细胞生物学检测技术课件

第五章第五章 细胞生细胞生物学检测技术物学检测技术1医学资料内容掌握各种细胞形态观察法的原理与操作方法掌握MTT方法的原理与操作方法熟悉免疫细胞化学检测技术的原理与操作方法了解放射性掺入法和流式细胞法的原理与应用2医学资料第一节第一节 细胞形态观察技术细胞形态观察技术自20世纪建立细胞培养技术以来，培养技术和培养基成分不断改进，已经广泛用于现代生物学研究和生产的各个领域，如形态研究、医学领域、兽医研究、遗传研究、生物制药等。利用细胞培养可以在体外研究药物作用机理、有效剂量，对细胞形态结构、生理机能和代谢的影响。本章用于以细胞为载体的研究中，通过观察细胞形态和机能变化，为判断效应分子的作用，提供依据。3医学资料细细胞胞是是生生物物体体的的基基本本结结构构单单位位。构构成成生生物物机机体体的的细细胞胞是是多多种种多多样样，且且体体型型微微小小，要要对对细细胞胞进进行行研研究究，需需借借助助显显微微镜镜的的成成像像及及放放大大原原理理，在在显显微微镜镜下下，才才能能观观察察到到细细胞胞的的基基本本形形态态结结构构。通通过过观观察察形形态可以检测药物对细胞的作用。态可以检测药物对细胞的作用。细细胞胞可可直直接接观观察察、染染色色观观察察；可可用用光光镜镜、荧荧光光显显微微镜镜法法和和电电镜镜法法等等观察。观察。常见的观察方法有：常见的观察方法有：第一节第一节 细胞形态观察技术细胞形态观察技术4医学资料一、显微镜直接观察显微镜是观察细胞形态结构的主要工具，按照光源不同，分为光学显微镜（可见光/紫外光）和电子显微镜（电子束）。（一）、光学显微镜1、相差显微镜（PCM）1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。f应用：观察未经染色的标本和活细胞。5医学资料6医学资料7医学资料操作步骤：1、打开光源 调整相差聚光器的位置和物镜放大倍数。目镜换成普通望远镜，使视野中2个大小一样的光环重合。2、观察瓶皿准备 表面搽干净，放入目镜台。3、调光 调节光强度、光轴，使视野照明均匀。4、调焦与摄影 使视野图像最清晰，拍照。观察时以观察目镜为准，照相以摄影目镜为准。8医学资料f一种介壳虫的染色体（PCM照片）9医学资料2、荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。10医学资料11医学资料f荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）12医学资料3、激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜）可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。13医学资料14医学资料LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管15医学资料4、暗视野显微镜 使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。16医学资料17医学资料5、偏光显微镜偏光显微镜 是是研研究究具具双双折折射射性性物物质质的的主主要要仪仪器器，如如纤纤维维、染染色色体体和和透透明明矿矿物物等等。与与一一般般的的生生物物显显微微镜镜相相比比，最最主主要要的的区区别别是是有有两两个个偏偏光光镜镜。其其中中，一一个个安安装装在在载载物物台台之之下下，称称下下偏偏光光，另另一一个个安安装装在在载载物物台台之之上上的的镜镜筒筒中中，称称上上偏偏光光。在在偏偏光光显显微微镜镜中中，上上偏偏光光的的振振动动方方向向是是固固定定的的，而而下下偏偏光光的的振振动动方方向向是是可可以以调调节节的的。一一般般来来说说，两两个个偏光的振动方向是相互垂直的。偏光的振动方向是相互垂直的。18医学资料偏光显微镜19医学资料镜臂、镜筒、镜座、反光镜、下偏光镜、锁光圈、聚光镜、载物台、物镜、目镜、上偏光镜、勃氏镜、粗调螺丝、细调螺丝、附件等 f偏光显微镜的构造1、目镜，2、镜筒，3、勃氏镜，4、粗动手轮，5、微调手轮，6、镜臂，7、镜座，8、上偏光镜，9、试板孔，10、物镜，11、载物台，12、聚光镜，13、锁光圈，14、下偏光镜，15、反光镜20医学资料6、微分干涉差显微镜（DIC显微镜）1952年，日本的Nomarski发明。能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。21医学资料尼康E800荧光DIC显微镜22医学资料DIC显微镜下的硅藻 23医学资料7、倒置显微镜inversemicroscopef物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。24医学资料8、当代显微镜的发展趋势f采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。f自动化与电子化。25医学资料（二）、活细胞染色方法染色为便于观察1、中性红染色使用0.01%浓度，高压灭菌后暗处保存。活细胞红色；死细胞无色。2、结晶紫染色使用0.1%浓度，对死活细胞均着色。可用于总细胞计数。26医学资料3、台盼蓝染色法、台盼蓝染色法f制备单个细胞悬液：制备单个细胞悬液：10105 510106 6mlmlf0.4%0.4%台台盼盼蓝蓝染染色色1 1 min min(9(9滴滴细细胞胞悬悬液液1 1滴滴0.4%0.4%台台盼盼蓝蓝)，3min 3min 内计数内计数f用用血血细细胞胞计计数数板板镜镜下下分分别别计计数数活活细细胞胞（染染料料拒拒染染）和和死死细细胞（呈淡蓝色）胞（呈淡蓝色）f计算细胞活力：计算细胞活力：活活细细胞胞率率（）活活细细胞胞数数（活活细细胞胞数数死死细细胞胞数数）10010027医学资料28医学资料二、细胞固定观察法固固定定法法是是以以一一定定的的化化学学物物质质的的溶溶液液（有有时时是是气气体体）在在尽尽可可能能保保持持细细胞胞生生活活结结构构的的情情况况下下迅迅速速杀杀死死组组织织块块，这这一一过过程程称称为为固固定定（fixationfixation）。然然后后制制成成薄薄片片，在在染染色色（stainingstaining）进进行行观观察察。这这种种方方法法比比起起观观察察活活细细胞胞有有三三个个优优点点：第第一一，它它能能清清楚楚地地显显现现细细胞胞的的细细微微构构造造，如如关关于于染染色色体体，各各种种细细胞胞器器、细细胞胞膜膜和和细细胞胞壁壁的的微微细细构构造造都都是是靠靠这这种种方方法法阐阐明明的的。第第二二，这这种种方方法法的的制制片片一一般般均均能能保保存存很很久久，便便于于前前后后研研究究各各种种现现象象之之比比较较。第第三三，应应用用范范围围广广，几乎可用于所有的组织细胞。几乎可用于所有的组织细胞。包括固定和染色包括固定和染色2 2个过程。个过程。29医学资料（一）细胞固定的基本方法无论什么方法培养的细胞，都能固定、染色。其中以盖片培养固定最常见。操作方法：1、培养皿/板的孔里放盖玻片。2、加一定浓度的培养基和细胞，细胞长满玻片后取出，洗净。3、悬浮培养的细胞，先离心收集细胞，洗净，涂片。4、固定 固定液有甲醇-醋酸，甲醛-酒精-醋酸，Carnoy（卡偌氏）液等多种。固定15min即可染色。30医学资料（二）、染色1、HE染色f苏木素（Hematoxylin）伊红（Eosin）染色法，简称HE染色法。fHE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。该染色过程既有化学反应，又有物理作用参与。从化学反应看，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。从物理现象看，主要有吸附、吸收之说。HE染色提供良好的核浆对比染色，是细胞化学染色最常用的一种方法。31医学资料试剂：固定液：常用95乙醇和冰丙酮 苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1盐酸。系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。培养瓶、培养皿、眼科镊、盖玻片、载玻片、显微镜。32医学资料操作步骤：样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1105/ml，滴加于盖玻片上（置于6孔板中），培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。样品固定：95乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。染核：苏木素染液染色23min，自来水洗涤。分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。吹干或自然晾干细胞爬片后，中性树胶封片。若细胞用4多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。33医学资料34医学资料2、姬母萨染色（GiemsaGiemsa Stain Stain）常用于细胞和染色体染色。核染成蓝紫色。胞浆粉红色。-染料配制 -细胞固定 -染色 10-15min -洗涤，风干，透明，封片，镜检。（三）、特殊染色法荧光法，免疫酶法，氨基黑法，银染法，Feulgen法，瑞氏染色法等。35医学资料三、电子显微镜1、透射电子显微镜（TEM）透射电子显微镜的成像基本原理透射电子显微镜的成像基本原理 在在真真空空条条件件下下，电电子子束束经经高高压压加加速速后后，穿穿透透样样品品时时形形成成散散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。目前TEM的分辨力可达0.2nm。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。36医学资料37医学资料38医学资料39医学资料40医学资料2扫描电子显微镜（SEM）扫描电子显微镜（SEM），可用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。41医学资料42医学资料f SEM制片技术f固定 脱水及临界点干燥 装样 f样品包被 观察f固定：组织培养细胞 戊二醛；大块组织 f戊二醛四氧化铒（鸡尾酒固定法）f包被：喷镀金属膜，使其在电子束的激发下，释放次级电子。43医学资料44医学资料疟疾破坏的两个红细胞45医学资料4 扫描隧道显微镜（STM）1981年发明，获1986年诺贝尔物理学奖。可用来显示晶体表面原子布阵。固态、液态和气态三态 物质均可进行观察，能直接观察生物大分子的原子布阵，也能观察一些生物结构的原子排列，有助于把生物学研究推进到纳米科学水平。能观察气、液、固态的物质。分辨率0.1-0.2(横向)0.001nm(纵向)3 扫描透射电子显微镜（STEM）是唯一不需要染色、固定而能够直接观测单个生物分子的仪器。世界上仅有几台。46医学资料第二节第二节 细胞活性检测技术细胞活性检测技术检测受试物对细胞的影响。广泛用于药物筛选、药理、毒理实验。一、细胞计数法细胞培养中最基础技术，用细胞技术板和显微镜。47医学资料操操作作步步骤骤 1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液染色后吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细 胞 数/ml 4大 格 细 胞 总 数/4稀 释 倍 数 104注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。48医学资料49医学资料2、MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，再用酶标仪测定OD值fMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。50医学资料操作步骤 a.100L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。b.培养24h后，加药，设六个平行样。c.给药72h后，加入0.5mg/mL的MTT液(50L)；继续培养4h。d.吸出孔内培养液后（也可不吸出），加入10%SDS-HCl(100L),2h，然后微孔板扳荡器上振荡10分钟。e.酶标仪检测各孔OD值(检测波长570nm)抑制率=(1-给药组平均OD/对照组平均OD)100%51医学资料MTT影响因素：MTT保存 避光，冷藏。4细胞浓度（数量）105-7个/mlMTT使用浓度MTT的酶裂解时间 2.5-3h。pH 偏酸酚红与血清 浓度不能高。酚红570nm吸光，蛋白变形不透光，都干扰检测。设立空白、对照。吸光度应在0-0.7之间才是直线关系。52医学资料三、3H-TdR(嘧啶核苷酸)掺入法略53医学资料MTT MTT 特点：不使用放射性核素，特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 测定步骤类似测定步骤类似与同位素掺入法相比与同位素掺入法相比掺入物：掺入物：MTTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同培养时间不同54医学资料第三节第三节 免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术一、细胞标本制作（一）细胞制备方法1、实体组织细胞制备1）机械法 剪切、网搓、研磨和撕碎。2）酶法 胰酶等消化3）化学法 将细胞间起粘连作用的钙镁离子去掉，使细胞分散。EDTA，柠檬酸等。55医学资料2、脱落细胞样品的单细胞制备体内自然脱落细胞样本检测。1）涂片/抹片 面拭子洗脱于Buffer离心洗涤涂片2）渗出液、冲洗液 静沉去上清离心洗涤涂片（二）细胞爬片1、玻片准备 大小，洁净，灭菌2、细胞爬片 玻片置培养孔（皿）加细胞培养至合适密度固定染色（三）、细胞涂片56医学资料二、细胞固定同前三、细胞染色过程同石蜡切片。四、影响因素1、酶消化 浓度和时间。2、固定 甲醛固定导致抗原决定簇的封闭，如要用免疫检测方法，需做抗原修复。3、操作过程要防脱片，细胞膨胀，破碎等。57医学资料 对对机机体体参参与与免免疫疫应应答答的的细细胞胞进进行行鉴鉴定定,计计数数及及功功能能测定测定 (一一)细胞计数细胞计数1.1.荧光抗体染色荧光抗体染色2.2.免疫酶染色技术免疫酶染色技术:*ABC:*ABC法法*APAAPAPAAP法法3.3.免疫金银染色法免疫金银染色法(IGSS)(IGSS)4 4免疫细胞化学法免疫细胞化学法5 5四聚体法四聚体法6 6TCRTCR 链测定链测定四、免疫细胞的检测58医学资料f(二二)免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定f 1.1.T T细细胞胞功功能能测测定定：肿肿瘤瘤，病病毒毒感感染染，免免疫缺陷，自身免疫病等疫缺陷，自身免疫病等f (1)(1)细细胞胞增增殖殖(转转化化)试试验验：可可分分为为非非特特异异性性丝裂原和特异性抗原两类。丝裂原和特异性抗原两类。f *丝裂原主要有丝裂原主要有PHAPHA、ConCon A A和和PWMPWM；f *抗抗原原刺刺激激物物有有破破伤伤风风类类毒毒素素、PPDPPD和和白白色色念念珠菌等；珠菌等；f *同种同种MHCMHC及抗及抗CD3CD3单抗等单抗等f *肿瘤细胞肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养自体淋巴细胞混合培养f (2)(2)T T细胞介导的细胞毒试验：细胞介导的细胞毒试验：CTLCTLf (3)(3)分泌功能检测分泌功能检测f (4)(4)T T细胞功能的体内检测法细胞功能的体内检测法 f *接接触触性性超超敏敏反反应应*移移植植物物抗抗宿宿主主反反应应(GVHR)(GVHR)*迟发型超敏反应迟发型超敏反应(DTH)(DTH)59医学资料f2.B2.B细胞功能判定细胞功能判定f(1)B(1)B细胞增殖细胞增殖(转化转化)试验：试验：f*PWMPWM、SACSAC，LPSLPS（对小鼠对小鼠B B细胞）；细胞）；f*抗抗IgMIgM抗体及抗体及EBEB病毒等病毒等f(2)(2)溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验f(3)(3)反向溶血空斑试验反向溶血空斑试验f(4)(4)酶酶联联免免疫疫斑斑点点法法(ELISPOT):ELISPOTELISPOT):ELISPOT是是一一种种可可检检测测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。f*此法的主要优点是此法的主要优点是:f稳定、特异，且抗原用量少；稳定、特异，且抗原用量少；f可可同同时时检检测测不不同同抗抗原原诱诱导导的的抗抗体体分分泌泌，并并可可定定量量测测定；定；f可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。60医学资料f3.3.NKNK细胞活性测定细胞活性测定f 体体外外检检测测NKNK细细胞胞活活性性的的方方法法有有形形态态学学检检查查法法，放放射射性性核核素素释释放放法法，酶酶释释放放法法，化化学学发发光光法法及及流流式式细细胞胞术术等等。测测定定人人NKNK细细胞胞活活性性常常以以K562K562细细胞胞株株作作为为靶靶细细胞，测定小鼠胞，测定小鼠NKNK细胞活性常用细胞活性常用YACYAC1 1 细胞为靶细胞。细胞为靶细胞。f (1)(1)形态学检查法形态学检查法f (2)(2)放放射射性性核核素素释释放放法法：用用放放射射性性核核素素(5151CrCr、125125I I UdRUdR)标记靶细胞。标记靶细胞。f (3)3)酶酶释释放放法法：测测定定靶靶细细胞胞膜膜受受损损后后从从胞胞浆浆内内释释放放至介质中的乳酸脱氢酶至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)LDH)活性。活性。f*NAGNAG酶酶荧荧光光比比色色法法:NAGNAG酶酶是是细细胞胞浆浆中中存存在在的的一一种种溶溶酶酶体体酶酶,与与其其底底物物作作用用后后,生生成成荧荧光光产产物物,应应用用荧荧光光分分光光光光度度计计测测定定，敏敏感感性性明明显显高高于于LDHLDH比比色色法法。而而且且方方法法简简单单，结果稳定，重复性好。结果稳定，重复性好。61医学资料f(4)(4)化学发光法化学发光法f(5)(5)流流式式细细胞胞术术：应应用用FCMFCM检检测测NKNK细细胞胞活活性性是是根根据据PIPI染染料料排排斥斥法法。PIPI渗渗入入死死亡亡细细胞胞内内与与DNADNA和和RNARNA结结合合，在在488488nmnm波波长长激激发发下下产产生生绿绿色色荧荧光光。此此法法既既可可以以测测定定单单个个细细胞胞毒毒活活性性，也也可可以以用于总细胞毒活性试验。用于总细胞毒活性试验。f*还还可可利利用用荧荧光光染染料料法法,细细胞胞光光扫扫描描法法，双双标标记记细细胞胞毒毒法法测测定定细胞毒性细胞的杀伤效应。细胞毒性细胞的杀伤效应。62医学资料f 4 4吞噬细胞功能测定吞噬细胞功能测定f(1)(1)中中性性粒粒细细胞胞趋趋化化功功能能测测定定：一一般般采采用用滤滤膜膜渗渗透透法法(BoydenBoyden小小室法室法)或琼脂糖平板法。或琼脂糖平板法。f(2)(2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定f1)1)显微镜检法显微镜检法f2)NBT2)NBT试试验验：此此项项试试验验是是测测定定中中性性粒粒细细胞胞吞吞噬噬、杀杀菌菌功功能能的的一一种简易方法。种简易方法。f3)3)化化学学发发光光测测定定法法：中中性性粒粒细细胞胞在在吞吞噬噬过过程程中中出出现现呼呼吸吸爆爆发发,产产生生活活性性氧氧代代谢谢产产物物。此此类类活活性性氧氧化化基基团团与与细细胞胞内内杀杀菌菌作作用用密密切相关，同时又能激发细胞内某些物质产生化学发光。切相关，同时又能激发细胞内某些物质产生化学发光。63医学资料f(4)(4)巨巨噬噬细细胞胞细细胞胞毒毒测测定定:通通常常取取小小鼠鼠腹腹腔腔巨巨噬噬细细胞胞，以以-干干扰扰素素为为激激活活剂剂使使其其活活化化，作作为为效效应应细细胞胞。用用125125I-UdRI-UdR标标记记的的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815作为靶细胞。作为靶细胞。f(3)(3)巨巨噬噬细细胞胞吞吞噬噬功功能能测测定定：中中药药斑斑蝥蝥酒酒精精浸浸液液敷敷贴贴法法诱诱发发无无菌菌性性皮皮炎炎，从从皮皮肤肤水水泡泡渗渗出出液液中中收收集集巨巨噬噬细细胞胞，在在体体外外进进行行鸡鸡红红细细胞胞吞吞噬噬试试验验，计计算算吞吞噬噬率率和和吞吞噬噬指指数数，作作为为判判断断巨巨噬噬细细胞胞吞吞噬功能的指标。噬功能的指标。64医学资料第四章第四章 流式细胞技术流式细胞技术 1970年后发明的技术方法。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。65医学资料66医学资料FACSCalibur特点：特点：光路调节系统固定光路调节系统固定自动化程度高自动化程度高操作简便操作简便使用寿命长使用寿命长配备配备1-21-2根激光根激光细胞分选速度慢，细胞分选速度慢，细胞分选速度慢，细胞分选速度慢，主要用于细胞分析主要用于细胞分析主要用于细胞分析主要用于细胞分析临床型（台式机）临床型（台式机）67医学资料FACSVantageDiVa科研型（大型机）特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选68医学资料流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理光学系统 激光光源 光收集系统液流系统 流动室 液流驱动系统电子系统 光电转换 数据处理系统细胞分选系统69医学资料 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。和膜分子的表达情况。1 1分离和培养待检细胞分离和培养待检细胞 2 2细胞固定细胞固定 3 3封闭非特异性结合位点封闭非特异性结合位点 4 4染色与分析染色与分析 基本步骤基本步骤70医学资料使用流式细胞分析法，可以：使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1Th1细胞细胞 IFN-IFN-Th2 Th2细胞细胞 IL-4IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态态71医学资料72医学资料第六章第六章 生物芯片检测技术生物芯片检测技术掌握基因芯片和蛋白质芯片的原理和应用了解其操作过程。73医学资料生物芯片（Biochips）是90年代中期发展起来的一项尖端技术。它以玻片，硅为载体，在单位面积上高密度地排列大量的生物材料，从而达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。它有时也被称为基因芯片、DNA芯片或微阵列（Microarrays）。其概念来源于计算机芯片，它们的外形也有几分相似。生物芯片种类很多，有基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室、细胞芯片、组织芯片等。目前，基因芯片和芯片实验室作为生物芯片的代表，已经走出实验室，开始产业化了。74医学资料广义的生物芯片指一切采用生物技术制备或应用于生物技术的微处理器。狭义的生物芯片就是微阵列，包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。75医学资料第一节第一节 基因芯片检测技术基因芯片检测技术基因芯片的核心原理与Southern blot和Northern blot相同，只是相反将各种探针固化到基质上，用以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质的变化。76医学资料酵母整个基因组基因芯片77医学资料1 样品制备2 DNA提取3 荧光标记4 分子杂交5 信号检测6 点阵分析78医学资料 DNA芯片样品制备系统DNA样品的提取纯化DNA样品的PCR扩增探针的合成与标记等79医学资料芯片成品80医学资料基因芯片微 点 阵制备系统81医学资料基因芯片荧光侦测仪 高密度微点阵检测扫描系统82医学资料第二节第二节 蛋白质芯片检测技术蛋白质芯片检测技术蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列,蛋白质芯片是一种新型的生物芯片,是由固定于不同种类支持介质上的抗原或抗体微阵列组成,阵列中固定分子的位置及组成是以知的,用标记(荧光物质,酶或化学发光物质等标记)的抗体或抗原与芯片上的探针进行反应,然后通过特定的扫描装置进行检测,结果由计算机分析处理。83医学资料生物芯片的应用1、基因表达水平的检测基因表达水平的检测2、基因诊断基因诊断 3、药物筛选药物筛选4、个体化医疗个体化医疗5、测序测序6、生物信息学研究生物信息学研究 在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。84医学资料谢 谢85医学资料