葡萄糖氧化酶-生物化学与分子生物学课件

实验专题模块一实验专题模块一 血糖和血糖的血糖和血糖的调节调节血清葡萄糖测定血清葡萄糖测定 糖化血清蛋白（果糖胺）测定糖化血清蛋白（果糖胺）测定实验专题模块一 血糖和血糖的调节血清葡萄糖测定 生化实验室守则 请同学们仔细阅读生化实验室守则，并注意遵守。生化实验室守则 请同学们仔细阅读生化实验微量移液器的使用微量移液器的使用 1.选择合适的移液器。选择合适的移液器。2.吸头安装。吸头安装。3.容量设定。容量设定。4.预洗吸头：在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需预洗吸头：在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需要转移的液体吸取、排放两到三次。要转移的液体吸取、排放两到三次。5.吸液：先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直进入液面，吸液：先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直进入液面，浸入的深度为：浸入的深度为：P2、P10小于或等于小于或等于1毫米，毫米，P20、P100、P200小于或小于或等于等于2毫米，毫米，P1000小于或等于小于或等于3毫米，毫米，P5ml、P10ml小于或等于小于或等于4毫米，毫米，平稳松开按钮，切记不能过快。平稳松开按钮，切记不能过快。6.放液：放液时，吸头紧贴容器壁，先将移液器排放按钮按至第一停放液：放液时，吸头紧贴容器壁，先将移液器排放按钮按至第一停点，略做停顿后，再按至第二停点。点，略做停顿后，再按至第二停点。7.卸去吸头：用过的吸头如果不用了，可以用拇指按住移液器顶端的卸去吸头：用过的吸头如果不用了，可以用拇指按住移液器顶端的另一个按钮，把枪头打掉。另一个按钮，把枪头打掉。8.移液器容量复原：使用完毕，把枪调到最大量程，这样有利于枪的移液器容量复原：使用完毕，把枪调到最大量程，这样有利于枪的保养。保养。微量移液器的使用 葡萄糖氧化酶-生物化学与分子生物学课件葡萄糖氧化酶-生物化学与分子生物学课件葡萄糖氧化酶-生物化学与分子生物学课件p糖尿病是由于胰岛素分泌不足或糖尿病是由于胰岛素分泌不足或/和胰岛素作用低下而引起的代谢紊和胰岛素作用低下而引起的代谢紊乱综合征，高血糖是其最主要特征。根据病因，糖尿病可分为不同类乱综合征，高血糖是其最主要特征。根据病因，糖尿病可分为不同类型，主要包括型，主要包括1型、型、2型、其他特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病等。型、其他特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病等。p最近最近30年我国糖尿病患病率急速增长，约增长了年我国糖尿病患病率急速增长，约增长了15倍倍,成为世界第一成为世界第一糖尿病大国。中国最新流行病学调查显示，糖尿病大国。中国最新流行病学调查显示，2型糖尿病在成年人高度型糖尿病在成年人高度流行，年龄标化的总糖尿病患病率为流行，年龄标化的总糖尿病患病率为9.7%。p正常血糖是空腹静脉血浆葡萄糖正常血糖是空腹静脉血浆葡萄糖7.00mmol/L和餐后和餐后2小时血糖小时血糖11.10mmol/L即为糖尿病。即为糖尿病。p糖化血清蛋白（果糖胺）测定可反映糖尿病患者抽血前糖化血清蛋白（果糖胺）测定可反映糖尿病患者抽血前2-3周内血糖周内血糖总的水平，亦为糖尿病病人近期监测指标，正常值为总的水平，亦为糖尿病病人近期监测指标，正常值为1.72.8mmol/L。pHbA1c测定可反映糖尿病患者抽血前测定可反映糖尿病患者抽血前812周的血糖控制情况，病情周的血糖控制情况，病情控制不良的糖尿病病人其控制不良的糖尿病病人其HbA1c较正常人高，且与病情控制不良程度较正常人高，且与病情控制不良程度相关，正常值为相关，正常值为6.5%。p血浆胰岛素和血浆胰岛素和C肽测定有助于了解胰岛肽测定有助于了解胰岛B细胞功能和指导治疗，空腹细胞功能和指导治疗，空腹血浆胰岛素正常值为血浆胰岛素正常值为515mU/L，正常人血浆基础，正常人血浆基础C肽水平肽水平300600pmol/L。糖尿病糖尿病糖尿病是由于胰岛素分泌不足或/和胰岛素作用低下而引起的代谢紊实验一实验一 血清葡萄糖测定血清葡萄糖测定 一、实验目的 1.掌握血糖的基本知识及空腹血糖、餐后血糖检测在糖尿病诊疗中的应用。2.掌握葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖浓度的原理与操作过程。实验一 血清葡萄糖测定 二、背景与原理（一）背景 应用酶学方法测定血液葡萄糖是临床化学中的主流方法。最常用的酶学方法有葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。其特点是具有较高的灵敏度、准确度和精密度，使用温和的反应条件，操作简单方便，适用于自动分析仪。己糖激酶法：己糖激酶法：第一步是在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸；第二步是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下，葡萄糖-6-磷酸和NAD或NADP发生氧化还原反应，生成6-磷酸葡萄糖酸和NADH或NADPH。在波长340nm处，监测吸光度的增高。吸光度的净增高值与葡萄糖浓度成正比。己糖激酶方法和葡萄糖氧化酶方法相比对葡萄糖的特异性更高，不受尿酸和抗坏血酸的干扰，特别适用于急诊检验使用。二、背景与原理 葡萄糖氧化酶：葡萄糖氧化酶：本法分极谱分析法和比色法两类。但二者的初反应都是在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，同时消耗溶液中的氧，产生过氧化氢。极谱分析法是用氧电极监测溶液中氧的消耗量，氧的消耗量与葡萄糖浓度成正比。比色分析法是用葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的偶联反应系统。初始反应中过氧化氢的生成量与葡萄糖浓度成正比。在辣根过氧化物酶进行比色测定。该法的缺点是易受还原性物质如胆红素、抗坏血酸和尿素等干扰，但准确度与精密度都能达到临床要求，操作简便，是目前临床推荐常规检验的方法。葡萄糖氧化酶：本法分极谱分析法和比色法两类。但二者的初反应都（二）原理（二）原理 1.葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸（D-葡萄糖酸-内酯），并产生一分子过氧化氢。2.在色原性受体（4-氨基安替比林偶氮酚）的存在下，过氧化物酶（POD）可将过氧化氢分解为水和氧，并使4-氨基安替比林和酚去氢缩合成红色醌亚胺，即Trinder反应。红色的醌类化合物生成量与葡萄糖含量成正比。其反应如下：2葡萄糖+2H2O+O2 2葡萄糖酸+2H2O22H2O2+4-氨基安替比林+酚 醌亚胺+4H2O醌亚胺在480550nm波长有最大吸收，与同样处理的标准液比较，经计算可求出血浆葡萄糖含量。GODPOD（二）原理 GODPOD四、四、实验操作实验操作 1.准备健康成年家兔三只（每个实验班），常规饲养。2.将三只家兔固定在兔盒上，割破耳沿静脉并留取对照血液1-2ml，凝固后分离出血清备用【血清分离：待凝固后（约20-30分钟），30005000rpm，离心510分钟，将上清转移至另一离心管中】。3.按2U/kg体重给第一只兔子注射胰岛素，然后用采血管分别在注射后45分钟和90分钟等时间点，割破家兔耳朵血管，留取家兔血液各1-2ml，分离出血清后备用。4.按0.4ml/kg体重给第二只兔子注射0.1%的肾上腺素，然后用采血管分别在注射后30分钟和60分钟等时间点，割破家兔耳朵血管，留取家兔血液各1-2ml，分离出血清后备用。四、实验操作 5.第三只兔子的处理：先按2U/kg体重给兔子注射胰岛素，45分钟后割破家兔耳朵血管，留取血液1-2ml；马上按0.4ml/kg体重给予注射0.1%的肾上腺素，30分钟后留取血液1-2ml。以上血液均分离出血清备用。（以下实验中，整个实验班以6人/组分组，在各个组中，每两个人负责一只兔子的样品检测）。6.氧化酶法测定血糖：取试管，做好标注后，按下表进行操作：加入物加入物(ml)测定管定管 标准管准管空白管空白管血清（以上各实验组获得）0.0200葡萄糖标准应用液 00.020蒸馏水000.02酶酚混合试剂 2.02.02.05.第三只兔子的处理：先按2U/kg体重给兔子注射胰岛素，混匀后，置于37水浴箱中，恒温水浴15分钟。然后用722型分光光度计，波长505nm，以空白管调零，分别读取标准管和测定管吸光度，并按以下公式计算结果：血清葡萄糖（mmol/L）=（测定管吸光度/标准管吸光度）标准液浓度标准液浓度 7.并将所测得的结果记录在实验记录本上，每只兔子的实验数据处理完后，以时间为横坐标，血糖浓度为纵坐标作曲线图。分析胰岛素和肾上腺素对血糖的影响。混匀后，置于37水浴箱中，恒温水浴15分钟。然后用722型实验二实验二 糖化血清蛋白（果糖胺）测定糖化血清蛋白（果糖胺）测定一、实验目的一、实验目的 1.掌握糖化血清蛋白（果糖胺）检测在糖尿病诊疗中的应用。2.了解NBT底物法检测糖化血清蛋白（果糖胺）的原理与操作。实验二 糖化血清蛋白（果糖胺）测定二、背景与原理二、背景与原理（一）背景（一）背景糖化血清蛋白（果糖胺）是血清蛋白质与葡萄糖非酶糖化过程中形成的高分子酮胺结构，类似果糖胺的物质，又被称为血清果糖胺。其生成量与血糖浓度相关，并相对保持稳定，它的测定结果的高低却不受抽血时血糖浓度的影响。由于人血清果糖胺的代谢周期与血清蛋白相同，半衰期为1720天，在23周内发生代谢变化，故果糖胺可以反映糖尿病患者检测前23周内的平均血糖水平，是评价糖尿病控制情况的一个良好指标，尤其是对血糖波动较大的脆性糖尿病及妊娠糖尿病，了解其平均血糖水平有实际意义。血清果糖胺正常值为1.642.64mmol/L，血浆中果糖胺较血清低0.3mmol/L。二、背景与原理（二）原理 血清葡萄糖能与白蛋白及其他血清蛋白分子N-末端的氨基发生非酶促糖化反应，形成高分子酮胺结构。此酮胺结构能在碱性环境中与硝基四氮唑蓝（NBT）发生还原反应，生成有色物质甲撍，与1-脱氧-1-吗啉果糖（DMF）为标准参照物进行比色测定，颜色深浅与血糖浓度成正比。（二）原理NBT底物法检测糖化血清蛋白（果糖胺）操作步骤底物法检测糖化血清蛋白（果糖胺）操作步骤 加入物加入物(ml)样品管样品管 校准品管校准品管 空白管空白管血清 0.05 标准品 0.05 蒸馏水 0.05 试剂 1.0 1.0 1.0 1.混匀，立即在分光光度计上进行检测（先用空白管在波长540nm处调零），并启动计时表。2.三分种后，记录起始吸光度，然后每隔一分钟记录一次，共三分钟（为什么？）。3.计算出平均A/min。4.计算:果糖胺的含量=（A/min 样品/A/min 校准品）校准品浓度NBT底物法检测糖化血清蛋白（果糖胺）操作步骤 加入物(m课堂分组讨论课堂分组讨论 我学院负责卫生的王阿姨今年48岁，平时体健。近半年来不明原因消瘦，饭量变大，同时睡到半夜常常感到口干，需要起来喝水，尿量也有不同程度增多，并且尿中有很多泡沫，觉得体力也不如以前。近一个月来在工作过程中不小心弄破手、足皮肤时常出现感染不易愈合，看东西也没有以前清楚，感觉模糊（还总是怀疑是否老花眼）。（1）如果你是王阿姨的接诊医生，根据王阿姨的情况，你会建议做什么检查？（2）如果王阿姨确诊是型糖尿病，请你分析为什么会出现伤口易感染不易愈合、看东西模糊不清。课堂分组讨论