琼脂糖凝胶电泳示意图课件

琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳示意泳示意图课图课件件1 血红蛋白含有四条肽链血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个每条肽链环绕一个亚亚铁血红素基团，铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。血血红红蛋白含有四条蛋白含有四条肽链肽链,每条每条肽链环绕肽链环绕一个一个亚铁亚铁血血红红素基素基团团2 鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白取血红蛋白鸡的红细胞鸡的红细胞人人的红细胞的红细胞 鸡鸡的的红细红细胞具有胞具有细细胞核，含有胞核，含有DNA，便于，便于进进行行DN3(一一)蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理一一.基础知识基础知识根据蛋白质各种特性的差异：根据蛋白质各种特性的差异：分子的形状、大小分子的形状、大小电荷性质和多少电荷性质和多少溶解度溶解度 吸附性质吸附性质对其他分子亲和力对其他分子亲和力 (一一)蛋白蛋白质质分离和提取的原理一分离和提取的原理一.基基础础知知识识根据蛋白根据蛋白质质各种特性的各种特性的4（二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法凝胶色谱法：凝胶色谱法：又称分配色谱法又称分配色谱法电泳法电泳法（二）蛋白（二）蛋白质质提取和分离的方法凝胶色提取和分离的方法凝胶色谱谱法：又称分配色法：又称分配色谱谱法法51.1.凝胶色谱法凝胶色谱法2 2）材料：凝胶）材料：凝胶(分配色谱法分配色谱法)1 1）概念）概念 根据根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质分离蛋白质的有效方法的有效方法 凝胶是凝胶是微小的多孔性球体微小的多孔性球体，多糖类多糖类化合物化合物如如葡聚糖或琼脂糖葡聚糖或琼脂糖。内部有许多。内部有许多贯穿的贯穿的通道通道。1.凝胶色凝胶色谱谱法法2）材料：凝胶）材料：凝胶(分配色分配色谱谱法法)1）概念）概念 6 3 3）凝胶色谱法的原理）凝胶色谱法的原理分子筛效应分子筛效应 大分子大分子大分子大分子通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的间隙间隙间隙间隙，路程，路程，路程，路程短短短短，流动，流动，流动，流动快快快快；小分子小分子小分子小分子穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的内部内部内部内部，路程，路程，路程，路程长长长长，流动，流动，流动，流动慢慢慢慢。3）凝胶色）凝胶色谱谱法的原理法的原理分子分子筛筛效效应应 大分子通大分子通过过多孔多孔74 4）分离过程）分离过程 混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。白质分子的差速流动。4）分离）分离过过程程 混合物洗大分子流混合物洗大分子流动动快收快收 集收集收 集集 洗脱洗脱8琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳示意泳示意图课图课件件92.2.电泳电泳1)1)概念概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2.电电泳泳1)概念概念带电带电粒子在粒子在电场电场作用下作用下发发生迁移的生迁移的过过程程10琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图2)2)原理原理 分离样品中各种分子分离样品中各种分子带电性质的差异带电性质的差异以及以及分子大分子大小，形状的不同小，形状的不同，使带电分子使带电分子产生不同的迁移速产生不同的迁移速度度，从而实现样品中各种分子的分离。从而实现样品中各种分子的分离。琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳示意泳示意图图2)原理原理 分离分离样样品中各种分子品中各种分子带电带电性性质质的差的差113)3)类型类型:琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳4)4)实例：实例：SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳用途用途:测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度原理：原理：SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合复合物，物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量质分子原有电荷量。使电泳。使电泳迁移率完全取迁移率完全取决于分子的大小。决于分子的大小。3)类类型型:琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳4)实实例：例：SDS聚丙稀聚丙稀酰酰胺凝胶胺凝胶电电12讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用白质的分子量时，可选用一组已知分子量的一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的，根据已知分子量的标准蛋白的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定未知蛋，可以测定未知蛋白质的分子量。白质的分子量。讨论讨论：如何：如何测测定蛋白定蛋白质质的分子量？的分子量？使用使用SDS聚丙聚丙烯烯13琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳示意泳示意图课图课件件14(三三)缓冲溶液缓冲溶液 抵制外界的酸或碱对溶液抵制外界的酸或碱对溶液pHpH值的影值的影响，维持响，维持pHpH基本不变基本不变1.1.作用作用如如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4 说出人体血液中缓冲液说出人体血液中缓冲液?(三三)缓缓冲溶液冲溶液 抵制外界的酸或碱抵制外界的酸或碱对对溶液溶液pH值值的影响的影响152.2.配制配制 通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以就可以制得在不同制得在不同PHPH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。3 3.提问提问：在本课题中使用的缓冲液是：在本课题中使用的缓冲液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液2.配制配制 通常由通常由12种种缓缓冲冲剂剂溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。调调16二二.实验操作实验操作(1)(1)(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤(2)(2)(2)(2)血红蛋白的血红蛋白的血红蛋白的血红蛋白的释放释放释放释放(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定透析透析除去分子较小的杂质除去分子较小的杂质通过通过凝胶色谱法凝胶色谱法将分子量将分子量较大的杂质蛋白质除去较大的杂质蛋白质除去通过通过聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度跳转跳转二二.实验实验操作操作(1)红细红细胞的洗胞的洗涤涤(2)血血红红蛋白的蛋白的释释放放(3)分离分离17红细胞红细胞1.1.洗涤红细胞洗涤红细胞阅读思考：阅读思考：阅读思考：阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？洗涤过程：洗涤过程：洗涤过程：洗涤过程：血液血液100mL100mL低速离心低速离心2 min2 min红细胞红细胞血血 浆浆5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠吸出血浆吸出血浆重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色红细红细胞胞1.洗洗涤红细涤红细胞胞阅读阅读思考：洗思考：洗涤涤的目的是什么？洗的目的是什么？洗涤过涤过程：血程：血182.2.释放血红蛋白释放血红蛋白阅读思考：阅读思考：1.1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入2.2.了哪些物质？了哪些物质？3.3.2.2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：1.1.蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。2.2.加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3.3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂2.释释放血放血红红蛋白蛋白阅读阅读思考：目的分析：使思考：目的分析：使红细红细胞大量吸水胞大量吸水胀胀裂溶解裂溶解193.分离血红蛋白分离血红蛋白红细胞破红细胞破碎混合液碎混合液高速离心高速离心10min（无色透明无色透明无色透明无色透明）（白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体）（红色透明液体红色透明液体红色透明液体红色透明液体）（暗红色）暗红色）暗红色）暗红色）用滤纸过滤，除去脂溶用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下中静置片刻后，分出下层的层的红色透明液体。红色透明液体。3.分离血分离血红红蛋白蛋白红细红细胞破高速离心（无色透明）（白色薄胞破高速离心（无色透明）（白色薄层层固体）固体）20粗分离粗分离透析透析除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质过程过程透析目的透析目的20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL粗分离粗分离透析除去透析除去样样品中分子量品中分子量较较小的小的杂质杂质过过程程透析目的透析目的2021纯化纯化凝胶色谱法凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱纯纯化化凝胶色凝胶色谱谱法法1.凝胶色凝胶色谱谱柱的制作柱的制作2.凝胶色凝胶色谱谱柱的装填柱的装填322注意事项注意事项1.1.红细胞的洗涤：红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.2.凝胶的预处理：凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3.3.色谱柱的装填：色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。脱液不能断流。4.4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。为什么？为什么？注意事注意事项项1.红细红细胞的洗胞的洗涤涤：为为什么？什么？23