纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理课件

1纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理第四章第四章24.1 导言纤维素类生物质是自然界中最丰富的。与淀粉在结构上纤维素类生物质是自然界中最丰富的。与淀粉在结构上的差别仅在于糖苷键连接方式不同。的差别仅在于糖苷键连接方式不同。多与半纤维素、木素相互结合在一起。多与半纤维素、木素相互结合在一起。纤维素酶系统纤维素酶系统 非复合：真菌、放线菌非复合：真菌、放线菌 一般由菌丝分泌到胞外分别发挥作用。一般由菌丝分泌到胞外分别发挥作用。复合：复合：厌氧菌（热纤梭菌）厌氧菌（热纤梭菌）在其细胞壁上产生隆起的细胞结构，为纤维小体。在其细胞壁上产生隆起的细胞结构，为纤维小体。3 自从自从 19061906年在蜗牛消化液中首次发现纤维素酶后，年在蜗牛消化液中首次发现纤维素酶后，人类对其研究经历了百年历史：人类对其研究经历了百年历史：1950-1950-木酶的发现，木酶的发现，C1-CxC1-Cx假说。假说。1980 1980 年年至至 1988 1988 年年-利利用用基基因因工工程程的的方方法法对对纤纤维维素素酶的基因进行克隆和一级结构的测定。酶的基因进行克隆和一级结构的测定。9090年年代代-厌厌氧氧细细菌菌纤纤维维小小体体超超分分子子复复合合体体结结构构功功能能研究，多结构与体系的发现。研究，多结构与体系的发现。2121世纪世纪-基因及氨基酸序列，分子时代。基因及氨基酸序列，分子时代。导言44.2 纤维素酶系统的组成 根据各酶的功能可分为三大类：根据各酶的功能可分为三大类：(1)(1)内切葡聚糖酶（内切葡聚糖酶（endo-1,4-Dglucanase,EC.3.2.1.4,endo-1,4-Dglucanase,EC.3.2.1.4,来自真菌的简称来自真菌的简称 EG EG，来自细菌的简称来自细菌的简称CenCen）,这类酶作用这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解 -1-1，4-4-糖苷糖苷键键,将长链纤维分子截断将长链纤维分子截断,产生大量非还原性末端的小分子产生大量非还原性末端的小分子纤维素。纤维素。(2)(2)外切葡聚糖酶外切葡聚糖酶(exo-1(exo-1，4-D-glucanase4-D-glucanase，EC.3.2.1.91EC.3.2.1.91，又称，又称纤维二糖水解酶纤维二糖水解酶，来自真菌简称，来自真菌简称CBHCBH，来自细菌简称，来自细菌简称CexCex。）这类酶作用于纤维素分子的非还原端。）这类酶作用于纤维素分子的非还原端,依次水解依次水解 -1,4-1,4-糖苷键糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子。每次切下一个纤维二糖分子。5(3)-(3)-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶(-(-glucosidase,EC.3.2.1.21,glucosidase,EC.3.2.1.21,简称简称 BGBG）,这这类酶水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成类酶水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。对纤维二糖和纤维三糖的水解很葡萄糖。对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降降。4.2 纤维素酶系统的组成64.3 糖苷水解酶家族以底物专一性为基础建立的命名方法不能反映酶分子的结以底物专一性为基础建立的命名方法不能反映酶分子的结构特性。构特性。把作用于碳水化合物的相关酶类分成许多蛋白质家族，形把作用于碳水化合物的相关酶类分成许多蛋白质家族，形成专门的数据库共享。成专门的数据库共享。http:/www.cazy.org碳水化合物活性酶碳水化合物活性酶(CAZy)分类系统，只对分类系统，只对结构域结构域进行定进行定义。义。CAZy中某一基因的结构域以模块表示。中某一基因的结构域以模块表示。789图4.2104.4厌氧细菌纤维素酶的结构与功能 厌氧细菌在纤维素底物上生长时，在厌氧细菌在纤维素底物上生长时，在细胞壁上产生隆起的细胞结构即为细胞壁上产生隆起的细胞结构即为纤维小纤维小体体。不同生物体之间纤维小体结构相似，但其组成成分随着种不同生物体之间纤维小体结构相似，但其组成成分随着种的不同而有所差异。的不同而有所差异。纤维小体结构复杂、体积庞大、异质性强。纤维小体结构复杂、体积庞大、异质性强。114.4.1 纤维小体的一般组装模式结构蛋白：初级脚手架蛋白，锚定脚手架结构蛋白：初级脚手架蛋白，锚定脚手架蛋白等蛋白等催化模块：纤维素酶、半纤维素酶等催化模块：纤维素酶、半纤维素酶等124 4.4 4.1 1 纤纤维维小小体体的的一一般般组组装装模模式式对对接接模模块块粘粘连连模模块块134.4.1 4.4.1 纤维小体的一般组装模式纤维小体的一般组装模式144.4.2 粘连模块与对接模块4.4.2.1 粘连模块不同厌氧微生物的粘连模块序列差异很大。不同厌氧微生物的粘连模块序列差异很大。同一个脚手架蛋白上的粘连模块一般为同一类型，不同粘同一个脚手架蛋白上的粘连模块一般为同一类型，不同粘连模块之间有不同的序列相似性。连模块之间有不同的序列相似性。目前型和型粘连模块晶体结构已测定。目前型和型粘连模块晶体结构已测定。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能15164.4.2.2对接模块由大约具由大约具22个氨基酸的两条重复序列组成个氨基酸的两条重复序列组成钙离子钙离子促使对接模块折叠，并使其形成稳定的三级结构。促使对接模块折叠，并使其形成稳定的三级结构。也是粘连模块也是粘连模块-对接模块相互作用所必需的。对接模块相互作用所必需的。对接模块与其相应的粘连模块的分支情况相对应。对接模块与其相应的粘连模块的分支情况相对应。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能17184.4.2.3粘连模块和对接模块相互作用决定了纤维小体的结构，并纤维小体各亚基的整合仅依决定了纤维小体的结构，并纤维小体各亚基的整合仅依 赖于此。赖于此。主要以疏水作用相联系，并辅以相对较少的分子间氢键。主要以疏水作用相联系，并辅以相对较少的分子间氢键。热纤梭菌中热纤梭菌中型粘连模块与对接模块的相互作用是目前型粘连模块与对接模块的相互作用是目前已知最强的蛋白质间相互作用之一。已知最强的蛋白质间相互作用之一。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能19粘连模块与酶上对接模块在种内的结合是非专一性的，而粘连模块与酶上对接模块在种内的结合是非专一性的，而在种间的相互作用却是专一性的。生化水平上，包含对接在种间的相互作用却是专一性的。生化水平上，包含对接模块的酶与包含粘连模块的脚手架间的结合本质上是非特模块的酶与包含粘连模块的脚手架间的结合本质上是非特异性的。异性的。对接过程中粘连模块总体结构本质上不变，对接模块发生对接过程中粘连模块总体结构本质上不变，对接模块发生了构象变化了构象变化。4.4.2.3粘连模块和对接模块相互作用20图图4.4 4.4 热纤梭菌热纤梭菌型粘连模块红色和型粘连模块红色和型对接模块蓝色相互作用示意图型对接模块蓝色相互作用示意图214.4.3 纤维小体上的催化模块以热纤梭菌为例，它既有纤维小体酶系，也有游离的非纤以热纤梭菌为例，它既有纤维小体酶系，也有游离的非纤维小体酶。区别纤维小体酶与游离酶的关键特征是，纤维维小体酶。区别纤维小体酶与游离酶的关键特征是，纤维小体酶带有对接模块小体酶带有对接模块。催化模式具有多种情况：热纤梭菌中，表现为葡聚糖内切催化模式具有多种情况：热纤梭菌中，表现为葡聚糖内切酶活性、持续降解的纤维素内切酶活性、纤维素外切酶。酶活性、持续降解的纤维素内切酶活性、纤维素外切酶。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能224.4.3.1典型的纤维小体外切酶（或持续性内切酶）的空间结构厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能23厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.3.2典型的纤维小体内切酶的空间结构Figure 4.4.3 Structural comparison of(Figure 4.4.3 Structural comparison of(/)6 glycosyl hydrolases)6 glycosyl hydrolases 24根据序列和结构的相似度，CBM可被分成不同的家族。不同纤维小体家族中按功能分主要属于A型和B型。4.4.4.1 脚手架上的CBM厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.4 碳水化合物结合模块CBM （carbohydrate-binding module)图图4.4 4.4 热纤梭菌脚手架蛋白上的热纤梭菌脚手架蛋白上的CBMCBM结结构示意图构示意图 脚手架蛋白上往往包含一个脚手架蛋白上往往包含一个CBMCBM，它被认为负责将多酶复合体，它被认为负责将多酶复合体锚定在相应底物上（虽然在瘤胃球锚定在相应底物上（虽然在瘤胃球菌的纤维小体中没有发现）菌的纤维小体中没有发现）,其属其属于于A A型。型。热纤梭菌脚手架蛋白热纤梭菌脚手架蛋白CBMCBM的三的三维结构已经被解析其拓扑结构为一维结构已经被解析其拓扑结构为一个由个由9 9个个片层组成的果冻卷片层组成的果冻卷。25酶上的酶上的CBMCBM不是保持酶复合体接近底物表面所必需的结构。不是保持酶复合体接近底物表面所必需的结构。然而其具有潜在的功能，似乎是单个酶专一性结合底物，然而其具有潜在的功能，似乎是单个酶专一性结合底物，特别是其在分子水平上结合单个底物分子链（如可溶性的特别是其在分子水平上结合单个底物分子链（如可溶性的-葡聚糖或木聚糖链）。葡聚糖或木聚糖链）。酶分子模块上的酶分子模块上的CBMCBM既有既有A A型也有型也有B B型。型。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.4.2酶分子的CBM264.4.4.3纤维小体和游离酶上的CBM比较CBM蛋白质的种类及其所属家族都是高度不同的。蛋白质的种类及其所属家族都是高度不同的。但部分在纤维小体和游离催化系统中是相同的。但部分在纤维小体和游离催化系统中是相同的。有些只存在于游离催化系统，而在纤维小体中完全不存在。有些只存在于游离催化系统，而在纤维小体中完全不存在。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能274.4.4.4 影响小体与底物结合的因素弱离子强度弱离子强度能抑制纤维小体结合纤维素。能抑制纤维小体结合纤维素。水分子水分子能够从纤维素基质中释放至少部分的纤维小体或能够从纤维素基质中释放至少部分的纤维小体或CBM。适当增加适当增加溶液中的盐含量溶液中的盐含量可提高纤维小体对底物的亲和能可提高纤维小体对底物的亲和能力。力。吸附底物次优条件下吸附底物次优条件下，纤维小体复合体的酶活力最高。，纤维小体复合体的酶活力最高。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能284.4.5纤维小体的多样性根据纤维小体上脚手架蛋白的数量，可以被分为两类根据纤维小体上脚手架蛋白的数量，可以被分为两类:第一类：第一类：解纤维梭菌、食纤维梭菌、约氏梭菌、丙酮丁醇梭解纤维梭菌、食纤维梭菌、约氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、等嗜温梭菌产生的纤维小体。菌、等嗜温梭菌产生的纤维小体。只发现了只发现了型的粘连模型的粘连模块和对接模块。（块和对接模块。（69个）个）第二类：第二类：热纤梭菌、解纤维醋弧菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维热纤梭菌、解纤维醋弧菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维素拟杆菌。素拟杆菌。复杂程度高。复杂程度高。有限资料表明，纤维小体的组成和分布会受到碳源的有限资料表明，纤维小体的组成和分布会受到碳源的影响，另外纤维小体的某些结构蛋白和催化组分基因的表影响，另外纤维小体的某些结构蛋白和催化组分基因的表达也受到生长速率的影响达也受到生长速率的影响。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能29图4.5厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性30厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性31厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性324.4.6 纤维小体基因在基因中的分布规律厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能334.4.7 微型人造小体的研究进展纤维小体实际上是一个微型而高效的纤维素降解机器。现纤维小体实际上是一个微型而高效的纤维素降解机器。现在已提出了通过理性人工设计并通过工程手段提高天然纤在已提出了通过理性人工设计并通过工程手段提高天然纤维小体降解活力的新思路维小体降解活力的新思路。可行性依据可行性依据：1）对于细菌的粘连模块和对接模块，无论是单独生成还是）对于细菌的粘连模块和对接模块，无论是单独生成还是移植到异源性的蛋白质上，它们都能忠实地保持自身的生移植到异源性的蛋白质上，它们都能忠实地保持自身的生物学性质。物学性质。2）二者高亲和力相互作用在一些产纤维小体的细菌种类之）二者高亲和力相互作用在一些产纤维小体的细菌种类之间具有物种专一性。间具有物种专一性。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能34与天然纤维小体相比，有三个主要的不同之处：与天然纤维小体相比，有三个主要的不同之处：1）含有酶的数量有限。）含有酶的数量有限。2）是同源性的。）是同源性的。3）每个酶在微型手脚架蛋白上的位置是受到控制的。）每个酶在微型手脚架蛋白上的位置是受到控制的。未来前景包括构建新的杂交手脚架蛋白，使之能够将三个未来前景包括构建新的杂交手脚架蛋白，使之能够将三个或多个不同的酶结合到特定位点上。嵌合体的稳定性也是或多个不同的酶结合到特定位点上。嵌合体的稳定性也是影响它将来工业化应用的一个因素。影响它将来工业化应用的一个因素。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.7 微型人造小体的研究进展354.5好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌分泌的纤维素酶分子一般都好氧真菌分泌的纤维素酶分子一般都由一个糖基化的连接由一个糖基化的连接肽肽将一个将一个较大的催化结构域较大的催化结构域和和较小的纤维素结合结构域较小的纤维素结合结构域连连接起来构成。接起来构成。364.5.1 催化结构域及催化断键机理纤维素酶催化断键功能相似，但属不同糖苷水解酶家族。纤维素酶催化断键功能相似，但属不同糖苷水解酶家族。T.reesei是纤维素酶体系研究最为深入的好氧真菌。其中是纤维素酶体系研究最为深入的好氧真菌。其中CBH I是该菌所产主要的外切酶。是该菌所产主要的外切酶。催化中葡聚糖异头碳的构型并不发生变化。催化中葡聚糖异头碳的构型并不发生变化。水解主要产物是纤维二糖。水解主要产物是纤维二糖。好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能37好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.1 催化结构域及催化断键机理38图4.9好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能39有待研究的问题有待研究的问题：1.结晶纤维素表面如何游离出单根葡聚糖分子链。结晶纤维素表面如何游离出单根葡聚糖分子链。2.单根葡聚糖链如何快速准确地进入单根葡聚糖链如何快速准确地进入CBH的催化孔道中。的催化孔道中。3.葡聚糖链如何在催化孔道中高效地持续性单方向运动。葡聚糖链如何在催化孔道中高效地持续性单方向运动。4.5.1 催化结构域及催化断键机理好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能404.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能当多个不同蛋白质中都存在一个相同或相似的结构域时，当多个不同蛋白质中都存在一个相同或相似的结构域时，该结构域称之为模块。每一纤维素酶分子包含催化模块和该结构域称之为模块。每一纤维素酶分子包含催化模块和碳水化合物模块（碳水化合物模块（CBM）。）。基于结构和功能，将不同基于结构和功能，将不同CBM分成三类：分成三类：41好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能42CBM的功能的功能 推测其功能是将催化结构域拉近到不推测其功能是将催化结构域拉近到不溶性的纤维表面，使纤维素水解过程易于溶性的纤维表面，使纤维素水解过程易于进行。但是其功能及催化中的分子机理仍进行。但是其功能及催化中的分子机理仍未形成共识。未形成共识。好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能434.5.3 链接区的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能纤维素酶的模块结构通常由纤维素酶的模块结构通常由韧性的糖基化连接区韧性的糖基化连接区连接在一连接在一起。起。其其有效长度有效长度及及柔韧性柔韧性也是酶催化过程的关键。也是酶催化过程的关键。富含脯氨酸、苏氨酸和甘氨酸。富含脯氨酸、苏氨酸和甘氨酸。444.5.3 链接区的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能 虽然许多结构域三级结构已得到解析，但目前还虽然许多结构域三级结构已得到解析，但目前还没有一个包含完整纤维素酶的三维结构获得解析。没有一个包含完整纤维素酶的三维结构获得解析。454.6 纤维素酶持续性降解结晶纤维素 的动态催化过程 结晶纤维素的降解是纤维素降解的结晶纤维素的降解是纤维素降解的关键限速步骤关键限速步骤。持续性作用的持续性作用的外切纤维素酶外切纤维素酶是降解结晶纤维素的主要酶类。是降解结晶纤维素的主要酶类。可分为两个过程：可分为两个过程：纤维素结晶超分子结构的破坏。（需外加能量）纤维素结晶超分子结构的破坏。（需外加能量）糖苷键的断裂。（为酶催化反应，是动力学过程）糖苷键的断裂。（为酶催化反应，是动力学过程）464.6.1 纤维素酶分子-底物之间的结合过程纤维素酶通过结合结构域吸附到底物上；纤维素酶通过结合结构域吸附到底物上；定位于底物表面上特定的化学键上；定位于底物表面上特定的化学键上；形成酶形成酶-底物复合物；底物复合物；-糖苷键的水解，同时酶分子沿着纤维素链前进；糖苷键的水解，同时酶分子沿着纤维素链前进；纤维素酶从底物脱吸附，或重复第纤维素酶从底物脱吸附，或重复第4步，当催化结构步，当催化结构域离开纤维素链时重复第域离开纤维素链时重复第2、3步；步；-葡萄糖苷酶水解纤维二糖形成葡萄糖。葡萄糖苷酶水解纤维二糖形成葡萄糖。反应过程存在产物的抑制，及底物结构变化对酶分反应过程存在产物的抑制，及底物结构变化对酶分子催化过程的影响等因素。子催化过程的影响等因素。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程474.6.2 外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程4.6.2.1 酶分子-底物复合物待酶分子与底物结合构象变化待酶分子与底物结合构象变化形成稳定复合物后形成稳定复合物后，催，催化断键是化断键是瞬间发生瞬间发生。一般通过分子动力学。一般通过分子动力学/量子力学量子力学(MM/QM)，的方法进行研究。，的方法进行研究。对外切纤维素酶对外切纤维素酶CBH I 的分子动力学模拟，的分子动力学模拟，CBH I 的的催化孔道与糖链之间有分子间催化孔道与糖链之间有分子间氢键作用氢键作用，糖分子所有，糖分子所有的羟基与各种氨基酸残基相互作用，起到稳定酶的羟基与各种氨基酸残基相互作用，起到稳定酶-底物底物复合物的作用。复合物的作用。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程484.6.2.2 共价糖基-酶中间体的形成催化循环的第一步催化循环的第一步纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程4.6.2 外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程494.6.2.3 异头碳的恢复纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程504.6.2.3 异头碳的恢复纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程514.6.3 外切纤维素酶催化降解结晶纤维素的分子内协同模型CBH I的两结构域的两结构域(CD与与CBM)作用的分子内协同模型。作用的分子内协同模型。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程内切内切酶酶外切酶外切酶CBMCBM外切酶外切酶催化结催化结构域构域524.6.4 外切纤维素酶持续性催化过程动力从何而来分子动态学指出，大分子的动态行为与其功能密切相关。分子动态学指出，大分子的动态行为与其功能密切相关。新的酶学研究认为酶分子执行功能时要完成一系列构象变新的酶学研究认为酶分子执行功能时要完成一系列构象变化，在这个过程中酶分子整体结构化，在这个过程中酶分子整体结构“编码编码”了蛋白质分子了蛋白质分子的动态构象行为，为其提供的动态构象行为，为其提供“预先组织的环境预先组织的环境”。对对CBH来说，环境因素、底物结构变化、酶分子结构域协来说，环境因素、底物结构变化、酶分子结构域协同作用等都会影响同作用等都会影响CBH高效持续性降解过程。高效持续性降解过程。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程53小结这些相关研究在生物大分子相互作用水平上阐明酶分子降这些相关研究在生物大分子相互作用水平上阐明酶分子降解结晶纤维素的限制因素，找出高效降解的充分条件，为解结晶纤维素的限制因素，找出高效降解的充分条件，为降低转化过程的能耗、提高能量转化效率奠定理论基础，降低转化过程的能耗、提高能量转化效率奠定理论基础，也为解决目前遇到的系列难题提供新思路，促进燃料乙醇也为解决目前遇到的系列难题提供新思路，促进燃料乙醇新技术的革新与工业化转化进展。新技术的革新与工业化转化进展。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程54后面内容直接删除就行后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析资料仅供参考，实际情况实际分析主要经营：主要经营：课件设计，文档制作，课件设计，文档制作，网络软件设计、网络软件设计、图文设计制作、发布广告等图文设计制作、发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPTPPT设计、设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求打造全网一站式需求The user can demonstrate on a projector or computer,or print the 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