三个档次。高剂量组应能充分反映药物的毒性高剂量组应能充分反映药物的毒性高剂量组应能充分反映药物的毒性高剂量组应能充分反映药物的毒性，低剂量组不出现毒性反应。低剂量组不出现毒性反应。低剂量组不出现毒性反应。低剂量组不出现毒性反应。同时设一溶剂同时设一溶剂同时设一溶剂同时设一溶剂 (或赋或赋或赋或赋形形形形剂剂剂剂 )对照组或对照组或对照组或对照组或已知药物毒性对照组。已知药物毒性对照组。已知药物毒性对照组。已知药物毒性对照组。2024/7/2718一、一般原则和要求一、一般原则和要求总体总体原则原则n n给药途径应与临床拟用途径相同给药途径应与临床拟用途径相同给药途径应与临床拟用途径相同给药途径应与临床拟用途径相同 口服给药大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量为口服给药大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量为每天每天12ml/100g，也可将受试药物混在饲料或水，也可将受试药物混在饲料或水中给予，但要保证每只动物按规定剂量在一定时中给予，但要保证每只动物按规定剂量在一定时间内服入，静脉注射大鼠时可采用腹腔代替，各间内服入，静脉注射大鼠时可采用腹腔代替，各剂量组采用等容量不等浓度给药。特殊情况另作剂量组采用等容量不等浓度给药。特殊情况另作说明。说明。2024/7/2719理想动物的标准：理想动物的标准：n对受试物的生物转化与人体相近；对受试物的生物转化与人体相近；n对受试物敏感；对受试物敏感；n已有大量历史对照数据。已有大量历史对照数据。二、实验动物二、实验动物 2024/7/2720我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。首选狗。1.1.种类及品系种类及品系二、实验动物二、实验动物2024/7/2721我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。首选狗。1.1.种类及品系种类及品系二、实验动物二、实验动物Wistar大鼠SD大鼠 近亲繁殖鼠？近亲繁殖鼠？杂交鼠？杂交鼠？2024/7/2722我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。首选狗。1.1.种类及品系种类及品系二、实验动物二、实验动物 一类新药：Beagle犬 二类新药：杂种狗 2024/7/2723我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。首选狗。1.1.种类及品系种类及品系二、实验动物二、实验动物在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在呼吸系统的解剖学和生理学方面比其它动物更接呼吸系统的解剖学和生理学方面比其它动物更接近人类。近人类。如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。2024/7/2724 Beagle犬：原产英国，纯种小猎兔犬 Beagle犬的特点：体型小,毛短,性情温和,亲人,抗病力强 缺点：价格昂贵2024/7/27272.2.起始月起始月(周周)龄龄一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。二、实验动物二、实验动物 2024/7/27282.2.起始月起始月(周周)龄龄一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。二、实验动物二、实验动物 长期毒性试验的给药期限较长长期毒性试验的给药期限较长；13原因原因：年龄较大的动物反应性降低年龄较大的动物反应性降低,存存在许多发性疾病干扰试验结果。在许多发性疾病干扰试验结果。处于生长发育阶段的动物对药物处于生长发育阶段的动物对药物的毒性反应较敏感的毒性反应较敏感；232024/7/2729n啮啮齿类动物最好在断奶后不久即开始给药齿类动物最好在断奶后不久即开始给药 大鼠大鼠起始周龄起始周龄要求在要求在 6 8周龄周龄；如果试验周期如果试验周期超过超过3个月以上，则个月以上，则将起始周龄降至将起始周龄降至 5 6周龄周龄。n狗的起始月龄为狗的起始月龄为 6 月龄月龄，一般不超过一般不超过 12 月月 龄龄；如选用杂种狗如选用杂种狗，起始年龄可稍大些起始年龄可稍大些，但也不能超但也不能超过过 5 年。年。二、实验动物二、实验动物 2.2.起始月起始月(周周)龄龄2024/7/2730n起始体重应在体重均值起始体重应在体重均值 20%的范围内的范围内。二、实验动物二、实验动物 2.2.起始月起始月(周周)龄龄2024/7/27313.3.性别及数量性别及数量 （1 1）性别）性别二、实验动物二、实验动物 一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中 雌雄性别的动物数必须一致。雌雄性别的动物数必须一致。2024/7/2732 在特殊情况下如药物对雄性（或雌性）生殖在特殊情况下如药物对雄性（或雌性）生殖细胞的毒效应已确知，或者急性试验已证明药物细胞的毒效应已确知，或者急性试验已证明药物对雌雄两性动物的毒性有明显差别时，就应主要对雌雄两性动物的毒性有明显差别时，就应主要选用敏感性别的动物进行试验。选用敏感性别的动物进行试验。二、实验动物二、实验动物 3.3.性别及数量性别及数量 （1 1）性别）性别2024/7/2733超过超过 90 天的试验天的试验 啮齿类动物每组至少啮齿类动物每组至少 40 只（雌雄各只（雌雄各 20 只）；只）；非啮齿类每组非啮齿类每组 810 只（雌雄各只（雌雄各 45 只）。只）。90 天以内的试验天以内的试验 啮齿类动物每组至少啮齿类动物每组至少20只（雌雄各只（雌雄各 10 只）；只）；非啮齿类每组非啮齿类每组 46 只（雌雄各只（雌雄各 23只）；只）；二、实验动物二、实验动物 3.3.性别及数量性别及数量 （2 2）数量）数量2024/7/2734超过超过 90 天的试验天的试验 啮齿类动物每组至少啮齿类动物每组至少 40 只（雌雄各只（雌雄各 20 只）；只）；非啮齿类每组非啮齿类每组 8-10 只（雌雄各只（雌雄各 45 只）。只）。90 天以内的试验天以内的试验 啮齿类动物每组至少啮齿类动物每组至少20只（雌雄各只（雌雄各 10 只）；只）；非啮齿类每组非啮齿类每组 46 只（雌雄各只（雌雄各 23只）；只）；二、实验动物二、实验动物 3.3.性别及数量性别及数量 （2 2）数量）数量指导原则指导原则：一般大鼠为雌、雄各：一般大鼠为雌、雄各30只，只，Beagle犬或猴各犬或猴各36只。只。2024/7/27354.4.饲养管理饲养管理 严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素是非常重要的。是非常重要的。二、实验动物二、实验动物 2024/7/2736酮症酸中毒酮症酸中毒室内温度室内温度饲料或饲料配方饲料或饲料配方湿湿 度度光光 照照通风条件通风条件饮水质量饮水质量环境因素环境因素环境因素环境因素4.4.饲养管理饲养管理二、实验动物二、实验动物 2024/7/2737酮症酸中毒酮症酸中毒室内温度室内温度饲料或饲料配方饲料或饲料配方湿湿 度度光光 照照通风条件通风条件饮水质量饮水质量环境因素环境因素环境因素环境因素4.4.饲养管理饲养管理二、实验动物二、实验动物 啮齿类动物啮齿类动物适宜温度为适宜温度为 1827 。相对湿度为相对湿度为 40%70%。光照宜持续光照宜持续 12 小时明亮，小时明亮，12 小时黑暗。小时黑暗。通风条件良好。通风条件良好。所用饲料应符合动物的营养标准。所用饲料应符合动物的营养标准。雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过 5只只2024/7/2738酮症酸中毒酮症酸中毒室内温度室内温度饲料或饲料配方饲料或饲料配方湿湿 度度光光 照照通风条件通风条件饮水质量饮水质量环境因素环境因素环境因素环境因素4.4.饲养管理饲养管理二、实验动物二、实验动物 犬犬单笼饲养，定量喂食。单笼饲养，定量喂食。Beagle 狗实验前至少驯养狗实验前至少驯养 12 周周;杂种狗应先检疫，驱虫。杂种狗应先检疫，驱虫。2024/7/2739三、给药期限三、给药期限 按我国药政管理部门的要求，长期毒性试按我国药政管理部门的要求，长期毒性试验的给药期限一般为临床疗程的验的给药期限一般为临床疗程的34倍时间。倍时间。创新药品试验周期应不少于创新药品试验周期应不少于90天，天，超过超过180天天的新药可以在试验开始的新药可以在试验开始90天后，同时进行天后，同时进行I期临期临床试验。床试验。2024/7/2740我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定 临床拟用临床拟用 毒性试验期限毒性试验期限 给药时间给药时间 啮齿类动物啮齿类动物 非啮齿类动物非啮齿类动物5 5天天 2 2周周 2 2周周2 2周周 1 1月月 1 1月月 2-42-4周周 3 3月月 3 3月月 1-31-3月月 6 6月月 6 6月月 3 3月月 6 6月月 9 9月月 每天给药最好固定时间。每天给药最好固定时间。2024/7/2741四、剂量水平的选择四、剂量水平的选择 三个剂量组是必不可少的：三个剂量组是必不可少的：n一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死亡率应控制在亡率应控制在 20%以内；以内；n第二个是不引起毒性作用的低剂量第二个是不引起毒性作用的低剂量(一般为动物有一般为动物有效剂量或临床治疗量的效剂量或临床治疗量的23倍倍)；n为表明毒性作用的量为表明毒性作用的量效关系，在上述两个剂量效关系，在上述两个剂量之间插入一个之间插入一个(或多个或多个)中间剂量。中间剂量。中剂量按中剂量按 计算计算 2024/7/2742 在选择合适的剂量时还应考虑到：在选择合适的剂量时还应考虑到：药药物物在在体体内内的的生生物物蓄蓄积积作作用用。对对于于高高蓄蓄积积性性药药物物应应适适当当减减少少其其剂剂量量，否否则则在在长长期期毒毒性性试试验验结结束束时各剂量均有可能出现毒性作用；时各剂量均有可能出现毒性作用；药药物物是是否否有有可可能能被被特特殊殊的的酶酶所所“解解毒毒”或或“活活化化增增毒毒”，而而这这些些酶酶又又是是否否易易被被药药物物本本身身所所诱诱导导或抑制。或抑制。药药物物在在消消化化道道中中的的稳稳定定性性。与与胃胃肠肠道道内内容容物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。2024/7/2743可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1 1）半数致死量法（）半数致死量法（LDLD5050法）法）根据急性毒性的根据急性毒性的LD50值决定三个剂量。一般在值决定三个剂量。一般在大鼠大鼠3个月长期毒性试验中，高、中、低三个剂量可个月长期毒性试验中，高、中、低三个剂量可分别采用约分别采用约LD50的的1/10、1/50和和1/100剂量，狗各剂剂量，狗各剂量组可采用大鼠相应各组的一半剂量。量组可采用大鼠相应各组的一半剂量。可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（）半数致死量法（LD50法）法）（2）短期蓄积试验过渡法）短期蓄积试验过渡法 根据急性毒性试验所提供的相关信息，如毒根据急性毒性试验所提供的相关信息，如毒性的量性的量效关系，毒性出现的剂量范围及敏感动效关系，毒性出现的剂量范围及敏感动物等，先过渡到物等，先过渡到7 7天至天至2121天的短期蓄积性试验，再天的短期蓄积性试验，再将获得的参数外推于长期毒性试验。将获得的参数外推于长期毒性试验。急性毒性试验急性毒性试验蓄积毒性试验蓄积毒性试验和和/或或7 7天短期重复给药试验天短期重复给药试验9090天重复给药试验天重复给药试验180180天或更长期重复给药试验天或更长期重复给药试验可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（）半数致死量法（LD50法）法）（2）短期蓄积试验过渡法）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法）药代动力学法 根据药代动力学最大有效安全浓度（根据药代动力学最大有效安全浓度（MCD）大鼠大鼠3个月长期毒性试验时，低、中、高三个剂量可分别采个月长期毒性试验时，低、中、高三个剂量可分别采用大鼠的用大鼠的1.0、3.36.6 和和1020 MCD;狗一般可采用大鼠一半左右的剂量。狗一般可采用大鼠一半左右的剂量。可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（）半数致死量法（LD50法）法）（2）短期蓄积试验过渡法）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（）药代动力学法（MBS法）法）根据大鼠急性毒性试验的最大耐受量根据大鼠急性毒性试验的最大耐受量(MTD)大鼠长期毒性试验的三个剂量分别为大鼠长期毒性试验的三个剂量分别为1、1/3及及1/10MTD；狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。（4）最大耐受量法（）最大耐受量法（MTD法）法）可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（）半数致死量法（LD50法）法）（2）短期蓄积试验过渡法）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（）药代动力学法（MBS法）法）根据临床拟用剂量（根据临床拟用剂量（3个月长期毒性试验）个月长期毒性试验）大鼠低、中、高三个剂量可分别采用大鼠低、中、高三个剂量可分别采用50100倍、倍、2550倍和倍和 1020倍临床剂量倍临床剂量狗可分别采用狗可分别采用3050倍、倍、1525倍和倍和510倍临床剂量倍临床剂量猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验（4）最大耐受量法（）最大耐受量法（MTD法）法）（5）临床拟用剂量法（）临床拟用剂量法（ACD法）法）可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（）半数致死量法（LD50法）法）（2）短期蓄积试验过渡法）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（）药代动力学法（MBS法）法）根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数扩大。扩大。（4）最大耐受量法（）最大耐受量法（MTD法）法）（5）临床拟用剂量法（）临床拟用剂量法（ACD法）法）（6）等效剂量法）等效剂量法不同动物的剂量折算系数不同动物的剂量折算系数 动物种属动物种属 小鼠小鼠 大鼠大鼠 豚鼠豚鼠 兔兔 猫猫 猴猴 狗狗 人人标准标准 K(K(剂量折算系数剂量折算系数)1 1 7 7 12.312.3 27.527.5 29.729.7 64 64 124124 388388体重体重 K(kgK(kg体重剂量折算系数体重剂量折算系数)1 1 0.710.71 0.62 0.62 0.37 0.37 0.30 0.30 0.320.32 0.210.21 0.110.11任何任何 R(R(动物体型系数动物体型系数)0.0590.059 0.090.09 0.099 0.099 0.0930.093 0.0820.082 0.1110.111 0.104 0.104 0.10.1体重体重 W(W(标准体重标准体重kg)kg)0.020.02 0.20.2 0.40.4 1.51.5 2 2 4 4 1212 7070注：有些资料记载的动物体型系数（注：有些资料记载的动物体型系数（R R）为此表中）为此表中R R 值的值的1000 1000 倍，如小鼠倍，如小鼠R R 为为5959，大鼠，大鼠R R 为为9090，这不影响药物剂量的折算。这不影响药物剂量的折算。2024/7/2751对于标准体重的动物：对于标准体重的动物：每只用量（每只用量（mg/mg/只）只）D DB B D DA A K KB BK KA A千克体重剂量（千克体重剂量（mg/kgmg/kg）d dB B d dB B K KB BK KA AK KA A，K KB B，R RA A，R RB B 值由上表查找值由上表查找2024/7/2752对于任何体重的动物：对于任何体重的动物：每只用量（每只用量（mg/mg/只）只）D DB B D DA A R RB B(W WB B)2/32/3R RA AW WA A千克体重剂量（千克体重剂量（mg/kgmg/kg）d dB B d dA AR RB B(W WB B)2/32/3R RA AW WA A式中式中D DB B、d dB B 分别是欲计算的分别是欲计算的B B 种动物的每只剂量及公斤体种动物的每只剂量及公斤体重剂量，重剂量，D DA A、d dA A 分别是已知分别是已知A A 种动物的每只剂量及公斤体种动物的每只剂量及公斤体重剂量，重剂量，W WA A、W WB B 是已知动物体重，是已知动物体重，R RA A、R RB B 是体型系数，可是体型系数，可由上表查得由上表查得。2024/7/2753可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（）半数致死量法（LD50法）法）（2）短期蓄积试验过渡法）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（）药代动力学法（MBS法）法）（4）最大耐受量法（）最大耐受量法（MTD法）法）（5）临床拟用剂量法（）临床拟用剂量法（ACD法）法）（6）等效剂量法）等效剂量法五、限度试验五、限度试验 我国药政部门规定我国药政部门规定，如小鼠急性毒性的口服如小鼠急性毒性的口服给药剂量大于给药剂量大于 5g/kg5g/kg，注射给药剂量大于注射给药剂量大于 2g/kg 2g/kg 仍未产生毒性反应和死亡仍未产生毒性反应和死亡，或仅个别动物有毒性或仅个别动物有毒性反应时反应时，可考虑只做一个高于临床拟用剂量可考虑只做一个高于临床拟用剂量5050倍倍(狗用狗用3030倍倍)的剂量组。的剂量组。2024/7/2755 经济合作与开发组织经济合作与开发组织(OECD)提出如果一种提出如果一种化合物以化合物以1000mg/kg的剂量的剂量，按规定期限连续给按规定期限连续给药药，不产生任何可观察到的毒性反应不产生任何可观察到的毒性反应，而且根据而且根据结构相关药物的已有资料结构相关药物的已有资料，估计不会产生毒性的估计不会产生毒性的话话，就不需要再用三个剂量来进行试验就不需要再用三个剂量来进行试验，除非预除非预期临床需要更高的剂量。期临床需要更高的剂量。五、限度试验五、限度试验2024/7/2756六、给药方法六、给药方法n长期毒性试验的给药途径一般应尽量与预期临床长期毒性试验的给药途径一般应尽量与预期临床使用的途径相一致。使用的途径相一致。临床用药途径为静脉或肌注临床用药途径为静脉或肌注时，时，3 3个月及以上的试验，由于试验周期长大鼠给个月及以上的试验，由于试验周期长大鼠给药有困难，可用腹腔或皮下注射代替。药有困难，可用腹腔或皮下注射代替。n如采用灌胃给药的方式可将供试药物制成一种溶如采用灌胃给药的方式可将供试药物制成一种溶液或混悬液，但必须注意给药容量不应超过液或混悬液，但必须注意给药容量不应超过 12ml/100g 体重体重/天。天。2024/7/2757六、给药方法六、给药方法n长期毒性试验长期毒性试验一般均强调每天给药，每周必须一般均强调每天给药，每周必须给药给药 7 天。给药期限长（天。给药期限长（3个月或以上）的药个月或以上）的药物每周至少应给药物每周至少应给药6天。天。2024/7/2758七七、观察及测定指标、观察及测定指标 试验前，啮齿类动物至少应进行试验前，啮齿类动物至少应进行5天的适应性观天的适应性观 察，非啮齿类动物至少应驯养观察察，非啮齿类动物至少应驯养观察12周，应对周，应对 动物进行一般观察及血液生化学指标的检测。动物进行一般观察及血液生化学指标的检测。试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的 观察。观察。试验结束时，必须留试验结束时，必须留1/3的动物做恢复期的观察的动物做恢复期的观察 试验，其观察期时间一般不超过试验，其观察期时间一般不超过28天。天。2024/7/2759（一一）日常观察日常观察 1.一般一般观察观察内容内容 包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、孔道孔道(及其分泌物及其分泌物)、呼吸、循环、自主神经系、呼吸、循环、自主神经系统、躯体和肢体活动情况以及精神行为进行仔细统、躯体和肢体活动情况以及精神行为进行仔细地观察地观察；对动物粪便的量、色泽和内含物对动物粪便的量、色泽和内含物，散失散失的食物的食物，饮水瓶中残余的水以及一切可以反映动饮水瓶中残余的水以及一切可以反映动物生活情况变化的各种迹象物生活情况变化的各种迹象，都必须加以注意。都必须加以注意。所有出现的症状都必须记录在案。所有出现的症状都必须记录在案。2024/7/27601.一般一般观察观察内容内容 如果发现动物死亡如果发现动物死亡，必须尽可能快地进行尸必须尽可能快地进行尸体剖检体剖检，以减少组织自溶。将组织置于以减少组织自溶。将组织置于 10%的中的中性福尔马林或其它适宜的固定液中。如果尸体剖性福尔马林或其它适宜的固定液中。如果尸体剖检不能立即进行检不能立即进行，则必须将动物则必须将动物冷藏冷藏起来以延缓起来以延缓组织自溶组织自溶。（一一）日常观察日常观察 2024/7/27611.一般一般观察观察内容内容 对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。（一一）日常观察日常观察 尸体剖检尸体剖检后行组织病理学检查、评价后行组织病理学检查、评价。2024/7/27622.生长率生长率 （一一）日常观察日常观察 2024/7/27633.食耗食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算食耗的计算 将加入供食器具中饲料的重量减去剩余的饲料重量再除以给食天数（一一）日常观察日常观察 2024/7/27643.食耗食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算食耗的计算 将给药组和对照组的食耗加以比较将给药组和对照组的食耗加以比较，有助于说有助于说明药物是否影响实验动物的食欲。明药物是否影响实验动物的食欲。（一一）日常观察日常观察 2024/7/27653.食耗食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算食耗的计算 将给药组和对照组的食耗加以比较将给药组和对照组的食耗加以比较，有助于说有助于说明药物是否影响实验动物的食欲。明药物是否影响实验动物的食欲。（一一）日常观察日常观察 如对食欲有影响如对食欲有影响，则每日进食量必然减少则每日进食量必然减少,体重增体重增长亦受影响长亦受影响,但此时食物利用率并不一定降低但此时食物利用率并不一定降低 如果不影响食欲如果不影响食欲,而体重增长却下降而体重增长却下降,表明药物有可表明药物有可能影响食物的吸收或合成代谢能影响食物的吸收或合成代谢,此时食物利用率就此时食物利用率就必然会有变化必然会有变化2024/7/2766（二）测定指标（二）测定指标 1.器官重量器官重量 涉及的主要器官有涉及的主要器官有：心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、肾上腺、甲状腺、肾上腺、甲状腺、睾丸睾丸、前列腺、子宫、前列腺、子宫等等。目的：确定靶器官2024/7/2767年组织编写年组织编写 药物研究技术指导原则药物研究技术指导原则规定规定长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：l脑脑l肝脏肝脏l肾上腺肾上腺l脾脏脾脏l附睾附睾l子宫子宫l心脏心脏l肾脏肾脏l胸腺胸腺l睾丸睾丸l卵巢卵巢l肺脏肺脏2024/7/2768年组织编写年组织编写 药物研究技术指导原则药物研究技术指导原则规定规定长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：l脑脑l肝脏肝脏l肾上腺肾上腺l脾脏脾脏l附睾附睾l子宫子宫l心脏心脏l肾脏肾脏l胸腺胸腺l睾丸睾丸l卵巢卵巢l肺脏肺脏甲状腺、甲状腺、前列腺前列腺2024/7/2769长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：l脑（大脑、小脑、脑干）脑（大脑、小脑、脑干）l垂体垂体l甲状腺甲状腺l食管食管l胃胃l肝脏肝脏l肾脏肾脏l脾脏脾脏l气管气管l主动脉主动脉l附睾附睾l卵巢卵巢l前列腺前列腺l坐骨神经坐骨神经l眼（眼科检查发现异常时）眼（眼科检查发现异常时）l给药局部给药局部l淋巴结淋巴结l脊髓脊髓l胸腺胸腺l甲状旁腺甲状旁腺l唾液腺唾液腺l小肠和大肠小肠和大肠l胆囊胆囊l肾上腺肾上腺l胰腺胰腺l肺肺l心脏心脏l睾丸睾丸l子宫子宫l乳腺乳腺l膀胱膀胱l视神经视神经l骨髓骨髓注：为啮齿类动物可不进行组织病理学检查的组织或器官注：为啮齿类动物可不进行组织病理学检查的组织或器官1.1.器官重量器官重量 器官重量降低器官重量降低，表示该器官萎缩或发育不良表示该器官萎缩或发育不良；器官重量增加提示可能有充血器官重量增加提示可能有充血、水肿、增生、肥大、酶诱水肿、增生、肥大、酶诱导变化或新生物等。导变化或新生物等。将动物处死后取出上述器官将动物处死后取出上述器官，除去附着的组除去附着的组织、除尽余血后立即称重织、除尽余血后立即称重（注意勿使组织干燥注意勿使组织干燥注意勿使组织干燥注意勿使组织干燥）。（二）测定指标（二）测定指标 2024/7/27712.2.血液学血液学（二）测定指标（二）测定指标 u常规的血液学参数常规的血液学参数u骨髓涂片骨髓涂片1.1.器官重量器官重量 2024/7/2772年组织编写年组织编写 药物研究技术指导药物研究技术指导原则原则规定规定血液学指标血液学指标l红细胞计数红细胞计数l红细胞容积红细胞容积l平均红细胞血红蛋白平均红细胞血红蛋白l网织红细胞计数网织红细胞计数l血小板计数血小板计数l血红蛋白血红蛋白l平均红细胞容积平均红细胞容积l平均红细胞血红蛋白浓度平均红细胞血红蛋白浓度l白细胞计数及分类白细胞计数及分类l凝血酶原时间凝血酶原时间红细胞压积红细胞压积2024/7/2773 血液学指标血液学指标观察时间观察时间非非啮啮齿类动物齿类动物一般于整个试验周期中每隔一般于整个试验周期中每隔 1.5 2 个月采血测定一次各项指标。个月采血测定一次各项指标。啮啮齿类动物齿类动物试验周期为试验周期为 6 个月时个月时，可于试验中期、试验末可于试验中期、试验末 期以及恢复期分别剖杀部分动物期以及恢复期分别剖杀部分动物(约约 1/4、2/4、1/4)，进行各项检查进行各项检查；试验周期为试验周期为 3 个月时个月时，可于试验未期以及恢复可于试验未期以及恢复 期分别剖杀部分动物期分别剖杀部分动物(约约 2/3、1/3)，取血，取血检查。检查。（二）测定指标（二）测定指标 2024/7/27743.血液生化学血液生化学 注意注意事项：事项：q采血时从各组中随机捉取动采血时从各组中随机捉取动物，物，样本不能溶血样本不能溶血q使用足够数量的动物使用足够数量的动物q采样前禁食采样前禁食 12 小时小时q使用合适的统计学分析方法使用合适的统计学分析方法，注意剂量注意剂量反应关反应关 系系；将所得资料和数据与同种、同龄、同性别、将所得资料和数据与同种、同龄、同性别、同生理状况的实验动物的资料加以比较分析同生理状况的实验动物的资料加以比较分析 （二）测定指标（二）测定指标 2.2.血液学血液学1.1.器官重量器官重量 2024/7/2775年组织编写年组织编写 药物研究技术指药物研究技术指导原则导原则规定规定血液生化学指标血液生化学指标l天门冬氨酸氨基转换酶天门冬氨酸氨基转换酶l碱性磷酸酶碱性磷酸酶l尿素氮尿素氮l总蛋白总蛋白l血糖血糖l总胆固醇总胆固醇l谷氨酰转移酶谷氨酰转移酶l氯离子浓度氯离子浓度l丙氨酸氨基转换酶丙氨酸氨基转换酶l肌酸磷酸激酶肌酸磷酸激酶l肌酐肌酐l白蛋白白蛋白l总胆红素总胆红素l甘油三酯甘油三酯l钾离子浓度钾离子浓度l钠离子浓度钠离子浓度2024/7/27763.血液生化学血液生化学 （二）测定指标（二）测定指标 2.2.血液学血液学1.1.器官重量器官重量 4.尿液分析尿液分析 2024/7/2777尿液分析指标尿液分析指标l尿液外观尿液外观lpHpH值值l尿蛋白尿蛋白l尿胆原尿胆原l潜血潜血l比重比重l尿糖尿糖l尿胆红素尿胆红素l酮体酮体l白细胞白细胞年组织编写年组织编写 药物研究技术指药物研究技术指导原则导原则规定规定2024/7/2778八八、恢复期恢复期观察观察 最后一次给药物后最后一次给药物后24小时，每组活杀部分动小时，每组活杀部分动物检测上述各项指标，留下物检测上述各项指标，留下1/31/4动物进行恢复动物进行恢复期观察。观察期一般不超过期观察。观察期一般不超过28天，而后再活杀检天，而后再活杀检查查上述上述所有指标，以了解毒性反应的可逆程度和所有指标，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。可能出现的延迟性毒性反应。2024/7/2779综合评价综合评价 长期毒性试验是药物非临床安全性研究长期毒性试验是药物非临床安全性研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导意义最大合性最强、获得信息最多和对临床指导意义最大的一项毒理学研究。对其结果进行评价时，应结的一项毒理学研究。对其结果进行评价时，应结合受试物的药学特点，药效学、药代动力学和其合受试物的药学特点，药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果，以及已取得的临床研究的他毒理学研究的结果，以及已取得的临床研究的结果，进行综合评价。结果，进行综合评价。2024/7/2780本章复习本章复习n长期毒性试验长期毒性试验；蓄积作用蓄积作用。n蓄积作用蓄积作用的表现形式有几种？的表现形式有几种？我国药政部门对长期毒性试验动物数的要求。我国药政部门对长期毒性试验动物数的要求。长期毒性试验时检查的器官包括哪些？长期毒性试验时检查的器官包括哪些？恢复期观察。恢复期观察。剂量水平的选择有哪几种具体方法参考？剂量水平的选择有哪几种具体方法参考？2024/7/2781