紫外-可见分光光度法培训课件

紫外紫外-可见分光广度法可见分光广度法1 第一节 紫外-可见分光广度法概述l紫外-可见分光广度法：是通过测定被测物质在紫外-可见光区的特定波长处或一定波长范围内的吸光度，对该物质进行定性和定量分析的方法。236l光谱：光被色散后形成的景象，如彩虹。每一种颜色为单色光。1.光有互补性：红绿；黄-蓝；如高锰酸钾、硫酸铜的颜色。2 物质的颜色物质的颜色物质的颜色物质的颜色:即物质的颜色是它所吸收光的互补色。即物质的颜色是它所吸收光的互补色。3 第一节 光的几个物理常数237l波长：指从一个波峰顶到下一个波峰顶的距离。1nm=10-9 m。l频率：每秒钟发出的波的数目。l光速：光在真空中的传播速度2.9979*10-10 cm秒。l光的纯度：单色性，指某单色光的波长区间的范围。宽度越窄越好。4 第一节 紫外-可见分光广度法特点448常用波长的范围：l紫外区：200-400nm；可见区：400-760nml 红外区：2.5-25um涉及仪器；紫外分光光度计、可见分光光度计、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。特点：灵敏度较高，一般可达104106g/ml,最低可测浓度一些情况下107g/ml。准确度一般为0.5，好仪器可达0.2。5 第一节 紫外-可见分光广度法 基本原理448l1、原理：紫外可见吸收光谱由分子中价电子在不同分分子轨道之间子轨道之间跃迁而产生的跃迁而产生的。有单键电子、双键电子和非成键n电子。轨道不同，电子所具有能量不同。l2、有机化合物吸收光谱：*跃迁、跃迁、n *跃迁、跃迁、*跃迁、跃迁、n*跃迁跃迁和电荷迁移跃迁产生。电荷迁移跃迁产生。l3、无机化合物吸收光谱：电荷迁移跃迁及配位场跃迁。电荷迁移跃迁及配位场跃迁。6 基本概念（1）生色团（chromophore）：能在紫外-可见光范围内产生吸收的原子团。l例：CH、CH ；CO；NN 2）助色团（）助色团（auxochrome)：是指含有非键电子的杂原子的饱和基团，当它们与生色团饱和烃相连时，能使吸收峰位置向长波方向的移动，并使吸收强度增大。l例：OH，OR，NH，NR2，X（3）吸吸收收带带（absorption band）：说明吸收峰在紫外可见光谱中的位置。吸收位置取决于分子中生色团和助色团位置。以及共轭情况。并受溶剂效应和PH影响。吸收带可推测化合物结构。7 第一节 Lamber-Beer定律定律449（一）（一）（一）（一）吸收光谱法基本定律吸收光谱法基本定律吸收光谱法基本定律吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与吸光物质液层厚度和浓度的关系描述物质对单色光吸收强弱与吸光物质液层厚度和浓度的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体假设一束平行单色光通过一个吸光物体 8 续前续前吸收度与浓度成简单正比关系吸收度与浓度成简单正比关系透光率与浓度成指数函数关系透光率与浓度成指数函数关系浓度增大一倍，吸收度增大一倍，透光率从浓度增大一倍，吸收度增大一倍，透光率从T降至降至T29 2吸光系数两种表示法：吸光系数两种表示法：450 1）摩尔吸光系数摩尔吸光系数：在一定下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度 2）百分吸光系数百分吸光系数/比吸光系数比吸光系数：在一定下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度 3）两者关系在同一波长下，各组分吸光度具有加和性10 第二节第二节 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 451紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和显示器信号指示系统。11 一、主要部件一、主要部件1光源：光源：2单色器：单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件包括狭缝、准直镜、色散元件 棱镜棱镜对不同波长的光折射率不同对不同波长的光折射率不同色散元件色散元件 分出光波长不等距（长波长密）分出光波长不等距（长波长密）光栅光栅衍射和干涉衍射和干涉 分出光波长等距分出光波长等距钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 3501000nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源 150400nm单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。12 续前续前3吸吸收收池池：为为减减少少光光的的损损失失，吸吸收收池池的的光光学学面面必必须须完完全全垂垂直直于于光束方向光束方向。光学玻璃光学玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区 熔融石英熔融石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区l 要求：匹配性（要求：匹配性（T0.3%（对光的吸收和反射应一致）（对光的吸收和反射应一致）4检测器：检测器：将光信号转变为电信号的装置将光信号转变为电信号的装置5记录装置：讯号处理和显示系统记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电池光电管光电管光电倍增管光电倍增管二极管阵列检测器二极管阵列检测器13 光源 对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。钨灯和卤钨灯可使用的范围在350 2500nm。这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯。它们可在200 400 nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大35倍。14 图示光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。15 二、分光光度仪的类型：二、分光光度仪的类型：1 1单光束分光光度计：单光束分光光度计：单光束分光光度计：单光束分光光度计：特点：使用时来回拉动吸收池 移动误差l对光源要求高l比色池配对l在测量样品前，利用机械装置分别将样品池置入光路，利用电路的补偿装置将吸收度调零；然后将样品溶液置入光路，读出样品溶液的吸收度。l具有较高的信噪比，光学、机械及电子线路结构简单、价格便宜。16 续前续前2双光束分光光度计：双光束分光光度计：特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱 缺点：仪器光路设计要求严格，价格较贵17 （三）仪器的校正1.波长的准确度 通常由于环境因素对机械部分的影响,仪器的波长会变化,使用过一段时间后都要校正测定波长(允差范围:紫外区:+1.0nm,500nm处+2.0nm,700nm处+4.8nm).建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正：低压汞灯检定低压汞灯检定/氘灯486.02nm及656.10nm谱线进行检定/氧化钬玻璃检定及高氯酸钬溶液检定。2.吸收度的校正：重铬酸钾的标准溶液来校正吸光度。3.杂散光检查：截止法，用滤色片或一定浓度的溶液测定其透光率(碘化钾和亚硝酸钠)18 第三节第三节 应用应用239239一、定性分析一、定性分析二、定量分析二、定量分析 定性鉴别定性鉴别纯度检查和杂质限量测定纯度检查和杂质限量测定 单组分的定量方法单组分的定量方法多组分的定量方法多组分的定量方法19 一、定性分析一、定性分析（一）定性鉴别（一）定性鉴别定性鉴别的依据定性鉴别的依据吸收光谱的特征吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度吸收峰的强度相应的吸光系数相应的吸光系数20 吸收光谱（吸收曲线）：吸收光谱（吸收曲线）：以吸光度以吸光度A为纵坐标，波长为纵坐标，波长为横坐标，绘制的为横坐标，绘制的A曲线。曲线。特征：峰峰 曲线上比左右相邻处都高的一处；max 吸收程度最大所对应的（曲线最大峰处的）谷谷 曲线上比左右相邻处都低的一处；min 最低谷所对应的；肩峰肩峰 sh 介于峰与谷之间，形状像肩的弱吸收峰；末端吸收末端吸收 在吸收光谱短波长端所呈现的强吸收而不呈峰形的部分。21 续前续前1对比吸收光谱的一致性对比吸收光谱的一致性239同一测定条件下，波长和浓度一样,与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较2对比吸收光谱的特征值：比较最大对比吸收光谱的特征值：比较最大吸收及吸收系数的一致性。吸收及吸收系数的一致性。22 续前续前3对比吸光度或吸光系数的比值的一致性：对比吸光度或吸光系数的比值的一致性：例：例：药典中采用此法鉴别不同的化合物：化合物中不只一个吸收峰，可在不同吸收峰处（或峰与谷）测得吸收度的比值。不受浓度和厚度的影响，所比较的是物质的特性。23 续前续前（二）纯度检查和杂质限量测定1纯度检查（杂质检查）纯度检查（杂质检查）1 1）峰位不重叠：）峰位不重叠：找找使主成分无吸收，杂质有吸收使主成分无吸收，杂质有吸收直接考察杂质含量直接考察杂质含量 如如乙乙醇醇和和环环己己烷烷中中含含少少量量苯苯，苯苯在在256nm256nm处处有有吸吸收收，而而乙醇和环己烷在此波长无吸收。（乙醇和环己烷在此波长无吸收。（0.0010.001）2 2）峰位重叠：）峰位重叠：主成分强吸收，杂质无吸收主成分强吸收，杂质无吸收 /弱吸收弱吸收与纯品比较，与纯品比较，EE 杂质强吸收杂质强吸收 主成分吸收主成分吸收与纯品比较，与纯品比较，EE，光谱变形，光谱变形24 续前续前2杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质肾上腺酮含量计算 2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，310nm下测定 规定 A3100.05(在310nm处的百分吸光系数为435)即符合要求的杂质限量0.06%25 例子：用峰谷吸收度比值控制杂质的限量例子：用峰谷吸收度比值控制杂质的限量 碘解磷定杂质有：顺式异构体、中间体等，在碘解磷定最大吸收波长294nm处无吸收，但在其吸收谷262nm处有吸收,利用峰谷吸收度比值作为杂志的限量检查。纯品碘解磷定A294/A262=3.39 如有杂质，其值小于3.39，标准规定吸收度比值应在3.313.39范围内。26 二、定量分析二、定量分析（一）单组分的定量方法1吸光系数法 2标准曲线法 3对照法：外标一点法27 续前续前1吸光系数法吸光系数法:在规定波长处测定吸光度在规定波长处测定吸光度,再用吸收再用吸收系数进行计算系数进行计算.(通常大于通常大于100)28 练练习习例：维生素B12 的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度（见书P209例1）解：29 练习练习例2：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，在361nm处的百分吸光系数为207，求B12的百分含量？解：30 练习练习例3：解：31 续前续前2标准曲线法标准曲线法32 示例示例 芦丁含量测定0.710mg/25mL0.710mg/25mL33 续前续前3对照法：外标一点法对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的注：当样品溶液与标准品溶液的 稀释倍数相同时稀释倍数相同时34 练习练习例：维生素B12的含量测定 精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100g/mL）解1 1）对照法）对照法 35 练习练习2）吸光系数法 36 第五节 注意事项l1.试验中使用的量瓶、移液管均应经检定校正，洗净后使用。l2.使用的吸收池必须洁净。用于盛装样品、参比或空白溶液的吸收池，当装入同一溶剂时，在规定的波长处测定吸收池的透光率，透光率相差0.3%以下者方可配对使用，否则必须加以校正。37 续前续前3.取吸收池时，手指拿毛玻璃的两侧。装样品溶液的体积以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在吸收池的透光面，可先用蘸有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干防尘保存，吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3：1，v/v）混合液稍加浸泡后，洗净备用。如用铬酸钾清洗时，吸收池不宜在清洗液中长时间浸泡，否则清洗液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。38 续前续前4.含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定供试品前，应先检查所用溶剂在供试品所用波长附近是否符合要求，可用1cn石英吸收池盛溶剂以空气为空白（即参比光路中不放置任何物质）测定其吸收度，应符合下表规定，并不得在溶剂的截止使用波长以下测定。39 续前续前下表 以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定波长范围（nm）220240241250 251300 300以上 吸光度 0.40.2 0.1 0.05 40 续前续前每次测定时就采用同一厂牌批号，混合均匀的同批溶剂。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此，测定供试品的吸光度后应减去空白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。5.称量应按中国药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少。含量测定供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应取2份。吸收系娄检查也应取供拭品2份，平等操作。每份结果对平均值的偏差应在0.5%以内。鉴别或检查项可取供试品1份。6.供试品溶液的深度，除各该品种项下已有注明外，供试品溶液的吸光度以在0.30.7之间为宜，吸光度读数在此范围误差较小，并还应结合所用仪器的吸光度线性范围，配制合适的浓度。41 续前续前7.选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带半高宽的10%，否则测得的吸光度值会偏低，或以减小狭缝宽度时供品溶液的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外规定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但当吸收带的半高宽小于20nm时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素及钠的吸光度检查需用1nm缝宽或更窄，否则其264nm的吸光度会偏低。8.测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰士2nm处，再测几点的吸光度，或由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长，除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长士2nm以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。42 续前续前9.用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的pH值是否一致，如pH值对吸收有影响，则应调溶液的pH值一致后再测定吸光度。43 结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日