医学分子生物学试验基本技术课件

医学分子生物学实验医学分子生物学实验 基本技术基本技术 金光辉、李炜、郑红花、宋刚、石松林、刘迎福章喻军、林筱医学分子生物学实验 基本技术 金光辉、李炜、郑红花、宋Molecular Biology TimelineMolecular Biology TimelineDNA discovered by F.Meischer18691910Genes on chromosomes;T.H.Morgan1941One gene-one enzyme,Beadle&Tatum1944DNA is genetic material;Avery,Mcleod&McCarty1953Structure of DNA;Watson,Crick,Franklin,Wilkins1961Discovery of mRNA;Brenner,Jacob&Meseleson1966Finished unraveling the code;Nirenberg&Khorana1972Recombinant DNA made in vitro;P.Berg1973DNA cloned on a plasmid;H.Boyer&S.CohenDiscovery of reverse transcriptase;H.Temin19731977Rapid DNA sequencing;F.Sanger&W.Gilbert1977Discovery of split genes;Sharp,Roberts et al.1982Discovery of ribozymes;T.Cech&S.Altman20011986Creation of PCR;K.Mullis et al.Human Genome Project;Venter,Collins and many othersMolecular Biology TimelineDNA 目的和要求目的和要求通过分子生物学实验课程的学习和训练，通过分子生物学实验课程的学习和训练，1.1.掌握掌握掌握掌握该领域的基本知识、基本技能和基本方法该领域的基本知识、基本技能和基本方法;2.2.了解了解了解了解分子生物学这一新兴基础学科的研究发展、技术分子生物学这一新兴基础学科的研究发展、技术革新和最新成果革新和最新成果;3.3.对分子生物学的研究领域、研究方法、临床应用等有对分子生物学的研究领域、研究方法、临床应用等有完整的完整的认识认识认识认识;4.4.为今后从事科学研究和医学工作奠定基础。为今后从事科学研究和医学工作奠定基础。掌握实验操作中常用掌握实验操作中常用仪器仪器仪器仪器的使用和工作原理；学会研的使用和工作原理；学会研究中实验究中实验方法方法方法方法的选择、原理和操作；学会的选择、原理和操作；学会实验资料实验资料实验资料实验资料的的收集、整理和；收集、整理和；实验数据实验数据实验数据实验数据的处理；学会对的处理；学会对实验结果实验结果实验结果实验结果的的分析、整理和分析、整理和实验报告实验报告实验报告实验报告的正确书写；了解最新研究动的正确书写；了解最新研究动向和技术。向和技术。通过实验课程的学习加深对分子生物学通过实验课程的学习加深对分子生物学理论知识理论知识理论知识理论知识的理的理解，提高科学解，提高科学思维能力思维能力思维能力思维能力和分析问题、动手解决问题的和分析问题、动手解决问题的能力，培养严谨扎实的能力，培养严谨扎实的科研作风科研作风科研作风科研作风。目的和要求通过分子生物学实验课程的学习和训练，实验室规则实验室规则1 1实验前实验前预习预习预习预习实验内容，熟悉实验目的、实验原理、操作步骤以及实验注实验内容，熟悉实验目的、实验原理、操作步骤以及实验注意事项。意事项。2 2遵守课堂纪律，实验中认真操作，保持室内遵守课堂纪律，实验中认真操作，保持室内安静安静安静安静。3 3保持实验室和仪器整齐保持实验室和仪器整齐清洁清洁清洁清洁。实验工作结束后，要及时清扫地板和整理。实验工作结束后，要及时清扫地板和整理台面物品。实验室严禁吸烟、随地吐痰、乱扔纸屑、杂物。实验结束后台面物品。实验室严禁吸烟、随地吐痰、乱扔纸屑、杂物。实验结束后值日生搞好实验室的卫生。实验室清出的垃圾和试剂要分别倒（放）到值日生搞好实验室的卫生。实验室清出的垃圾和试剂要分别倒（放）到指定的位置。离开实验室前必须切断电源和关闭其他应关闭的仪器设备。指定的位置。离开实验室前必须切断电源和关闭其他应关闭的仪器设备。注意防火、防盗、防灾。注意清除安全隐患，提高安全意识，注意关水、注意防火、防盗、防灾。注意清除安全隐患，提高安全意识，注意关水、关灯、关电、锁门。关灯、关电、锁门。4 4实验室有毒、易燃、易爆、腐蚀和贵重材料应谨慎实验室有毒、易燃、易爆、腐蚀和贵重材料应谨慎操作操作操作操作、定点存放，领、定点存放，领用要登记，使用要记录。严格按照说明规范操作各种仪器和使用各种材用要登记，使用要记录。严格按照说明规范操作各种仪器和使用各种材料和试剂。对于仪器、重要或危险物品的操作，料和试剂。对于仪器、重要或危险物品的操作，必须经他人指导、操作必须经他人指导、操作熟练后才允许独自操作。对氢气等易燃气体和药品应远离火源。熟练后才允许独自操作。对氢气等易燃气体和药品应远离火源。5 5实验室实验室物品物品物品物品为实验专用，不得挪作它用或占为私有。任何人未经批准，为实验专用，不得挪作它用或占为私有。任何人未经批准，不得擅自将实验室的器材、药品等拿回宿舍使用或存放。不得擅自将实验室的器材、药品等拿回宿舍使用或存放。6.6.爱护实验爱护实验器材器材器材器材。损坏实验物品按规定进行赔偿。损坏实验物品按规定进行赔偿。7 7实验室内必须穿实验室内必须穿实验工作服实验工作服实验工作服实验工作服进行操作。进行操作。8 8实验物品和试剂等使用后必须放回原来实验物品和试剂等使用后必须放回原来位置位置位置位置。实验室规则1实验前预习实验内容，熟悉实验目的、实验原理、操实验操作及实验报告要求实验操作及实验报告要求一、实验操作要求一、实验操作要求一、实验操作要求一、实验操作要求1 1实验课前预习实验内容，实验课前预习实验内容，熟悉熟悉熟悉熟悉实验目的、实验原理、操实验目的、实验原理、操作步骤以及实验注意事项。作步骤以及实验注意事项。2 2实验过程中实验过程中严谨操作、仔细观察、认真实验并进行实验严谨操作、仔细观察、认真实验并进行实验严谨操作、仔细观察、认真实验并进行实验严谨操作、仔细观察、认真实验并进行实验记录记录记录记录。3 3准确认真完整清楚准确认真完整清楚记录记录记录记录实验现象、实验结果和数据。实实验现象、实验结果和数据。实验记录需使用专用记录本，不可使用单片纸或草稿记录。验记录需使用专用记录本，不可使用单片纸或草稿记录。4 4必须掌握操作步骤和实验流程后才能进行实验。必须掌握操作步骤和实验流程后才能进行实验。实验操作及实验报告要求一、实验操作要求二、实验报告要求二、实验报告要求二、实验报告要求二、实验报告要求1 1实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。实验报告要求实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。实验报告要求语言准确精炼、表述流畅。语言准确精炼、表述流畅。2 2实验报告严格按照如下格式和内容书写。实验报告严格按照如下格式和内容书写。实验编号实验编号 实验名称实验名称 实验人、学号、实验组员、实验日期实验人、学号、实验组员、实验日期 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验材料实验材料 方法和步骤方法和步骤 实验结果实验结果 结果讨论和结论结果讨论和结论 实验思考题实验思考题3 3在写实验报告时，实验目的和原理应按照该次实验内容和实验步骤写出，在写实验报告时，实验目的和原理应按照该次实验内容和实验步骤写出，要明确具体、有针对性。实验材料包括实验所用的实验动物、细胞或组织、要明确具体、有针对性。实验材料包括实验所用的实验动物、细胞或组织、重要的实验试剂和仪器设备。实验结果中应包括全部实验过程中观察到的重要的实验试剂和仪器设备。实验结果中应包括全部实验过程中观察到的现象、实验结果和实验数据。实验数据中的图表要有图名和表名，图名位现象、实验结果和实验数据。实验数据中的图表要有图名和表名，图名位于图下方，表名位于表格上方。图表需大小合适、标注清楚。图表内容和于图下方，表名位于表格上方。图表需大小合适、标注清楚。图表内容和所包含的信息必须在实验结果中使用流畅简洁语言表达出来。结果讨论和所包含的信息必须在实验结果中使用流畅简洁语言表达出来。结果讨论和结论是对实验过程、实验方法步骤的关键环节、实验设计的认识体会、实结论是对实验过程、实验方法步骤的关键环节、实验设计的认识体会、实验结果、实验异常现象、实验思考题的分析和对该次实验作出的总结和结验结果、实验异常现象、实验思考题的分析和对该次实验作出的总结和结论。论。二、实验报告要求分子生物学实验进程分子生物学实验进程实验一实验一 真核细胞染色体真核细胞染色体DNADNA的分离制备的分离制备 DNA DNA样品的纯化、定量和电泳检测样品的纯化、定量和电泳检测实验二实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化实验三实验三 碱变性法小量制备质粒碱变性法小量制备质粒 DNA DNA的限制性酶切的限制性酶切 实验四实验四 琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNADNA片段的分离和回收片段的分离和回收 质粒质粒DNADNA的连接和转化的连接和转化实验五实验五 真核细胞真核细胞RNARNA的制备和逆转录的制备和逆转录PCRPCR实验六实验六 WesternWestern印迹（上）印迹（上）实验七实验七 WesternWestern印迹（下）印迹（下）实验八实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测实验九实验九 多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCRPCR）反应）反应实验十实验十 NorthernNorthern印迹印迹实验十一实验十一 SouthernSouthern印迹印迹考试考试 分子生物学实验进程实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备生物技术生物技术生物技术生物技术（biotechnology):biotechnology):基因工程、细胞工程、发基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程和酶工程，新生物技术的核心是基酵工程、蛋白质工程和酶工程，新生物技术的核心是基因工程技术。因工程技术。新技术：新技术：基因操作技术、生物治疗技术、转基因动植物基因操作技术、生物治疗技术、转基因动植物技术、人类和其他生命体基因组工程、基因治疗技术、技术、人类和其他生命体基因组工程、基因治疗技术、蛋白质工程技术、生物信息技术、生物芯片技术等。蛋白质工程技术、生物信息技术、生物芯片技术等。生物技术产业：生物技术产业：生物技术产业：生物技术产业：基因药物、重组疫苗、生物芯片、生物基因药物、重组疫苗、生物芯片、生物反应器、基因工程抗体、基因治疗与细胞治疗、组织工反应器、基因工程抗体、基因治疗与细胞治疗、组织工程、程、转基因农作物、兽用生物制品、生物技术饲料、转基因农作物、兽用生物制品、生物技术饲料、胚胎移植工程、基因工程微生物农药、环保、胚胎移植工程、基因工程微生物农药、环保、海洋生海洋生物技术，以及现代生物技术对发酵、制药、轻工食品等物技术，以及现代生物技术对发酵、制药、轻工食品等传统产业的改造等领域。传统产业的改造等领域。生物技术在世界各国已经或正在成为新的产业生生物技术在世界各国已经或正在成为新的产业生长点。长点。生物技术（biotechnology):基因工程、细胞工程基因工程技术基因工程技术上游技术（上游技术（upstream）基因工程下游技术下游技术（downstream）蛋白质工程基因工程技术上游技术（upstream）基因工程上游技术（上游技术（upstream）基因工程重组子的构建重组子的构建工程菌的构建及高效表达工程菌的构建及高效表达上游技术（upstream）基因工程基因工程上游技术基本过程n n 选择载体选择载体n n 获得目的基因获得目的基因n n 目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组n n 重组载体的转化重组载体的转化n n 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定基因工程上游技术基本过程 选择载体基因工程技术基因工程技术下游技术下游技术（downstream）蛋白质工程工程菌大规模发酵最佳参数的确定工程菌大规模发酵最佳参数的确定新型生物反应器的研制新型生物反应器的研制高效分离介质及装置的开发高效分离介质及装置的开发分离纯化的优化控制分离纯化的优化控制生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造超滤、反渗透技术的应用超滤、反渗透技术的应用基因工程技术下游技术（downstream）蛋白质工程克隆（克隆（clone）:是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。完全相同的子代群体。基因克隆（基因克隆（gene cloning）:指把一个生物体中的指把一个生物体中的遗传信息（基因片段）通过无性繁殖转人另一个生物体内遗传信息（基因片段）通过无性繁殖转人另一个生物体内的过程。通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，的过程。通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是由于基因就是DNADNA分子，分子，所以也称其为所以也称其为DNADNA克隆。克隆。基因克隆技术基因克隆技术:包括基因的获取、基因的重组、基因的包括基因的获取、基因的重组、基因的克隆化和基因的表达等。克隆化和基因的表达等。DNADNA嵌合体（嵌合体（DNA chimeraDNA chimera）：）：内、外源内、外源DNADNA插入载体插入载体分子所形成的杂合分子（嵌合分子所形成的杂合分子（嵌合DNADNA）。）。重组（重组（recombinationrecombination）：）：构建构建DNADNA嵌合体分子嵌合体分子（重组子）（重组子）的过程。的过程。基因重组（基因重组（gene recombination）:是将不同是将不同基因片段连接起来构成一个新的基因片段连接起来构成一个新的DNADNA分子的过程。分子的过程。克隆（clone）:是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相分子克隆（分子克隆（molecular cloningmolecular cloning）：）：重组体分子的无性重组体分子的无性 繁殖过程。繁殖过程。基因工程基因工程基因工程基因工程（genetic engineeringgenetic engineering）、又称为）、又称为DNADNA重组技重组技 术（术（recombinant DNA techniquerecombinant DNA technique）或分子克隆）或分子克隆（molecular cloningmolecular cloning）:特定基因（被称为目的基因特定基因（被称为目的基因或外源或外源DNADNA片段）的制备、分离、鉴定、改造及其片段）的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间的转移等多项技术。在不同生物间的转移等多项技术。基因操作（基因操作（gene manipulatinggene manipulating）:指所有涉及到指所有涉及到DNADNA或或者者RNARNA操作的技术，或者指所有基因工程和基因工操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术。程相关技术。分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的n n核酸纯化技术核酸纯化技术核酸纯化技术核酸纯化技术n n离心分离技术离心分离技术离心分离技术离心分离技术n n凝胶电泳技术凝胶电泳技术凝胶电泳技术凝胶电泳技术n n核酸定量技术核酸定量技术核酸定量技术核酸定量技术n n分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术n n序列分析技术序列分析技术序列分析技术序列分析技术n n蛋白表达检测纯化技术蛋白表达检测纯化技术蛋白表达检测纯化技术蛋白表达检测纯化技术n n分子生物学实验基本技术分子生物学实验基本技术核酸纯化技术分子生物学实验基本技术一一、核酸纯化技术、核酸纯化技术一、核酸纯化技术原原 理理 1.1.核酸混合物成分核酸混合物成分:结构类：细胞碎片、细胞器、其他结构类：细胞碎片、细胞器、其他 大分子：大分子：DNADNA、RNARNA、ProteinProtein、糖类、脂类等、糖类、脂类等 小分子：氨基酸、小分子糖类和脂类、水、无机物等小分子：氨基酸、小分子糖类和脂类、水、无机物等 2.2.关键关键:DNADNA、RNARNA、ProteinProtein 3.3.方案方案:ProteinProtein变性变性 苯酚：强变性苯酚：强变性 2525 氯仿：弱变性氯仿：弱变性 2424 异戊醇：消泡分层异戊醇：消泡分层 1 1原 理 1.核酸混合物成分:方方 法法样品等体积饱和苯酚10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡离心（12000g）取上清方 法样品等体积饱和苯酚核酸相核酸相核酸相核酸相ProteinProtein变性相变性相变性相变性相有机相有机相有机相有机相医学分子生物学试验基本技术课件 4.4.苯酚的处理：重蒸苯酚的处理：重蒸-饱和饱和-pH-pH 重蒸：去除醌类氧化物重蒸：去除醌类氧化物 饱和：饱和：防止核酸损耗防止核酸损耗 pHpH：pH7.0-8.0-pH7.0-8.0-核酸最适合核酸最适合 方法：蒸馏（方法：蒸馏（183183）0.1%8-0.1%8-羟基喹啉羟基喹啉-收集收集 （棕色瓶）（棕色瓶）-饱和与调饱和与调pH7.8pH7.8（Tris-Tris-HCl pH8.0 HCl pH8.0）-0.2%-0.2%-ME,4-ME,4 或或-20-20 保存保存 8-8-羟基喹啉的作用：减少酚氧化、提供颜色（黄色）指羟基喹啉的作用：减少酚氧化、提供颜色（黄色）指 示、抑制示、抑制RNARNA酶活力、螯合金属离子抑制酶活力、螯合金属离子抑制DNADNA 酶活性、提取酶活性、提取RNARNA时与时与VRCVRC作用使酚由黄变黑。作用使酚由黄变黑。4.苯酚的处理：重蒸-饱和-pH二、二、离心技术离心技术二、离心技术原原 理理离心力：离心力：离心力：离心力：F=F=F=F=2 2 2 2r r r r RCFRCFRCFRCF=F/g=F/g=F/g=F/g=2 2 2 2r/gr/gr/gr/g =（2 N2 N2 N2 N）2 2 2 2r/gr/gr/gr/g =1.11910 =1.11910 =1.11910 =1.11910-5-5-5-5(N)(N)(N)(N)2 2 2 2r r r r g:g:g:g:重力常数（重力常数（重力常数（重力常数（980cm/s980cm/s980cm/s980cm/s2 2 2 2）N:N:N:N:转速（转速（转速（转速（rpmrpmrpmrpm，revolation per minute)revolation per minute)revolation per minute)revolation per minute)N=1000 N=1000 N=1000 N=1000（RCF/11.19r RCF/11.19r RCF/11.19r RCF/11.19r）1/21/21/21/2浮力：浮力：浮力：浮力：K=m-mK=m-mK=m-mK=m-m0 0 0 0/(M:(M:(M:(M:物质质量，物质质量，物质质量，物质质量，：物体密度，：物体密度，：物体密度，：物体密度，0 0 0 0：介质介质介质介质密度）密度）密度）密度）沉降阻力：沉降阻力：沉降阻力：沉降阻力：f(dx/dt)f(dx/dt)f(dx/dt)f(dx/dt)（f:f:f:f:摩擦系数，摩擦系数，摩擦系数，摩擦系数，x x x x：沉降速度，：沉降速度，：沉降速度，：沉降速度，t t t t：沉降时间）沉降时间）沉降时间）沉降时间）RCF=k+f(dx/dt)RCF=k+f(dx/dt)RCF=k+f(dx/dt)RCF=k+f(dx/dt)差速离心差速离心差速离心差速离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心原 理离心力：医学分子生物学试验基本技术课件操操 作作n n离心机分类：普通 6000rpm 高速 10000-25000rpm 超速 30000-80000rpmn n平衡n n温度-离心力-转速n n转头：角转、平转、垂直转操 作离心机分类：普通 6000rpm三、三、凝胶电泳技术凝胶电泳技术三、凝胶电泳技术 概 论 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳电泳.1937 1937年首创纸电泳技术后，电泳的种类和年首创纸电泳技术后，电泳的种类和应用在深度和广度两方面均迅速发展，已成应用在深度和广度两方面均迅速发展，已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。其中，凝胶电泳由于其操作简单、快手段。其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选的标准方法。纯核酸的首选的标准方法。概 论 带电荷的物质在电场中n n电泳法：电泳法：电泳法：电泳法：指带电荷的样品（蛋白质、核酸等）在惰指带电荷的样品（蛋白质、核酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用狭窄的区带，用适宜的检测方法适宜的检测方法适宜的检测方法适宜的检测方法记录其电泳区带图记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。谱或计算其百分含量的方法。n n电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括（有支持体）两大类。前者包括Tise-leasTise-leas式微量电式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。度电泳。区带电泳区带电泳区带电泳区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。原原 理理电泳法：指带电荷的样品（蛋白质、核酸等）在惰性支持介质（如纸凝胶电泳凝胶电泳 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis，PAGEPAGE）普遍用于分离蛋白质及）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等。应用较广，介绍如下：子核酸等。应用较广，介绍如下：凝胶电泳 等电点：等电点：DNA pI=6.0-7.0DNA pI=6.0-7.0 支持介质：琼脂糖、支持介质：琼脂糖、PAPA 分离范围：分离范围：agaroseagarose：100bp100bp60kb60kb PA PA：5 5500bp500bp F=q E F=q E F=6r F=6r F=F,F=F,=q=qE/(E/(6r)6r)泳动率（电泳迁移率）：单位电场强度的泳动速度泳动率（电泳迁移率）：单位电场强度的泳动速度 U=U=/E =q/(6 r)/E =q/(6 r)=(d/t)/(V/L)=(d/t)/(V/L)（cmcm2 2/V/V S S）迁移率迁移率单单位：位：1010-5-5（cmcm2 2/V/V S S）球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成 正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。等电点：DNA pI=6.0-7.0电泳影响因素电泳影响因素 1.1.1.1.样品样品样品样品DNADNADNADNA物理性质物理性质物理性质物理性质 质粒构象：质粒构象：质粒构象：质粒构象：CCCCCCCCL L L L OCOCOCOC 线形：线形：线形：线形：10101010M M M M正比正比正比正比1/U (U:1/U (U:1/U (U:1/U (U:泳动率）泳动率）泳动率）泳动率）2.2.2.2.介质性质介质性质介质性质介质性质 10101010U=U=U=U=10101010U U U U0 0 0 0-K-K-K-Kr r r rT T T T U U U U：泳动率；：泳动率；：泳动率；：泳动率；U U U U0 0 0 0：自由泳动率；：自由泳动率；：自由泳动率；：自由泳动率；KrKrKrKr：介质阻滞系数；：介质阻滞系数；：介质阻滞系数；：介质阻滞系数；T T T T：凝胶浓度。：凝胶浓度。：凝胶浓度。：凝胶浓度。3.3.3.3.电压电压电压电压：5v/cm,5v/cm,5v/cm,5v/cm,电场强度：电场强度：电场强度：电场强度：V/LV/LV/LV/L 4.4.4.4.缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 离子强度：离子强度：离子强度：离子强度：0.020.020.020.020.2(I0.2(I0.2(I0.2(I(CZCZCZCZn n)/2)/2)/2)/2）C C C C：溶液：溶液：溶液：溶液molmolmolmol浓度；浓度；浓度；浓度；Z Z Z Z：化合价；：化合价；：化合价；：化合价；n n n n：原子数目。：原子数目。：原子数目。：原子数目。TAETAETAETAE、TBETBETBETBE、TPETPETPETPE电泳影响因素 1.样品DNA物理性质5.5.5.5.电渗电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（电渗（electro-osmosiselectro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-OH-带负电带负电荷，与纸接触的水溶液因产生荷，与纸接触的水溶液因产生H H3 3O O+，带正电荷移向负极，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。以减少电渗的影响。5.电渗 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度线形线形DNA的最佳分辨范围（的最佳分辨范围（bp）0.5%1,00030,0000.7%800 12,0001.0%500 10,0001.2%400 7,0001.5%200 3,0002.0%50 2,000琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度线形DNA片段长度片段长度Agarose浓度使用浓度使用Marker种类种类200 bp以下以下3%以上以上DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000+15,000100 bp DNA Ladder Marker 200 bp700bp2%3%DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000+15,000100 bp DNA Ladder Marker 700 bp1,500 bp1%2%-EcoT14 I digestDNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000+15,000100 bp DNA Ladder Marker 1,500 bp5,000 bp 0.7%1%-EcoT14 I digestHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000+15,000 5,000 bp以上以上 0.7%以下以下-EcoT14 I digestHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000+15,000 DNA片段长度Agarose浓度使用Marker种类200 医学分子生物学试验基本技术课件四、四、核酸定量技术核酸定量技术四、核酸定量技术原理原理A=A=10101010（1/T1/T1/T1/T）=-log(I/I=-log(I/I=-log(I/I=-log(I/I0 0 0 0)=abcabcabcabc a a a a：消光系数、：消光系数、：消光系数、：消光系数、c c c c：物质浓度、：物质浓度、：物质浓度、：物质浓度、b b b b：介质长度：介质长度：介质长度：介质长度浓度：浓度：dsDNA:1AdsDNA:1AdsDNA:1AdsDNA:1A260260260260=0.05ug/ul=0.05ug/ul=0.05ug/ul=0.05ug/ul ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA和和和和RNA:1ARNA:1ARNA:1ARNA:1A260260260260=0.04ug/ul=0.04ug/ul=0.04ug/ul=0.04ug/ul 引物引物引物引物:1A:1A:1A:1A2602602602600.033ug/ul0.033ug/ul0.033ug/ul0.033ug/ul 寡核苷酸：寡核苷酸：寡核苷酸：寡核苷酸：1A1A1A1A2602602602600.02ug/ul0.02ug/ul0.02ug/ul0.02ug/ul纯度：纯度：A A A A260260260260/A/A/A/A280 280 280 280=1.6=1.6=1.6=1.61.81.81.81.8 A A A A260260260260/A/A/A/A230 230 230 230 2.0 2.0 2.0 2.0 A A A A260260260260/A/A/A/A280 280 280 280 1.7 1.7 1.7 2.0 2.0 2.0 2.0，RNARNARNARNA过高过高过高过高 A A A A260260260260/A/A/A/A280 280 280 280=1.8=1.8=1.8=1.82.0,2.0,2.0,2.0,盐过多盐过多盐过多盐过多原理A=10（1/T）=-log(I/I0)=abc五、分子杂交技术五、分子杂交技术医学分子生物学试验基本技术课件医学分子生物学试验基本技术课件医学分子生物学试验基本技术课件医学分子生物学试验基本技术课件医学分子生物学试验基本技术课件六、六、序列分析技术序列分析技术六、序列分析技术医学分子生物学试验基本技术课件医学分子生物学试验基本技术课件常用常用DNA分子量标准分子量标准常用DNA分子量标准医学分子生物学试验基本技术课件思思 考考 题题 1.1.市售苯酚为什么要饱和与重蒸？市售苯酚为什么要饱和与重蒸？2.2.离心操作应该注意哪些问题？离心操作应该注意哪些问题？3.3.如果要分离如果要分离470bp470bp和和5kb DNA 5kb DNA 应该选择应该选择什么凝胶？什么凝胶？4.4.在在DNADNA定量时，取定量时，取10uL DNA10uL DNA待测液，待测液，用用TE buffer TE buffer 稀释到稀释到100uL 100uL 后，加入到后，加入到 0.5cm0.5cm的石英比色皿中。的石英比色皿中。A A260260测定为测定为 0.210.21，问，问DNADNA待测液的浓度是多少？待测液的浓度是多少？5.5.简述简述DNADNA序列分析的基本原理。序列分析的基本原理。思 考 题 1.市售苯酚为什么要饱和与重蒸？Thank You!