酶的提取和分离纯化课件

Chapter 3 The Extraction,Separation and Purification of Enzyme酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化Chapter 3 The Extraction,S补充：发酵液的预处理补充：发酵液的预处理固液分离固液分离（1）菌种）菌种（2）培养基）培养基（3）无机离子的去除）无机离子的去除（4）杂蛋白质的去除）杂蛋白质的去除（5）色素及其他物质的去除）色素及其他物质的去除 主要方法是离心分离和过滤主要方法是离心分离和过滤补补充：充：发发酵液的酵液的预处预处理理 固液固液Contents of chapter 31、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取(重点)4、酶的分离方法(重点)5、酶的组合分离纯化策略6、酶的浓缩、干燥与结晶Contents of chapter 31、酶酶的提取与分离的提取与分离3.13.1酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。结晶分离等。3.1 酶酶的提取、分离的提取、分离纯纯化技化技术术路路线细线细胞破碎胞破碎酶酶提取提取动动物、植物物、植物3.23.2细胞破碎细胞破碎 许许多多酶酶存存在在于于细细胞胞内内。为为了了提提取取这这些些胞胞内内酶酶，首首先先需需要要对对细细胞胞进进行破碎处理。行破碎处理。(1)(1)机械破碎机械破碎 (2)(2)物理破碎物理破碎 (3)(3)化学破碎化学破碎 (4)(4)酶解破碎酶解破碎JY92-II D超超声声波波细胞粉碎机胞粉碎机细胞破碎珠胞破碎珠高高压细胞破碎机胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃玻璃匀匀浆机机3.2 细细胞破碎胞破碎 许许多多酶酶存在于存在于细细胞内。胞内。为为了提取了提取这这些胞内些胞内酶酶微生微生物物 革兰氏阳性细革兰氏阳性细菌菌 革兰氏阴性革兰氏阴性细菌细菌 放线放线菌菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 壁厚壁厚/nm 15 50 10 13 同同G+100 300 100 250 层次层次 单层单层 多层多层 多层多层 多层多层 主要主要组成组成 肽聚糖肽聚糖(40%90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1%2%)肽聚糖肽聚糖(5%10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11%22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30%40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)几丁质几丁质(1%2%)蛋白质蛋白质(6%8%)脂类脂类(8.5%13.5%)多聚糖多聚糖(80%90%)脂类脂类蛋白质蛋白质 v各种微生物细胞壁的结构与组成各种微生物细胞壁的结构与组成 微生物微生物 革革兰兰氏阳性氏阳性细细菌菌 革革兰兰氏阴性氏阴性细细菌菌 放放线线菌菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌v细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：表面活性剂表面活性剂酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过通过机械运动机械运动产生的剪切力，使产生的剪切力，使组织、细胞破碎。组织、细胞破碎。通过各种通过各种物理因素物理因素的作用，使的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。而使细胞破碎。通过各种通过各种化学试剂化学试剂对细胞膜的作对细胞膜的作用，而使细胞破碎用，而使细胞破碎通过通过细胞本身的酶系或外加酶制细胞本身的酶系或外加酶制剂剂的催化作用，使细胞外层结构的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎受到破坏，而达到细胞破碎细细胞破碎方法及其原理机械破碎胞破碎方法及其原理机械破碎捣捣碎法物理破碎温度差破碎法化学破碎法物理破碎温度差破碎法化学破细胞细胞 声波声波 机械机械 渗透渗透压压 温度差温度差动植物动植物 +革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 +革兰氏阳性芽孢菌革兰氏阳性芽孢菌 +酵母酵母 +革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌 +-+菌丝菌丝 -+-+孢子孢子 -v细胞对破碎方法的敏感性细胞对破碎方法的敏感性细细胞胞 声波声波 机械机械 3.33.3酶的提取酶的提取v定义定义 指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中酶充分溶解到溶剂或溶液中的的过程。过程。v目标目标 将目的酶最大限度地溶解出来将目的酶最大限度地溶解出来 保持生物活性保持生物活性v原则原则 根据根据酶的结构酶的结构和和溶解性质溶解性质，选择适当的溶剂。，选择适当的溶剂。3.3 酶酶的提取定的提取定义义3.33.3酶的提取酶的提取v方法方法提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.5mol/L盐溶液盐溶液提取在提取在低浓度盐溶液低浓度盐溶液中溶中溶解度较大的酶解度较大的酶酸溶液提取酸溶液提取pH26水溶液水溶液提取在提取在稀酸溶液稀酸溶液中溶解度中溶解度大，且稳定性较好的酶大，且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取pH812水溶液水溶液提取在提取在稀碱溶液稀碱溶液中溶解度中溶解度大且稳定性较好的酶大且稳定性较好的酶有机溶剂提取有机溶剂提取与水混溶的有机与水混溶的有机溶剂溶剂提取提取与脂质结合牢固或含与脂质结合牢固或含有较多非极性基团有较多非极性基团的酶的酶3.3 酶酶的提取方法提取方法使用的溶的提取方法提取方法使用的溶剂剂或溶液提取或溶液提取对对象象盐盐溶液提溶液提在低浓度的盐存在的在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增随盐浓度的升高而增加，这称为加，这称为盐溶现象盐溶现象。在盐浓度达到某一界在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，盐浓度升高而降低，这称为这称为盐析现象盐析现象。在低在低浓浓度的度的盐盐存在的条件下，存在的条件下，酶酶的溶解度随的溶解度随盐浓盐浓度的升高而增加，度的升高而增加，这这3.33.3酶的提取酶的提取v影响因素影响因素主要影响因素：酶在所使用的溶剂中的主要影响因素：酶在所使用的溶剂中的溶解度溶解度 酶向溶剂相中酶向溶剂相中扩散速度扩散速度 另外：另外：温度温度-适当提高温度适当提高温度 pH值值-避开酶的等电点避开酶的等电点 提取液体积提取液体积-为原料体积的为原料体积的35倍，分几次提取倍，分几次提取 适当搅拌、适当延长提取时间、适当加入保护剂适当搅拌、适当延长提取时间、适当加入保护剂3.3 酶酶的提取影响因素适当的提取影响因素适当搅搅拌、适当延拌、适当延长长提取提取时间时间、适当加入、适当加入3.43.4酶的分离方法酶的分离方法3.4.1 3.4.1 沉淀分离沉淀分离3.4.2 3.4.2 离心分离离心分离3.4.3 3.4.3 过滤与膜分离过滤与膜分离3.4.4 3.4.4 层析分离层析分离3.4.5 3.4.5 电泳分离电泳分离3.4.6 3.4.6 萃取分离萃取分离3.4 酶酶的分离方法的分离方法3.4.1 沉淀分离沉淀分离3.4.13.4.1沉淀分离沉淀分离v定义定义 是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的的溶解度降低溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质它溶质分离分离的技术过程。的技术过程。分离分离降低酶的溶解度降低酶的溶解度酶、杂质酶、杂质改变条件、添加物质改变条件、添加物质3.4.1 沉淀分离定沉淀分离定义义分离降低分离降低酶酶的溶解度的溶解度酶酶、杂质杂质改改变变条件条件3.4.13.4.1沉淀分离沉淀分离v机理机理沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理盐析沉淀法盐析沉淀法不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，的特性，通过通过在酶液中添加一定浓度的中性盐在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶，使酶或杂质从溶液中析出沉淀液中析出沉淀等电点沉淀法等电点沉淀法两性电解质在等电点时溶解度最低两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的调节溶液的pHpH值值，使酶或杂质沉淀析出使酶或杂质沉淀析出有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过，通过添加一添加一定量的某种有机溶剂定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，使酶或杂质沉淀析出，复合沉淀法复合沉淀法在酶液中在酶液中加入某些物质加入某些物质，使它，使它与酶形成复合物与酶形成复合物而沉淀下而沉淀下来来选择性变性沉选择性变性沉淀法淀法选择一定的条件使选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而，而不影响所需的酶不影响所需的酶3.4.1 沉淀分离机理沉淀分离方法分离原理沉淀分离机理沉淀分离方法分离原理盐盐析沉淀法不同析沉淀法不同3.4.13.4.1沉淀分离沉淀分离v盐析沉淀法盐析沉淀法 盐浓度（中性盐）盐浓度（中性盐）离子强度离子强度 饱和度饱和度 温度温度-室温室温 pH-欲分离酶的等电点欲分离酶的等电点Ks分段盐析、分段盐析、分段盐析分段盐析3.4.1 沉淀分离沉淀分离盐盐析沉淀法析沉淀法 盐盐3.4.13.4.1沉淀分离沉淀分离v等电点沉淀法等电点沉淀法 等电点沉淀法往往等电点沉淀法往往与其它方法一起使用与其它方法一起使用。在加酸或加碱调节在加酸或加碱调节pH值的过程中，值的过程中，要要一边搅拌一边慢慢加进一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或，以防止局部过酸或过碱而引起的酶变性失活。过碱而引起的酶变性失活。3.4.1 沉淀分离等沉淀分离等电电点沉淀法点沉淀法3.4.13.4.1沉淀分离沉淀分离v有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 有机溶剂的存在会使溶液的有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低介电常数降低。常用的有机溶剂常用的有机溶剂有有乙醇、丙酮、异丙醇、甲乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇醇 用量用量一般为酶液体积的一般为酶液体积的2倍倍左右左右 分离效果分离效果受到溶液受到溶液pH值值的影响，一般应将酶的影响，一般应将酶液的液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。值调节到欲分离酶的等电点附近。3.4.1 沉淀分离有机溶沉淀分离有机溶剂剂沉淀法沉淀法 常用的有机常用的有机3.4.13.4.1沉淀分离沉淀分离v复合沉淀法复合沉淀法 常用的复合沉淀剂有常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸烯酸等高分子聚合物。等高分子聚合物。v选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法 加热、改变加热、改变pH值、加进某些金属离子，值、加进某些金属离子，使使杂蛋白变性沉淀除去。杂蛋白变性沉淀除去。对对欲欲分分离离的的酶酶以以及及酶酶液液中中的的杂杂蛋蛋白白等等杂杂质质的的种种类类，含含量量及及其其物物化化性性质质有有比比较较全全面面的的了了解解。3.4.1 沉淀分离复合沉淀法沉淀分离复合沉淀法3.4.23.4.2离心分离离心分离v定义定义 是是借借助助于于离离心心机机旋旋转转所所产产生生的的离离心心力力，使使不不同同大大小小、不同密度不同密度的物质分离的技术过程。的物质分离的技术过程。v依据依据 要根据欲分离物质以及杂质的要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和颗粒大小、密度和特性特性的不同，选择适当的的不同，选择适当的离心机、离心方法和离离心机、离心方法和离心条件心条件。3.4.2 离心分离定离心分离定义义1 1、离心机、离心机v常速离心机（低速离心机）常速离心机（低速离心机）最大转速最大转速8000 r/min，相对离心力（，相对离心力（RCF）1104 g 以下以下 用于用于细胞、细胞碎片和培养基残渣细胞、细胞碎片和培养基残渣等等固形物固形物的分离，的分离，酶的酶的结晶结晶等等较大颗粒较大颗粒的分离。的分离。v高速离心机高速离心机 最大转速最大转速（12.5）104 r/min，RCF 1104105 g 用于用于沉淀、细胞碎片和细胞器沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。等的分离。高速冷冻离心机高速冷冻离心机v超速离心机超速离心机 最大转速最大转速(2.512)104 r/min，RCF 5105 g甚至更高甚至更高。用于用于DNA、RNA、蛋白质等蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒生物大分子以及细胞器、病毒等等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。测定等。1、离心机常速离心机（低速离心机）高速离心机超速离心机、离心机常速离心机（低速离心机）高速离心机超速离心机2 2、离心方法、离心方法v常速离心机和高速离心机常速离心机和高速离心机 由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好择好离心速度和离心时间离心速度和离心时间，就能达到分离效果；，就能达到分离效果；如如果果希希望望从从样样品品液液中中分分离离出出2种种以以上上大大小小和和密密度度不不同的颗粒，需要采用同的颗粒，需要采用差速离心差速离心方法。方法。v超速离心超速离心 根据需要采用根据需要采用差速离心、密度梯度离心差速离心、密度梯度离心或或等密梯等密梯度离心度离心等方法。等方法。2、离心方法、离心方法 常速离心机和高速离心机常速离心机和高速离心机酶酶的提取和分离的提取和分离纯纯化化课课件件酶酶的提取和分离的提取和分离纯纯化化课课件件3 3、离心条件、离心条件v离心力（或离心速度）离心力（或离心速度）低速离心低速离心一般可以用一般可以用离心速度离心速度，即转子每分钟的转数，即转子每分钟的转数表示。表示。高速离心高速离心，特别是超速离心时，往往以，特别是超速离心时，往往以相对离心力（相对离心力（RCF）表示。表示。v离心时间离心时间 沉降时间沉降时间 v温度和温度和pH值值离心温度一般控制在离心温度一般控制在4左右左右 pH值必须是处于酶稳定的值必须是处于酶稳定的pH值范围内，必要时可以值范围内，必要时可以采用采用缓冲溶液缓冲溶液。3、离心条件、离心条件 离心力（或离心速度）离心力（或离心速度）3.4.33.4.3过滤与膜分离过滤与膜分离v定义定义 是借助于是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。分离的技术过程。v介质介质 滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜高分子膜过滤过滤非膜过滤：非膜过滤：采用高分子膜以外的物质采用高分子膜以外的物质作为过滤介质作为过滤介质 膜过滤：膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质采用各种高分子膜为过滤介质 3.4.3 过滤过滤与膜分离定与膜分离定义过滤义过滤非膜非膜过滤过滤：采用高分子膜以外：采用高分子膜以外3.4.33.4.3过滤与膜分离过滤与膜分离v过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性-根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同类别类别截留颗粒大小截留颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 2 2mm酵母、霉菌、动物细胞、酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等植物细胞、固形物等滤纸、滤布、滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、纤维多孔陶瓷、烧结金属等烧结金属等微滤微滤0.20.22 2mm细菌、灰细菌、灰 尘等尘等微滤膜、微孔微滤膜、微孔陶瓷陶瓷超滤超滤20200.2m0.2m病毒、生物大分子病毒、生物大分子超滤膜超滤膜反渗透反渗透 20 20生物小分子、盐、离子生物小分子、盐、离子 反渗透膜反渗透膜3.4.3 过滤过滤与膜分离与膜分离过滤过滤的分的分类类及其特性及其特性-根据根据过滤过滤介介质质截截3.4.33.4.3过滤与膜分离过滤与膜分离v膜分离技术膜分离技术 定义：定义：借助于一定孔径的借助于一定孔径的高分子薄膜高分子薄膜，将不同大小、，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术技术 介质：介质：丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物分子聚合物膜分离膜分离加压膜分离加压膜分离 微滤、微滤、超滤、反渗透超滤、反渗透电场膜分离电场膜分离 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离扩散膜分离 透析透析3.4.3 过滤过滤与膜分离膜分离技与膜分离膜分离技术术膜分离加膜分离加压压膜分离膜分离 微微滤滤、补充补充1 1：四种常用膜分离技术的基本特征：四种常用膜分离技术的基本特征补补充充1：四种常用膜分离技：四种常用膜分离技术术的基本特征的基本特征补充补充2 2：四种常用膜分离过程的截留特性：四种常用膜分离过程的截留特性补补充充2：四种常用膜分离：四种常用膜分离过过程的截留特性程的截留特性3.4.43.4.4层析分离层析分离（色谱技术）（色谱技术）v定义定义 是一种是一种物理物理的分离方法，利用混合物中各组分的的分离方法，利用混合物中各组分的物理物理化学性质的差别化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相，使各组分以不同程度分布在两个相中。中。其中一个相为固定的其中一个相为固定的(称为称为固定相固定相)，另一个相则流过，另一个相则流过此固定相此固定相(称为称为流动相流动相)并使各组分以不同速度移动，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。从而达到分离。3.4.4 层层析分离（色析分离（色谱谱技技术术）定）定义义3.4.43.4.4层析分离层析分离v基本原理：基本原理：3.4.4 层层析分离基本原理：析分离基本原理：3.4.43.4.4层析分离层析分离v方法：方法：层析方法层析方法分离依据分离依据吸附层析吸附层析吸附剂对不同物质的吸附剂对不同物质的吸附力吸附力不同而使混合物中各组分分离不同而使混合物中各组分分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使各组分分离不同，而使各组分分离离子交换层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和亲和力力不同而达到分离目的不同而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分相对分子质量子质量不同而达到物质分离不同而达到物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力专一而又可逆的亲和力，使生，使生物分子分离纯化物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的将酶等两性物质的等电点特性等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离实现组分分离3.4.4 层层析分离方法：析分离方法：层层析方法分离依据吸附析方法分离依据吸附层层析吸附析吸附剂剂1 1、吸附层析、吸附层析v定义定义 利用吸附剂对利用吸附剂对不同物质不同物质的的吸附力吸附力不同而使混合物不同而使混合物中各组分分离的方法中各组分分离的方法。1、吸附、吸附层层析定析定义义1 1、吸附层析、吸附层析v洗脱方法洗脱方法 溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法v过程过程 层析时层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。入洗脱剂解吸洗脱。洗脱时洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。再解吸、再吸附的过程。1、吸附、吸附层层析洗脱方法析洗脱方法过过程程2 2、分配层析、分配层析v定义定义 利用各组分在两相中的利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使不同，而使各组分分离的方法。各组分分离的方法。分配系数分配系数一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。固定相固定相一种一种多孔性固体支持物多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种）吸着一种溶剂溶剂。流动相流动相另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动。动。2、分配、分配层层析定析定义义2 2、分配层析、分配层析v 过程过程 当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的质在两相之间进行连续的动态分配动态分配。v类型类型 纸上层析纸上层析 分配薄层层析分配薄层层析2、分配、分配层层析析 过过程程3 3、离子交换层析、离子交换层析v定义定义 是利用是利用离子交换剂离子交换剂上的上的可解离基团（活性基团可解离基团（活性基团）对）对各种离子各种离子的的亲和力亲和力不同不同而达到分离目的的而达到分离目的的一种层析分离方法。一种层析分离方法。3、离子交、离子交换层换层析定析定义义酶酶的提取和分离的提取和分离纯纯化化课课件件3 3、离子交换层析、离子交换层析v类型类型离子交换剂离子交换剂(活性基团的性质活性基团的性质)阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂 由于酶分子具有由于酶分子具有两性性质两性性质，所以可用阳离子，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。3、离子交、离子交换层换层析析类类型离子交型离子交换剂换剂阳离子交阳离子交换剂换剂阴离子交阴离子交换剂换剂 4 4、凝胶层析、凝胶层析（凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析）凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析）v定义定义 指以各种多孔凝胶为指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相固定相，利用流动相中所含各种组分的中所含各种组分的相相对分子质量不同对分子质量不同而达而达到物质分离的一种层到物质分离的一种层析技术。析技术。4、凝胶、凝胶层层析（凝胶析（凝胶过滤过滤，分子排阻，分子排阻层层析，分子析，分子筛层筛层析）定析）定义义4 4、凝胶层析、凝胶层析v 过程过程 混合溶液中各组分按照相对分子质量混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的由大到小的顺序顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。先后流出层析柱，而达到分离的目的。v常用的凝胶：常用的凝胶：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶4、凝胶、凝胶层层析析 过过程程5 5、亲和层析、亲和层析v定义定义 是利用是利用生物分子生物分子与与配基之间配基之间所具有的专一而又可逆的所具有的专一而又可逆的亲亲和力和力，而使生物分子分离纯，而使生物分子分离纯化的技术。化的技术。5、亲亲和和层层析定析定义义v原理原理5、亲和层析、亲和层析原理原理5、亲亲和和层层析析5 5、亲和层析、亲和层析v类型类型 根据欲分离组分与配基的结合特性根据欲分离组分与配基的结合特性,可分为：可分为：共价亲和层析共价亲和层析 疏水层析疏水层析 金属离子亲和层析金属离子亲和层析 免疫亲和层析免疫亲和层析 染料亲和层析染料亲和层析 凝集素亲和层析凝集素亲和层析5、亲亲和和层层析析类类型型3.4.53.4.5电泳分离电泳分离v定义定义 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电极移动的过程称为电泳。v影响因素影响因素移动速度移动速度本身所带的净电荷量本身所带的净电荷量颗粒形状和颗粒大小颗粒形状和颗粒大小电场强度电场强度溶液溶液pH值值离子强度离子强度支持体的特性支持体的特性3.4.5 电电泳分离定泳分离定义义移移动动速度本身所速度本身所带带的的净电净电荷量荷量颗颗粒形状粒形状3.4.53.4.5电泳分离电泳分离v类型类型 按其使用的按其使用的支持体的不同支持体的不同，可以分为：，可以分为：纸电泳纸电泳 薄层电泳薄层电泳 薄膜电泳薄膜电泳 凝胶电泳凝胶电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳3.4.5 电电泳分离泳分离类类型型3.4.63.4.6萃取分离萃取分离v定义定义 是利用物质在两相中的是利用物质在两相中的溶解度不同溶解度不同而使其分而使其分离的技术。离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相，有时也可采用其它流体。相，有时也可采用其它流体。3.4.6 萃取分离定萃取分离定义义3.4.63.4.6萃取分离萃取分离v类型类型 按照两相的组成不同，萃取可以分为：按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取有机溶剂萃取 双水相萃取双水相萃取 超临界萃取超临界萃取 反胶束萃取反胶束萃取3.4.6 萃取分离萃取分离类类型型双双水水相相萃萃取取双双超超临临界界萃萃取取超超v 纯化方案的设计纯化方案的设计 纯化方法的选择依据纯化方法的选择依据根据根据有效成分和杂质有效成分和杂质之间理化性质的之间理化性质的差异差异 纯化方法的排序纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。选用。3.53.5酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略 纯纯化方案的化方案的设计设计3.5 酶酶的的组组合分离合分离纯纯化策略化策略3.3.5 酶的分离方法酶的分离方法v注意注意（1）各种酶的纯化方法都有其固有的优缺点）各种酶的纯化方法都有其固有的优缺点 在设计某一酶的纯化线路时，应考虑各种因素对选在设计某一酶的纯化线路时，应考虑各种因素对选用的用的纯化方法纯化方法及及先后次序先后次序的影响。的影响。（2）初步纯化初步纯化（rough fractionation）除去与目的产物性质差异很大的杂质。除去与目的产物性质差异很大的杂质。（3）高度纯化高度纯化（fine fractionation）（精制）（精制）除去与产物性质相似的杂质。除去与产物性质相似的杂质。3.5 酶酶的分离方法注意的分离方法注意(1)(1)粗酶粗酶:采样采样 均质打破细胞均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以；可以粗略去除蛋白质以外的物质。外的物质。纯度纯度1%1%(2)(2)部分纯化部分纯化 :初步的纯化，使用各钟初步的纯化，使用各钟 色谱层析法色谱层析法。纯度纯度50%-90%50%-90%(3)(3)均质酶蛋白均质酶蛋白 :目标酶的进一步精制纯化，可用目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳制备式电泳 或或 HPLCHPLC。纯度纯度99%99%v分离纯化不同阶段分离纯化不同阶段(1)粗粗酶酶:采采样样 均均质质打破打破细细胞胞 抽出全蛋白，多抽出全蛋白，多3.53.5酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略3.5 酶酶的的组组合分离合分离纯纯化策略化策略3.53.5酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略v纯化方法的基本要求纯化方法的基本要求3.5 酶酶的的组组合分离合分离纯纯化策略化策略纯纯化方法的基本要求化方法的基本要求3.53.5酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略v纯化方案的评价纯化方案的评价（1）酶活力）酶活力酶催化某一化学反应的能力。酶催化某一化学反应的能力。一般用一般用单位时单位时间内产物生成的量间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率来表示酶催化的反应速率。（2）比活力）比活力=活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白 比活力越高，酶纯度也越好。比活力越高，酶纯度也越好。表示酶制剂纯度的一个指标。表示酶制剂纯度的一个指标。3.5 酶酶的的组组合分离合分离纯纯化策略化策略纯纯化方案的化方案的评评价价3.53.5酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略v纯化方案的评价纯化方案的评价（3）提纯倍数与回收率）提纯倍数与回收率 回收率：反映酶的损失情况。回收率：反映酶的损失情况。提纯倍数：表示方法的有效程度。提纯倍数：表示方法的有效程度。一个好的纯化步骤是一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也回收率较高，提纯倍数也较大。较大。3.5 酶酶的的组组合分离合分离纯纯化策略化策略纯纯化方案的化方案的评评价价酶酶的提取和分离的提取和分离纯纯化化课课件件酶酶的提取和分离的提取和分离纯纯化化课课件件3.63.6酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶 浓缩与干燥都是浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离酶与溶剂（通常是水）分离的过的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。结晶是结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，的过程，是酶分离纯化的一种手段。是酶分离纯化的一种手段。3.6 酶酶的的浓缩浓缩、干燥与、干燥与结结晶晶 浓缩浓缩与干燥都与干燥都3.6.13.6.1结晶结晶v定义定义 是溶质以是溶质以晶体形式晶体形式从溶液中析出的过程。从溶液中析出的过程。v要求要求 酶在结晶之前酶在结晶之前达到一定的达到一定的纯度纯度；酶在结晶时酶在结晶时达到一定的达到一定的浓度浓度（稍微过饱和，介稳区）；（稍微过饱和，介稳区）；控制好温度、控制好温度、pH值、离子强度等结晶条件。值、离子强度等结晶条件。3.6.1 结结晶定晶定义义3.6.13.6.1结晶结晶v类型类型 盐析结晶法盐析结晶法 有机溶剂结晶法有机溶剂结晶法 透析平衡结晶法透析平衡结晶法 等电点结晶法等电点结晶法 3.6.1 结结晶晶类类型型3.6.23.6.2浓缩浓缩v定义定义 从从低浓度低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成酶液中除去部分水或其他溶剂而成为为高浓度高浓度酶液的过程。酶液的过程。类型类型 蒸发浓缩蒸发浓缩通过通过加热或者减压加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。真空浓缩真空浓缩真空，真空，603.6.2 浓缩浓缩定定义义图图 4-60 减压蒸发浓缩的简易装置减压蒸发浓缩的简易装置1蒸蒸馏馏瓶瓶2毛毛细细管管3螺螺旋旋夹夹4橡橡皮皮管管5温温度度计计6进进水水口口7冷冷凝凝器器8出水口出水口9连接管连接管10抽气口抽气口11接收瓶接收瓶图图 4-60 减减压压蒸蒸发浓缩发浓缩的的简简易装置易装置3.6.33.6.3干燥干燥v定义定义 将固体、半固体或浓缩液将固体、半固体或浓缩液中的水分或其它溶剂中的水分或其它溶剂除去除去一部分一部分，以获得含水分较，以获得含水分较少的少的固体物质固体物质的过程。的过程。v类型类型（固体酶制剂）（固体酶制剂）真空干燥、冷冻干燥、喷真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。干燥等。3.6.3 干燥定干燥定义义参考文献：参考文献：酶学陈石根、周润琦，复旦大学出版社酶学陈石根、周润琦，复旦大学出版社酶工程罗贵民、曹淑贵，化学工业出版社酶工程罗贵民、曹淑贵，化学工业出版社现代生化技术郭勇，华南理工大学出版社现代生化技术郭勇，华南理工大学出版社参考文献：参考文献：酶酶学学陈陈石根、周石根、周润润琦，复旦大学出版社琦，复旦大学出版社思考题：思考题：1 1、大大肠肠杆杆菌菌常常含含有有几几千千种种以以上上的的酶酶，为为了了分分离离纯纯化化它它并并保保持持活活性性，常常有有很很多多困困难难。但但为为了了某某种种目目的的，请请根根据据下下列列要要求求写出具体的方法。写出具体的方法。（1 1）利用溶解度差别进行分离；）利用溶解度差别进行分离；（2 2）利用酶分子大小、形状进行分离；）利用酶分子大小、形状进行分离；（3 3）根据不同电荷进行分离；）根据不同电荷进行分离；（4 4）根根据据酶酶分分子子专专一一性性进进行行分分离离；（5 5）根根据据分分子子极极性性差差异异分离；（分离；（6 6）根据分配系数进行分离。）根据分配系数进行分离。2 2、在一抽提液中，含有三种蛋白酶，其性质如下：、在一抽提液中，含有三种蛋白酶，其性质如下：酶酶 相对分子量相对分子量 等电点等电点 A 20000 8.5 A 20000 8.5 B 21000 5.9 B 21000 5.9 C 5000 6.0 C 5000 6.0 试设计一方案来分离纯化这三种酶。试设计一方案来分离纯化这三种酶。3 3、如何从微生物产酶的发酵液中获得目的酶制剂？、如何从微生物产酶的发酵液中获得目的酶制剂？思考思考题题：1、大、大肠肠杆菌常含有几千种以上的杆菌常含有几千种以上的酶酶，为为了分离了分离纯纯化它并保化它并保4 4、对比离心分离的不同离心方法？、对比离心分离的不同离心方法？5 5、不同分离方法的选择依据是什么？、不同分离方法的选择依据是什么？4、对对比离心分离的不同离心方法？比离心分离的不同离心方法？