第二代测序技术课件

第二代高通量测序技术简介第二代高通量测序技术简介1.四大高通量测序平台四大高通量测序平台 Solexa，454(GS-FLX)，SOLiD和和Polonator2.测序原理测序原理 合成法测序合成法测序(Sequencing by Synthesis)连接法测序连接法测序(Sequencing by Ligation)454(GS-FLX)Roche：（：（2005，2007，2008）原理：在原理：在DNA聚合酶、聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光硫酸化酶、荧光素酶素酶和和双磷酸酶双磷酸酶的作用下，将每一个的作用下，将每一个dNTP的的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测实时检测DNA序列的目的。序列的目的。454(GS-FLX)流程流程1、文库制备：基因组、文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理片段化处理至至300-800bp间，经末端修复与特异性接头间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的连接等修饰后变性处理回收单链的DNA。454(GS-FLX)流程流程2、Emulsion PCR：单链：单链DNA文库被文库被固定固定在在DNA捕获磁珠上，捕获磁珠上，乳化乳化，形成油包水的混合，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的行独立的扩增，扩增，回收纯化；回收纯化；454(GS-FLX)流程流程3、测序反应：携带、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。板中供测序反应使用。454(GS-FLX)流程流程4、数据分析：、数据分析：GS FLX系统在系统在10小时的运行小时的运行当中可获得当中可获得100余万个读长，读取超过余万个读长，读取超过4-6亿亿个碱基信息个碱基信息 Solexa-Illumina Genome Analyzer核心技术：核心技术：“DNA簇簇”和和“可逆性末端终止可逆性末端终止”。原理：将基因组原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即玻璃表面（即Flow cell），这些），这些DNA片段经过延伸片段经过延伸和桥式扩增后，在和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计上形成了数以亿计Cluster，每个，每个Cluster是具有数千份相同模板的单是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸核苷酸，通过可逆性终止的，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）（边合成边测序）技术对待测的模板技术对待测的模板DNA进行测序。进行测序。SOLiD ABI(Applied Biosystems)：SOLiD(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)原理原理：用连接法测序获得基于：用连接法测序获得基于“双碱基编双碱基编码原理码原理”的的SOLiD颜色编码序列，随后的颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的编码的reference序列，把序列，把SOLiD颜色序颜色序列定位到列定位到reference上，同时校正测序错上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在现潜在SNP位点。位点。SOLiD流程流程1、SOLiD基因组文库的构建基因组文库的构建 SOLiD流程流程2、油包水、油包水PCR SOLiD流程流程3、含、含DNA模板模板P1磁珠的固定磁珠的固定 SOLiD流程流程4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程流程4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程流程5.数据分析原理数据分析原理 Polonator 测序原理：测序原理：Polonator系统高质量测序是一种以系统高质量测序是一种以连接连接反应反应进行进行DNA序列分析的技术，该系统采用序列分析的技术，该系统采用结合在结合在磁珠磁珠上单分子上单分子DNA片段簇片段簇为测序模板，为测序模板，以以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧四色荧光标记光标记的的9碱基单链荧光探针混合物进行连续碱基单链荧光探针混合物进行连续的连接反应为基础，对扩增的的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行片段进行大规模高通量测序。大规模高通量测序。Polonator流程流程单分子测序1、测序平台介绍11并行单分子合成测序技术12单分子实时合成测序技术13纳米孔单分子技术1 1 并行单分子合成测序技术 Helicos Biosciences 是第一个设计开发单分子测序方法(tSMSTM)技术平台的公司，其基础主要来自于Braslavsky 等人的研究。主要是利用合成测序理论(图1)，测序时首先将待测序列打断成小片段并在3末端加上polyA(图1a)，并用末端转移酶阻断(图中标注为F1)，同时在玻璃芯片上随机固定多个polyT引物(其末端皆带有荧光标记)，将小片段DNA 模板与检测芯片上的polyT 引物进行杂交并精确定位(图1b)，通过成像来精确定位杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点(图1c);逐一加入荧光标记的单色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，利用全内反射显微镜(total interreflection microscopy，TIRM)进行单色成像(图1d)，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入(图1e)。通过掺入、检测和切除的反复循环，就可以实现实时测序。由于该技术采用了Cy5(吲哚-5-菁)荧光基团(具有很好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率，激发波长在647nm 处)和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。优点：优点：1、该平台文库制备简单，不需要PCR 扩增或连接酶，特别适合RNA 直接测序的应用。2、该公司HeliScope 测序仪的优势是样本通量非常高，2个流动槽可同时运行，每个流动槽有25 个独立通道，每个通道又可以运行最多96个标记分子条形码的样本，这样每次运行的样本数可高达4 800 个。缺点：缺点：测序的平均读长相对较短，只有35 bp，准确率较低，约为97%，还有待于进一步的改进。1 2 单分子实时合成测序技术 Helicos Biosciences 公司虽然第一个成功的开发了单分子测序技术，但是将该技术成功进行商业化的是Pacific Biosciences 公司推出的单分子实时DNA 测序仪(SMRT)。SMRT 技术是基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为载体进行测序反应。SMRT 芯片是一种带有很多零模式波导孔(ZMW)(厚度为100 nm)的金属片，ZMW 是一种直径只有几十个纳米的孔，由于其底部上的小孔短于激光的单个波长，导致激光无法直接穿过小孔，而会在小孔处发生光的衍射，形成局部发光的区域，即为荧光信号检测区(图2a中的白色区域)，该区域内锚定有DNA 聚合酶。测序时将基因组的DNA 打断成许多小的片段，制成液滴后将其分散到不同的ZMW 纳米孔中。当ZMW 孔底部聚合反应发生时，被不同荧光标记的核苷酸会在小孔的荧光探测区域中被聚合酶滞留数十毫秒，荧光标记会在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP 的种类，反应完成后荧光标记会被聚合酶切除而弥散出ZMW 小孔，其它未参与合成的dNTP 由于没进入荧光信号检测区而不进入荧光信号检测区。、SMRT 测序时，样品准备过程涉及到样品DNA 的打断、末端补齐、连接接头、测序这几个步骤。测序中需要的样品量很少，样品准备中所用的试 剂也很少，而且测序过程中省去扫描和洗涤的过程，所以测序所花的时间较少。优点：长读长(Long reads)可以帮助研究者对变异进行更准确的定位。另外，该平台通量高、费用较低、耗时短。缺点：会出现插入和缺失错误1 3 纳米孔单分子技术 Oxford Nanopore Technologies 公司研发的测序技术完全不同于前两种测序技术，其核心就是将在某一面上含有一对电极的特殊的脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由 溶血素蛋白组成的纳米孔中结合一个核酸外切酶。当DNA 模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA 分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终得出DNA 分子的序列。优点优点：仪器构造简单使用成本低廉;因为它不需要对核苷酸进行标记，也不需要复杂的光学探测系统(如激光发射器和CCD信号采集系统等)，能直接对RNA 分子进行测序。同时由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流，因而能对修饰过的碱基进行测序，这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。缺点缺点：它采用的是水解测序法，不能进行重复测序，因而无法达到一个满意的测序精确度。2、单分子测序技术的应用2 1 基因组测序2 2 甲基化研究2 3 突变鉴定(SNP 检测)2 4 RNA 测序2 5 重复序列和poly 结构的测序2 1 基因组测序 由于具有读长长的特点，SMRT 测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig 数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。Christophern 等仅仅用0.5 的PacBio RS 系统长度的数据与38 的二代测序(NGS)的测序数据，对马达加斯加的一种指猴基因组进行拼装，大幅度提高了数据的质量和完整度，同时借助Pacbio RS 的帮助将原有的Contig 数量减少了10 倍。David A.等利用PacBioRS 平台和C2 试剂通过全球合作几天内就完成了从德国大肠杆菌疫情中获得的大肠杆菌样品以及近似菌株的测序和数据分析，最终获得了2 900bp 的平均读长以及99.998%的一致性准确度。在对霍乱病菌的研究中，第三代测序技术已初现锋芒。研究人员对5 株霍乱菌株的基因组进行了测序研究，并与其他23 株霍乱弧菌的基因组进行对比。结果发现海地霍乱菌株与2002 年和2008 年在孟加拉国分离得到的变异霍乱弧菌El Tor O1 菌株之间关系密切，而与1991 年拉丁美洲霍乱分离株的关系较远。相对NGS 的优势就是能更快获得结果，因此该系统在鉴定新的病原体和细菌的基因组测序方面得到很广泛的应用。2 2 甲基化研究 SMRT 技术采用的是对DNA 聚合酶的工作状态进行实时监测的方法，聚合酶合成每一个碱基，都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时，聚合酶会慢下来，使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值如果大于1，由此就可以推断这个位置有修饰。甲基化研究中关于5-mC 和5-hmC(5-mC 的羟基化形式)是甲基化研究中的热点。但现有的测序方法无法区分5-mC 和5-hmC。美国芝加哥大学利用SMRT 测序技术和5-hmC 的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。通过聚合酶动力学提供的信息，可直接检测到DNA 甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC 和5-hmC，为表观遗传学研究打开了一条通路。2 3 突变鉴定(SNP 检测)单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势，而且没有PCR 扩增步骤，就没有扩增引入的碱基错误，该优势使其在特定序列的SNP 检测，稀有突变及其频率测定中大显身手。例如在医学研究中，对于FLT3 基因是否是急性髓细胞白血病(AML)的有效治疗靶标一直存在质疑。研究人员用单分子测序分析耐药性患者基因，意外发现耐药性与FLT3 基因下游出现的稀有新突变有关，重新证明了FLT3 基因是这种最常见白血病-急性髓细胞白血病(AML)的有效治疗靶标，打破了一直以来对于这一基因靶标的疑惑。凭借PacBio 平均3 000bp的读长，获得了更多基因下游的宝贵信息，而基于单核酸分子的测序能够检测到低频率(低至1%)罕见突变，正是这项成果的关键所在。2.4 RNA 测序 根据三代测序技术实时测序的特点，可以直接对RNA 进行测序，做到了对特定组织和细胞内的表达差异的精确定位。运用Helicos 操作平台对酵母的聚腺苷酸化的转录本进行精确定量，用50 个通道中的6个通道，共产生2 4 亿个Reads。利用Helicos 遗传分析平台可以将DNA 聚合酶换成反转录酶对RNA 直接测序，主要通过Poly(dT)包被的表面捕获聚腺苷酸化的RNA，成功完成对酿酒酵母RNA 的直接测序，免除将RNA 转变成cDNA 的过程。同时借助PacBio 技术平台，也可完成对RNA 的直接测序，Uemura 等就利用该技术进行实时测序观察核糖体中mRNA 的翻译过程。单分子测序技术最大的优势，也是最直接的应用就是检测细胞和组织内基因表达水平，同时对基因的结构做出分析，如RNA 的剪接，是否有碱基突变或异常表达基因等。而且还能检测到微量的基因表达子或罕见的非编码RNA。PacBio RS 还可对连续的A 或者T 区域测序，因为PolyA 长度和RNA 的半衰期有关，所以对长PolyA 的研究对RNA 的代谢有重要意义。2 5 重复序列和poly 结构的测序 在所有人的X 染色体上都有一段CGG 三核苷酸重复序列，正常人的CGG 重复次数为5-44 次。过长的重复次数会对FRM1 基因转录或翻译出FRM1 蛋白不利，当重复次数超过200 次时，就会导致脆性X 综合征，所以检测CGG 的重复次数非常有意义。但是这个重复长度的测序用Sanger 测序和第二代测序技术都是难以完成的。美国UC Davis 医学院利用PacBio 技术环形比对测序模式，对FMR1 中的CGG 三核苷酸重复区域进行了测序，获得了超过10kb 的原始读长，覆盖了CGG 重复超过750 次的三核苷酸重复区域。