第二十二章-免疫学检测技术的基本原理课件

免疫学检测技术免疫学检测技术的基本原理的基本原理1l利用免疫学原理建立的免疫学检测 技术主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。2第一节第一节 体外抗原抗体结合反应的体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素特点及影响因素l抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。l抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；l也可用已知的抗原检测未知的抗体。l免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。3一、抗原抗体反应的特点一、抗原抗体反应的特点l1、高度特异性、高度特异性l抗原与抗体的结合具有高度特异性，这抗原与抗体的结合具有高度特异性，这种特异性是由抗原表位与抗体分子中的种特异性是由抗原表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定的。超变区互补结合所决定的。l利用这一特点，在体外可对许多未知的利用这一特点，在体外可对许多未知的生物学物质进行特异性鉴定。生物学物质进行特异性鉴定。l可用已知的抗体或抗原检测未知的抗原可用已知的抗体或抗原检测未知的抗原或抗体。或抗体。45l2、表面化学基团之间的可逆结合、表面化学基团之间的可逆结合l抗原抗体结合除了空间构象互补外，主抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之间的非共价键等分子表面的化学基团之间的非共价方式结合。方式结合。l这种非共价键不如共价键结合稳定，易这种非共价键不如共价键结合稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特性。性。6l解离度主要取决于两个方面：l一是抗体与抗原结合的亲和力（抗体分子单一抗原结合部位与一个相应抗原表位之间互补结合的强度）；l二是抗原抗体反应的环境因素如温度、酸碱度和离子强度。7l3、适宜的抗原抗体浓度和比例、适宜的抗原抗体浓度和比例l抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于两者适当的浓度和比例。应取决于两者适当的浓度和比例。l在反应体系中，如果抗原与抗体的浓度在反应体系中，如果抗原与抗体的浓度和比例适当，则抗原抗体复合物体积大、和比例适当，则抗原抗体复合物体积大、数量多，出现肉眼可见的反应。数量多，出现肉眼可见的反应。l若抗原或抗体过剩，抗原若抗原或抗体过剩，抗原-抗体复合物体抗体复合物体积小、数量少，不能出现肉眼可见的反积小、数量少，不能出现肉眼可见的反应。应。89l4、抗原抗体反应的两个阶段、抗原抗体反应的两个阶段 l抗原抗体反应可分为两个阶段：抗原抗体反应可分为两个阶段：l第一阶段是抗原抗体特异性结合阶段。抗第一阶段是抗原抗体特异性结合阶段。抗原分子与抗体分子之间是互补的非共价结原分子与抗体分子之间是互补的非共价结合，该反应迅速，一般不出现肉眼可见的合，该反应迅速，一般不出现肉眼可见的反应。反应。l第二阶段是可见反应第二阶段是可见反应 阶段，是小的抗原抗阶段，是小的抗原抗体复合物之间靠正、负电荷吸引形成较大体复合物之间靠正、负电荷吸引形成较大复合物的过程。复合物的过程。10l二、抗原抗体反应的影响因素二、抗原抗体反应的影响因素l1、电介质、电介质l抗原抗体通常为蛋白质分子，等电点分抗原抗体通常为蛋白质分子，等电点分别为别为pH35和和pH56不等，在中性或弱不等，在中性或弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质会使他们失去一部分适当浓度的电解质会使他们失去一部分负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝集团块或沉淀物。集团块或沉淀物。l实验中通常用实验中通常用0.85%的的Nacl或其他离子溶或其他离子溶液作为稀释液，以提供适应浓度的电解液作为稀释液，以提供适应浓度的电解质。质。11l2、温度、温度l适当提高反应的温度可增加抗原抗体分适当提高反应的温度可增加抗原抗体分子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的形成。形成。l通常抗原抗体反应的最适温度为通常抗原抗体反应的最适温度为37。l3、酸碱度、酸碱度l抗原抗体反应的最适酸碱度为抗原抗体反应的最适酸碱度为PH68之之间。间。12第二节第二节 检测抗原和抗体的体外试验检测抗原和抗体的体外试验 l一、凝集反应一、凝集反应l细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电介质存在的颗粒状物质与相应的抗体在电介质存在的条件下结合的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现，出现肉眼可见的凝集团现象，称为凝集反应。象，称为凝集反应。13l1、直接凝集反应：颗粒性抗原本身直接、直接凝集反应：颗粒性抗原本身直接与相应抗体反应出现的凝集现象。与相应抗体反应出现的凝集现象。l（1）玻片法：是一种定性试验，可用已）玻片法：是一种定性试验，可用已知抗体检测未知抗原，常用于菌种鉴定知抗体检测未知抗原，常用于菌种鉴定或人类或人类ABO血型的鉴定等。血型的鉴定等。l（2）试管法：是一种半定量试验，常用）试管法：是一种半定量试验，常用于检测抗体的滴度或效价，如诊断伤寒于检测抗体的滴度或效价，如诊断伤寒或副伤寒的肥达反应。或副伤寒的肥达反应。14l 2、间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体先、间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应抗体或抗原进行反应产生的然后再与相应抗体或抗原进行反应产生的凝集现象，称为间接凝集反应。凝集现象，称为间接凝集反应。l将已知抗原吸附在载体颗粒上的称为正向将已知抗原吸附在载体颗粒上的称为正向间接凝集试验；将已知抗体吸附在载体颗间接凝集试验；将已知抗体吸附在载体颗粒上的称为反向间接凝集试验。粒上的称为反向间接凝集试验。l可用于测定细菌、病毒等病原微生物抗原可用于测定细菌、病毒等病原微生物抗原或抗体或某些自身抗体。或抗体或某些自身抗体。151617l二、沉淀反应二、沉淀反应l毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。见的沉淀物，称为沉淀反应。l沉淀反应可在液体中进行，也可在半固沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。体琼脂凝胶中进行。18l1、速率散射比浊法、速率散射比浊法/免疫比浊法免疫比浊法l在一定量抗体中分别加入相应递增量的在一定量抗体中分别加入相应递增量的可溶性抗原，抗原抗体结合形成数量不可溶性抗原，抗原抗体结合形成数量不等的免疫复合物，使反应体系呈现不同等的免疫复合物，使反应体系呈现不同的浊度。用浊度计测量反应液体的浊度，的浊度。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高。复合物形成越多，浊度越高。l常用于检测免疫球蛋白（常用于检测免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）和补体的含量。）和补体的含量。19l2、单向琼脂扩散、单向琼脂扩散l将一定浓度的已知抗体混合于已熔化的琼将一定浓度的已知抗体混合于已熔化的琼脂中，制成凝胶板。间隔适当的距离打孔，脂中，制成凝胶板。间隔适当的距离打孔，加入待测可溶性抗原，使其向四周扩散。加入待测可溶性抗原，使其向四周扩散。抗原与琼脂中的抗体相遇，一定时间后，抗原与琼脂中的抗体相遇，一定时间后，在比例适宜处形成肉眼可见的白色沉淀环。在比例适宜处形成肉眼可见的白色沉淀环。l沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可从标沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可从标准曲线中查出样品中抗原的含量。准曲线中查出样品中抗原的含量。l本法常用于测定血清中免疫球蛋白（本法常用于测定血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）、补体（）、补体（C3）和）和AFP的含量。的含量。20含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环单向琼脂扩散单向琼脂扩散2122l3、双向琼脂扩散、双向琼脂扩散l将琼脂熔化制成琼脂平板，按需要打孔并分别将琼脂熔化制成琼脂平板，按需要打孔并分别加入抗原和抗体，使两者同时在琼脂中向四周加入抗原和抗体，使两者同时在琼脂中向四周扩散，当两者比例适宜时，在抗原和抗体孔之扩散，当两者比例适宜时，在抗原和抗体孔之间形成白色沉淀线。间形成白色沉淀线。l根据沉淀线的形状，可鉴定两者抗原是完全相根据沉淀线的形状，可鉴定两者抗原是完全相同、部分相同或完全不同。同、部分相同或完全不同。l本法常用于抗原或抗体的定性、定量检测及组本法常用于抗原或抗体的定性、定量检测及组分分析。分分析。23双向琼脂扩散双向琼脂扩散 2425l4、免疫电泳、免疫电泳l将样品在琼脂板上作蛋白电泳，将不同分将样品在琼脂板上作蛋白电泳，将不同分子量的蛋白组分分开，然后沿电泳方向挖子量的蛋白组分分开，然后沿电泳方向挖一平行的小槽，加入相应的抗体。存在于一平行的小槽，加入相应的抗体。存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。处形成沉淀弧。l沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。比，可分析样品的成分及其性质。l常用于血清蛋白的组分分析，以观察免疫常用于血清蛋白的组分分析，以观察免疫球蛋白的异常增多或缺失。球蛋白的异常增多或缺失。262728293031补体结合反应补体结合反应（Complement Fixation,CFT)敏感性和特异性均较高，但该试验影响因敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。32l三、免疫标记技术三、免疫标记技术l免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。l将已知的抗体或抗原标记上示宗物质，通过将已知的抗体或抗原标记上示宗物质，通过检测标记物，间接测定抗原抗体复合物。检测标记物，间接测定抗原抗体复合物。l常用的标记物有酶、荧光素、放射性核素、常用的标记物有酶、荧光素、放射性核素、胶体金及化学发光物质等。胶体金及化学发光物质等。33l1、免疫酶测定法（、免疫酶测定法（EIA）l是一种用酶标记一抗或二抗检测特异性抗是一种用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法。原或抗体的方法。l它将抗原抗体反应的高度特异性与酶对底它将抗原抗体反应的高度特异性与酶对底物的高效催化作用有效地结合起来，通过物的高效催化作用有效地结合起来，通过酶分解底物产生有色物质，用酶标议测定酶分解底物产生有色物质，用酶标议测定光密度值，以反映抗原或抗体的含量。光密度值，以反映抗原或抗体的含量。l酶：辣根过氧化物酶（酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸）、碱性磷酸酶（酶（ALP）等。）等。l常用的方法有：常用的方法有：ELISA和酶免疫组化技术。和酶免疫组化技术。34l酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）l是将已知的抗原或抗体吸附在固相载是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）上，使抗体（聚苯乙烯微量反应板）上，使抗原抗体反应在固相表面进行，通过洗原抗体反应在固相表面进行，通过洗涤法将液相中的游离成分洗除。涤法将液相中的游离成分洗除。l可用于检测多种病原体的抗原或抗体、可用于检测多种病原体的抗原或抗体、血液及其他体液中的微量蛋白成分、血液及其他体液中的微量蛋白成分、细胞因子等。细胞因子等。35l（1）双抗体夹心法）双抗体夹心法l先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；附的抗体；l加入待检标本，充分作用后，标本中相加入待检标本，充分作用后，标本中相应的抗原与固相上已知抗体结合，洗去应的抗原与固相上已知抗体结合，洗去未结合的抗原成分；未结合的抗原成分；l加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；酶标抗体；l加底物后，酶分解底物产生呈色反应加底物后，酶分解底物产生呈色反应。3637l（2）间接）间接ELISAl先将已知的抗原包被于固相上，然后加入先将已知的抗原包被于固相上，然后加入待检标本，如果标本中有相应的特异性抗待检标本，如果标本中有相应的特异性抗体，即与固相上的抗原结合，形成抗原抗体，即与固相上的抗原结合，形成抗原抗体复合物，然后加入酶标记的二抗，洗涤体复合物，然后加入酶标记的二抗，洗涤后加底物显色。后加底物显色。38 ELISA 检测抗体检测抗体3940l（3）生物素）生物素-抗生物素蛋白系统抗生物素蛋白系统（BAS）-ELISAl用于检查标本中的特异抗原时，先用于检查标本中的特异抗原时，先用已知的抗体包被固相，依次加入用已知的抗体包被固相，依次加入待检样品，生物素标记的特异抗体，待检样品，生物素标记的特异抗体，酶标记的亲和素，最后加底物显色。酶标记的亲和素，最后加底物显色。l除用于抗原抗体检测外，还用于除用于抗原抗体检测外，还用于DNA和和RNA的测定。的测定。41l（4）微粒捕获酶免疫分析技术）微粒捕获酶免疫分析技术l将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素亲和素酶放大系统相结合，最后酶作用素亲和素酶放大系统相结合，最后酶作用于荧光底物，使之发荧光，通过检测荧光于荧光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。强度判断未知抗原的含量。l可用于检测肿瘤标志物（可用于检测肿瘤标志物（AFP）、性激素、）、性激素、甲状腺素、甲状腺素、HCG等微量可溶性抗原。等微量可溶性抗原。42l（5）免疫组化技术）免疫组化技术l是用标记的特异性抗体在组织细胞原位是用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原定位、定性、定量检测应，对相应抗原定位、定性、定量检测的技术。的技术。l可在细胞和亚细胞水平检测各种抗原物可在细胞和亚细胞水平检测各种抗原物质。质。43l2、免疫荧光技术、免疫荧光技术l又称荧光抗体技术，是用荧光素标记一又称荧光抗体技术，是用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法。法。l常用的荧光素有：异硫氰酸荧光素（黄常用的荧光素有：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白（红色荧光）。绿色荧光）、藻红蛋白（红色荧光）。l可用于鉴定免疫细胞的可用于鉴定免疫细胞的CD分子，检测自分子，检测自身免疫病的抗核抗体等。身免疫病的抗核抗体等。44l（1）直接荧光法：将荧光素标记的已知）直接荧光法：将荧光素标记的已知抗体直接进行细胞或组织染色测定未知抗体直接进行细胞或组织染色测定未知抗原。抗原。l其特点是特异性强，但每检查一种抗原其特点是特异性强，但每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。必须制备相应的荧光抗体。4546l（2）间接荧光法：用一抗与标本中的抗）间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。原结合，再用荧光素标记的二抗染色。l此法既可检测抗原又可检测抗体。此法既可检测抗原又可检测抗体。l其特点是敏感性高，一种荧光素标记的其特点是敏感性高，一种荧光素标记的抗体可用于多种不同抗原的检测。抗体可用于多种不同抗原的检测。47间间接接免免疫疫荧荧光光法法示示意意图图48免免疫疫荧荧光光显显微微技技术术49l3、放射免疫测定法（、放射免疫测定法（RIA）l是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。疫测定。l将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，常用于激素、药物等微量物质检测。优点，常用于激素、药物等微量物质检测。50 Ag*Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab 和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性 放放射射免免疫疫测测定定法法(RIA)示示意意图图51l4、化学发光免疫技术（、化学发光免疫技术（CLIA）l是将化学发光分析和免疫反应是将化学发光分析和免疫反应 相结合而相结合而建立的一种新的免疫分析技术。建立的一种新的免疫分析技术。l将发光物质标记抗体或抗原进行反应，将发光物质标记抗体或抗原进行反应，以发光现象作为抗原以发光现象作为抗原-抗体反应的指示系抗体反应的指示系统，可定量检测抗原或抗体。统，可定量检测抗原或抗体。52l5、免疫胶体金技术（、免疫胶体金技术（ICS）l用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法。原或抗体的方法。l氯金酸在还原剂的作用下，可聚合成特定大小氯金酸在还原剂的作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。该溶的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。该溶液因静电作用而呈稳定的胶体状态。液因静电作用而呈稳定的胶体状态。l在碱性条件下，胶体金颗粒表面的负电荷与蛋在碱性条件下，胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团靠静电引力结合。白质的正电荷基团靠静电引力结合。l由于胶体金的电子密度高，颗粒聚集后呈红色，由于胶体金的电子密度高，颗粒聚集后呈红色，故可用于标记多种大分子，如故可用于标记多种大分子，如Ig、糖蛋白、脂、糖蛋白、脂蛋白、激素、蛋白、激素、PHA等。等。53l6、免疫印迹技术（、免疫印迹技术（Western blotting）l是将十二烷基磺酸钠（是将十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳（PAGE）分离得到的按分子量大小排列）分离得到的按分子量大小排列的蛋白质转移到固相载体膜上，再用标记的特的蛋白质转移到固相载体膜上，再用标记的特异性的抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性异性的抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性及定量分析的技术。及定量分析的技术。l步骤：电泳分离蛋白抗原，将可溶性抗原或溶步骤：电泳分离蛋白抗原，将可溶性抗原或溶解状态的细胞裂解液进行解状态的细胞裂解液进行SDS-PAGE；l将将SDS-PAGE分离的蛋白条带转移到固相的硝分离的蛋白条带转移到固相的硝酸纤维膜上；酸纤维膜上；l转印到膜上的蛋白条带可用酶标记的一抗或二转印到膜上的蛋白条带可用酶标记的一抗或二抗进行特异性反应，加入显色底物以显示结果。抗进行特异性反应，加入显色底物以显示结果。54免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图55第三节第三节 免疫细胞功能的检测免疫细胞功能的检测l一、免疫细胞的分离一、免疫细胞的分离l体外测定免疫细胞的功能，首先要从不同材料体外测定免疫细胞的功能，首先要从不同材料中分离所需细胞。中分离所需细胞。l1、外周血单个核细胞的分离、外周血单个核细胞的分离l外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。l常用的分离方法是葡聚糖常用的分离方法是葡聚糖-范影葡胺密度剃度范影葡胺密度剃度离心法，是根据外周血中各种血细胞比重不同离心法，是根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的细胞呈剃度分布。使不同密度的细胞呈剃度分布。56(1)抗凝抗凝静脉血静脉血(2)加加等量等量NS(4)密度梯度离密度梯度离心心血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓混匀后，缓慢加于分离液上慢加于分离液上57l2、淋巴细胞及其亚群的分离、淋巴细胞及其亚群的分离l分离方法有多种，如玻璃黏附法、尼龙分离方法有多种，如玻璃黏附法、尼龙毛分离法、毛分离法、E花环形成分离法等。花环形成分离法等。l免疫吸附分离法免疫吸附分离法l磁珠分离法磁珠分离法l荧光激活细胞分选议分离法荧光激活细胞分选议分离法l抗原肽抗原肽-MHC分子四聚体技术分子四聚体技术58花结试验示意图花结试验示意图59l二、免疫细胞功能的测定二、免疫细胞功能的测定l（一）（一）T细胞功能测定细胞功能测定l1、T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验lT细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后，可发生增殖，可通过以下三种方法后，可发生增殖，可通过以下三种方法检测。检测。l（1）形态计数法）形态计数法l（2）3H-TdR或或125I-UdR掺入法掺入法l（3）MTT比色法比色法60淋巴细胞转化试验（形态学示意图）淋巴细胞转化试验（形态学示意图）l原理：人原理：人T细胞表面有细胞表面有PHA或或ConA受体，受体，T细胞在体外受细胞在体外受PHA或或ConA的刺激后能的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。细胞的功能。PHA刺激4872小时61培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图掺入法）示意图62MTT（四甲基偶氮唑盐）法（四甲基偶氮唑盐）法l原理：在细胞培养终止前数小时加入原理：在细胞培养终止前数小时加入MTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解解MTT产生蓝色甲攒（产生蓝色甲攒（Formazan)沉积沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。细胞增殖程度成正相关。63l（2）迟发型超敏反应的检测）迟发型超敏反应的检测l正常机体建立了对某种抗原的细胞免疫正常机体建立了对某种抗原的细胞免疫后，用相同抗原作皮肤试验时即出现以后，用相同抗原作皮肤试验时即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应。细局部红肿为特征的迟发型超敏反应。细胞免疫正常者出现阳性反应，而细胞免胞免疫正常者出现阳性反应，而细胞免疫低下者则呈阴性反应。疫低下者则呈阴性反应。64l（二）（二）B细胞功能测定细胞功能测定l1、B细胞增殖试验：细胞增殖试验：B细胞受丝裂原（细细胞受丝裂原（细菌脂多糖、菌脂多糖、SPA等）刺激后，进行分裂增等）刺激后，进行分裂增殖，经一定时间后检查抗体形成细胞的殖，经一定时间后检查抗体形成细胞的数目。数目。l2、抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试、抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验，即测定对验，即测定对SRBC上的抗原产生的抗体上的抗原产生的抗体形成细胞数目。由于抗体形成细胞分泌形成细胞数目。由于抗体形成细胞分泌的免疫球蛋白与的免疫球蛋白与SRBC上的抗原结合，在上的抗原结合，在补体参与下，出现溶血反应。补体参与下，出现溶血反应。65l（三）细胞毒试验（三）细胞毒试验l细胞毒实验技术是检测细胞毒实验技术是检测CTL、NK等细胞杀等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。伤靶细胞活性的一种细胞学技术。l可根据待检效应细胞的性质，选用相应的可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞、病靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞、病毒感染细胞等。毒感染细胞等。l主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。感染等方面的研究。66靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时细胞毒试验（细胞毒试验（51Cr释放法）示意图释放法）示意图67l（四）吞噬功能的测定（四）吞噬功能的测定l1、硝基蓝四氮唑试验、硝基蓝四氮唑试验l2、巨噬细胞吞噬试验、巨噬细胞吞噬试验l五、细胞因子的检测五、细胞因子的检测l1、生物活性检测法、生物活性检测法l2、免疫学检测法、免疫学检测法68l1.选择方法兼顾灵敏性和特异性；l2.根据疾病的特点选择诊断方法；l3.免疫学监测（肝炎、HIV等感染性疾病的转归、肿瘤、器官移植后的监测）。69本本 章章 小小 结结l1、掌握抗原与抗体反应的特点、种类及其检测方法；l2、掌握E玫瑰花环试验、淋巴细胞转化试验的原理；l3、理解免疫标记技术及抗原与抗体反应的影响因素；l4、了解免疫细胞的功能检测方法。70