第11讲-动物细胞生物制药应用--课件

第第1111讲讲 动物细胞生物制药应用动物细胞生物制药应用1 1pptppt课件课件新民周刊新民周刊新民周刊新民周刊2010,5.17-23.P76-92010,5.17-23.P76-92010,5.17-23.P76-92010,5.17-23.P76-92010.11.22010.11.2：世界肺炎日（第：世界肺炎日（第2 2个）个）全球每年约有全球每年约有160160万人死于肺炎链球菌疾病，万人死于肺炎链球菌疾病，平均平均每每每每38383838秒就有秒就有秒就有秒就有1 1 1 1名名名名5 5 5 5岁下儿童死岁下儿童死岁下儿童死岁下儿童死于此病，于此病，1100110011001100万儿童万儿童万儿童万儿童因肺炎住院。导致儿童死亡的因肺炎住院。导致儿童死亡的头号杀手，并高致残：智力低下、癫痫头号杀手，并高致残：智力低下、癫痫（17%17%）、耳聋（）、耳聋（27.7%27.7%）。）。中国是中国是1010个肺炎发病率最高的国家之一，个肺炎发病率最高的国家之一，1/41/41/41/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占儿童携带病菌；死亡儿童该病占46.8%46.8%46.8%46.8%。占西太平洋区的占西太平洋区的70%70%70%70%。红霉素不敏感几乎达到红霉素不敏感几乎达到100%100%，青霉素达，青霉素达86%86%。19831983年年2323价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗PPV23PPV23诞生。诞生。20002000年针对年针对2 2岁以下儿童的岁以下儿童的7 7价肺炎价肺炎链球菌蛋白结合疫苗链球菌蛋白结合疫苗PPV7PPV7问世。目前已经问世。目前已经接种接种3 3亿剂，亿剂，世界第一大单个疫苗世界第一大单个疫苗世界第一大单个疫苗世界第一大单个疫苗。肺炎链球菌发现肺炎链球菌发现100100100100年年年年后，真正安全有效的后，真正安全有效的PPV7PPV7疫苗才大规模使用。制造工艺非常复疫苗才大规模使用。制造工艺非常复杂，约需要一年左右。只有爱尔兰、美国杂，约需要一年左右。只有爱尔兰、美国两家工厂。两家工厂。2 2pptppt课件课件病毒及病毒疾病病毒及病毒疾病甲型甲型H1N1H1N1流感病毒流感病毒猪流感（猪流感（Swine Flu），是猪群中发现的一种可引起地方性流行性感冒的正黏液病毒，属呼吸系统疾病，由甲型流感病毒(A型流感病毒)引发。以往曾经发生人类感染猪流感，但未有发生人传人案例。2009年4月墨西哥猪流感造成数150多死亡事件，并在多个国家蔓延。3 3pptppt课件课件H H、N N的意思的意思世界卫生组织世界卫生组织20092009年年4 4月月3030日建议使用日建议使用“A/H1N1A/H1N1A/H1N1A/H1N1流感流感”的的名称。名称。病毒根据抗原性的不同，可分为病毒根据抗原性的不同，可分为A A、B B、C C三型。根据血凝三型。根据血凝素素(Hemagglutinin(Hemagglutinin，H)H)和神经氨酸酶和神经氨酸酶(Neyramidinase(Neyramidinase，N)N)的抗原特性，将的抗原特性，将A A型流感病毒分成不同的亚型。目前，型流感病毒分成不同的亚型。目前，有有1515种特异的种特异的H H亚型和亚型和9 9种特异的种特异的N N亚型。亚型。病毒进入细胞：病毒进入细胞：血凝素（血凝素（H H）能和细胞膜上的蛋白结合，）能和细胞膜上的蛋白结合，在细胞上打开一个通道，使得病毒能进入细胞。在细胞上打开一个通道，使得病毒能进入细胞。病毒要钻出宿主细胞病毒要钻出宿主细胞：神经氨酸酶（：神经氨酸酶（N N）通过）通过“水解水解”的的方式切断病毒和宿主细胞的最后联系，使病毒脱离宿主细方式切断病毒和宿主细胞的最后联系，使病毒脱离宿主细胞。胞。4 4pptppt课件课件首批首批3636万支甲型万支甲型H1N1H1N1流感病毒疫苗抵达新疆流感病毒疫苗抵达新疆http:/http:/2009-10-162009-10-165 5pptppt课件课件SARSSARS病毒病毒SARSSARS病毒属于冠状病毒科，病毒属于冠状病毒科，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，病外周有冠状排列的纤突，病毒直径在毒直径在80-120nm80-120nm之间。之间。感染病毒的细胞线粒体肿胀，感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解，部分线粒体外膜或嵴溶解，病毒颗粒主要分布在胞浆的病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细内质网池、胞浆空泡内和细胞外，多聚集成堆。胞外，多聚集成堆。6 6pptppt课件课件HIVHIV病毒病毒-艾滋病艾滋病HIVHIV是艾滋病病毒（是艾滋病病毒（human human immunodeficiency virusimmunodeficiency virus）的缩写。）的缩写。“人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒”。逆转录病毒，。逆转录病毒，遗传信息存在于两个相同的遗传信息存在于两个相同的RNARNA单链单链模板中。艾滋病是模板中。艾滋病是19811981年发现的。年发现的。生存于人的血液中并生存于人的血液中并攻击人体免疫系攻击人体免疫系攻击人体免疫系攻击人体免疫系统统统统。把人体免疫系统中最重要的。把人体免疫系统中最重要的T4T4淋淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏坏T4T4淋巴细胞，从而使整个人体免疫淋巴细胞，从而使整个人体免疫系统遭到破坏，最终人体系统遭到破坏，最终人体丧失对各种丧失对各种丧失对各种丧失对各种疾病的抵抗能力而导致死亡疾病的抵抗能力而导致死亡疾病的抵抗能力而导致死亡疾病的抵抗能力而导致死亡。7 7pptppt课件课件2009200920092009年年年年12121212月月月月3 3 3 3日，国家食品药品监督管理局在监督检日，国家食品药品监督管理局在监督检日，国家食品药品监督管理局在监督检日，国家食品药品监督管理局在监督检查中发现，江苏延申和河北福尔生物制药股份有限查中发现，江苏延申和河北福尔生物制药股份有限查中发现，江苏延申和河北福尔生物制药股份有限查中发现，江苏延申和河北福尔生物制药股份有限公司的公司的公司的公司的7 7 7 7个批次人用狂犬病疫苗存在质量问题。个批次人用狂犬病疫苗存在质量问题。个批次人用狂犬病疫苗存在质量问题。个批次人用狂犬病疫苗存在质量问题。8 8pptppt课件课件2010.3.172010.3.17：山西疫苗事件：山西疫苗事件9 9pptppt课件课件本节主要内容1.杂交瘤技术生产单克隆抗体杂交瘤技术生产单克隆抗体2.病毒疫苗生产1010pptppt课件课件本节关键问题本节关键问题本节关键问题本节关键问题杂交瘤生产单克隆抗体的杂交瘤生产单克隆抗体的杂交瘤生产单克隆抗体的杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程制备原理与技术流程制备原理与技术流程制备原理与技术流程1111pptppt课件课件一一 杂交瘤技术生产单克隆抗体杂交瘤技术生产单克隆抗体1212pptppt课件课件问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合（Cell fusionCell fusion）是指使用人工方法使两个或两个）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。以上的细胞合并形成一个细胞的技术。体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传重组，在育：克服有性不亲和性，实现远源遗传重组，在育种方面意义重大。种方面意义重大。杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。：具有两亲本特性，生物制药。1313pptppt课件课件基础知识回顾基础知识回顾（一）免疫学基础（一）免疫学基础1 1 抗原抗原进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质外源物质外源物质外源物质。包括包括包括包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：外源性、结构性特点：外源性、结构性特点：外源性、结构性特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团（分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、作为识别位点）、特异性特异性特异性特异性（抗原与抗体的反应）（抗原与抗体的反应）（抗原与抗体的反应）（抗原与抗体的反应）。1414pptppt课件课件2 2 抗体抗体动物免疫系统分泌的中和或消除动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于抗原物质的影响的物质，存在于血清血清血清血清中，本质是免疫球蛋白中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,IgImmuniglobulin,Ig）。）。互补性决定区互补性决定区互补性决定区互补性决定区（ComplementarityComplementarity determining regiondetermining region，CDRCDR）VHVHVHVH和和和和VLVLVLVL的三个高变区共同组成的三个高变区共同组成IgIg的抗的抗原结合部位（原结合部位（Antigen-binding Antigen-binding sitesite）。该部位形成一个与抗原）。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的决定簇互补的表面，决定抗体的多样性与特异性。多样性与特异性。1515pptppt课件课件抗体产生的途径抗体产生的途径免疫系统免疫系统免疫系统免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细胞包括胞包括B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞发育成浆细胞，分泌抗体，参与体发育成浆细胞，分泌抗体，参与体液免疫，脾脏可以分泌。液免疫，脾脏可以分泌。T T T T淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞发育成吞噬细胞，直接参与细胞免发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助B B淋巴细胞淋巴细胞产生抗体。产生抗体。1616pptppt课件课件多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体动物脾脏有上百万个动物脾脏有上百万个B B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的它针对抗原上的一个抗原决定族一个抗原决定族一个抗原决定族一个抗原决定族产生的抗体是产生的抗体是单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体。一种一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族抗原通常具有多个不同的抗原决定族抗原通常具有多个不同的抗原决定族抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多，因此能刺激多个个B B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物单克隆抗体混合物单克隆抗体混合物单克隆抗体混合物，称为，称为多克隆多克隆多克隆多克隆抗体抗体抗体抗体。1717pptppt课件课件1818pptppt课件课件问题的引出问题的引出血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。采用其他方法。如果我们能如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的分离得到只分泌某一种特异性抗体的分离得到只分泌某一种特异性抗体的分离得到只分泌某一种特异性抗体的B B B B淋巴细淋巴细淋巴细淋巴细胞胞胞胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？，不就可以大量生产相关单抗了吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？很难离体培养很难离体培养B B淋巴细胞。淋巴细胞。1919pptppt课件课件（一）历史发现（一）历史发现19751975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。2020pptppt课件课件（二）杂交瘤技术（二）杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为称为杂交瘤技术（杂交瘤技术（杂交瘤技术（杂交瘤技术（hydridomahydridomahydridomahydridoma technique technique technique technique）。2121pptppt课件课件（三）单克隆抗体应用领域（三）单克隆抗体应用领域单克隆抗体的特点是：理化性状高度单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一均一、生物、生物活性单一活性单一、与抗原结合的与抗原结合的特异性强特异性强，广泛应用于生物学和医学研究领，广泛应用于生物学和医学研究领域：域：1.1.作为亲合层析的配体作为亲合层析的配体2.2.作为生物治疗的导向武器作为生物治疗的导向武器3.3.作为免疫抑制剂作为免疫抑制剂4.4.探针探针5.5.增强抗原的免疫原性增强抗原的免疫原性6.6.作为医学检验试剂作为医学检验试剂2222pptppt课件课件（三）技术流程 视频：http:/ 细胞融合细胞融合杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选可分泌特异性单克隆抗体可分泌特异性单克隆抗体 的杂交瘤细胞的筛选的杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞的克隆化培养单克隆抗体的生产和纯化单克隆抗体的生产和纯化2424pptppt课件课件1.1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备一般要经过初次免疫、第二次免疫（向动物腹腔内一般要经过初次免疫、第二次免疫（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）三个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次三个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫加强免疫3 3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。天以后的脾脏，制备成细胞悬液。2525pptppt课件课件免疫方法：免疫方法：体内法或体外法体内法或体外法体内法或体外法体内法或体外法。体内法体内法体内法体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射入小鼠体内，可：对细胞或微生物抗原可直接注射入小鼠体内，可：对细胞或微生物抗原可直接注射入小鼠体内，可：对细胞或微生物抗原可直接注射入小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。到动物体内。到动物体内。到动物体内。3 3 3 34 4 4 4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在结制成悬液，存活率在结制成悬液，存活率在结制成悬液，存活率在95959595以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。体外法体外法体外法体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为101010107 7 7 7个个个个/ml/ml/ml/ml，加适当浓度抗原，加适当浓度抗原，加适当浓度抗原，加适当浓度抗原，3 3 3 34 4 4 4天后，收集被刺激的淋巴细胞。天后，收集被刺激的淋巴细胞。天后，收集被刺激的淋巴细胞。天后，收集被刺激的淋巴细胞。2626pptppt课件课件B B 淋巴细胞的准备淋巴细胞的准备注入小鼠皮下或腹腔注入小鼠皮下或腹腔取出脾脏取出脾脏B淋巴细胞淋巴细胞 亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备2727pptppt课件课件2.骨髓瘤细胞的获得与培养骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系同一品系同一品系同一品系，这样杂交融合，这样杂交融合，这样杂交融合，这样杂交融合率高。率高。率高。率高。骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细胞培养液。骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细胞培养液。骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细胞培养液。骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细胞培养液。小牛血清的浓度一般在小牛血清的浓度一般在小牛血清的浓度一般在小牛血清的浓度一般在1010101020202020，细胞的最大密度不得，细胞的最大密度不得，细胞的最大密度不得，细胞的最大密度不得超超超超101010106 6 6 6个个个个mlmlmlml，一般扩大培养以，一般扩大培养以，一般扩大培养以，一般扩大培养以1 1 1 1：10101010稀释传代，每稀释传代，每稀释传代，每稀释传代，每3-53-53-53-5天天天天传代一次。细胞的倍增时间为传代一次。细胞的倍增时间为传代一次。细胞的倍增时间为传代一次。细胞的倍增时间为16-20h16-20h16-20h16-20h。通常采用通常采用HPRTHPRTHPRTHPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与与TKTKTKTK（胸腺嘧啶核苷激酶）（胸腺嘧啶核苷激酶）（胸腺嘧啶核苷激酶）（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系缺陷型的骨髓瘤细胞系缺陷型的骨髓瘤细胞系缺陷型的骨髓瘤细胞系。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。骨髓瘤细胞处于对数生长期。2828pptppt课件课件3.3.细胞融合细胞融合 （1 1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤养液洗涤2 2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤液洗涤2 2次。次。（2 2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 1：1010或或1 1：5 5的比例混合在的比例混合在一起，在一起，在50ml50ml塑料离心管内用不完全培养液洗塑料离心管内用不完全培养液洗1 1次，离心，次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。弃上清，用滴管吸净残留液体。2929pptppt课件课件（3 3）3030秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEGPEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止全培养液，终止PEGPEG作用。作用。（4 4）离心，弃上清，用）离心，弃上清，用2020小牛血清等轻轻混悬。小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入将融合后细胞悬液加入9696孔板，孔板，100l100l孔，孔，3737、5 5COCO2 2孵箱培养。孵箱培养。3030pptppt课件课件4 4 融合细胞的筛选融合细胞的筛选 融合后的细胞类型融合后的细胞类型融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。细胞的多聚体等。正常的脾细胞在培养基中正常的脾细胞在培养基中存活仅存活仅存活仅存活仅5 5 5 57 7 7 7天天天天，无需特别筛选，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。细胞的多聚体形式也容易死去。剩余：剩余：脾细胞与瘤细胞的融合细胞脾细胞与瘤细胞的融合细胞脾细胞与瘤细胞的融合细胞脾细胞与瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞未融合的瘤细胞未融合的瘤细胞未融合的瘤细胞+融合融合融合融合的瘤细胞的瘤细胞的瘤细胞的瘤细胞和和瘤细胞瘤细胞瘤细胞瘤细胞，其中后两种需进行特别的筛选去除。，其中后两种需进行特别的筛选去除。3131pptppt课件课件HATHAT培养基筛选法培养基筛选法培养基中有三种关键培养基中有三种关键成分：成分：次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤（hypoxanthinehypoxanthine，H H H H）、）、氨基蝶呤氨基蝶呤氨基蝶呤氨基蝶呤（aminopterinaminopterin，A A A A）和和胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷（thymidinethymidine，T T），），所以取三者的字头称所以取三者的字头称为为HATHAT培养基。培养基。3232pptppt课件课件筛选原理筛选原理3333pptppt课件课件3434pptppt课件课件3535pptppt课件课件5.5.克隆化培养克隆化培养将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在一孔中的细胞数在0 0至数个细胞之间，培养一段时至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以间后取上清以ELISAELISA法选出抗体高分泌性的细胞。法选出抗体高分泌性的细胞。找出找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株针对目标抗原的抗体阳性细胞株针对目标抗原的抗体阳性细胞株针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。3636pptppt课件课件6.6.分泌抗体的融合细胞的筛选分泌抗体的融合细胞的筛选酶联免疫吸附法（酶联免疫吸附法（ELISAELISA）EILSAEILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成的反应，形成的抗原抗体复合物抗原抗体复合物抗原抗体复合物抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，加入酶反应的底物后，底底底底物被酶催化变为有色产物物被酶催化变为有色产物物被酶催化变为有色产物物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。3737pptppt课件课件7.7.单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的大量生产（1 1 1 1）实体瘤法）实体瘤法）实体瘤法）实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按对数生长期的杂交瘤细胞按1 13 310107 7cellscellsmlml接种于小鼠背部皮下，每处注射接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml0.2 ml。待肿瘤。待肿瘤达到一定大小后达到一定大小后(一般一般10102020天天)则可采血，从血则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg1-10mgmlml。采血量有限。采血量有限。3838pptppt课件课件（2 2）腹水制备法）腹水制备法腹腔注射腹腔注射1 110106 6个杂交瘤细胞，接种细胞个杂交瘤细胞，接种细胞7 71010天天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获管中，一般一只小鼠可获1 110ml10ml腹水。也可用注腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达腹水中单克隆抗体含量可达5 520mg/ml20mg/ml，这是目这是目前最常用的方法。前最常用的方法。3939pptppt课件课件（3 3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗单抗杂交瘤细胞杂交瘤细胞生物反应器生物反应器培养液培养液离心除去细胞，收集上清液提取抗体。离心除去细胞，收集上清液提取抗体。4040pptppt课件课件（五）人源化单克隆抗体简介（五）人源化单克隆抗体简介鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限性性:（1 1）不能有效地激活人体中补体和）不能有效地激活人体中补体和FcFc受体相关的效应系统受体相关的效应系统（2 2）被人体免疫系统所识别）被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体产生人抗鼠抗体(Human(Human antigen mouse antibody,HAMAantigen mouse antibody,HAMA)（3 3）在人体循环系统中很快被清除掉。）在人体循环系统中很快被清除掉。通过通过人源化改造人源化改造人源化改造人源化改造获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗体，解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应的问题。体，解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应的问题。4141pptppt课件课件人人人人鼠杂交瘤鼠杂交瘤鼠杂交瘤鼠杂交瘤：融合方法基本与鼠：融合方法基本与鼠鼠杂交瘤相同。亲鼠杂交瘤相同。亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B B细胞则来源于人细胞则来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但是，人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但是，人鼠鼠杂交瘤的人单克隆抗体杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳定分泌性能很不稳定分泌性能很不稳定分泌性能很不稳定，多数情况下，多数情况下杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。人人人人人杂交瘤：人杂交瘤：人杂交瘤：人杂交瘤：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合亲本人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合亲本细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳定并能细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳定并能产生一定量的具有特异性的抗体等特征。人产生一定量的具有特异性的抗体等特征。人人杂交瘤人杂交瘤核型稳定，然而遗憾的是可供利用的核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨髓瘤细胞种人类骨髓瘤细胞种人类骨髓瘤细胞种人类骨髓瘤细胞种类非常有限类非常有限类非常有限类非常有限。4242pptppt课件课件主要困难主要困难（1 1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2 2）获得抗原特异的人）获得抗原特异的人B B淋巴细胞十分困难，因为对人来淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的说，高度免疫获得抗原特异的B B淋巴细胞的方法显然是不淋巴细胞的方法显然是不可行的；可行的；（3 3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。4343pptppt课件课件（六）文献讨论（六）文献讨论4444pptppt课件课件4545pptppt课件课件异丙基硫代半异丙基硫代半乳糖苷乳糖苷 4646pptppt课件课件4747pptppt课件课件4848pptppt课件课件4949pptppt课件课件5050pptppt课件课件5151pptppt课件课件5252pptppt课件课件5353pptppt课件课件二二 病毒疫苗病毒疫苗5454pptppt课件课件灭活疫苗：灭活疫苗：灭活疫苗：灭活疫苗：通过化学、物理或简单加热的方法使病毒失去通过化学、物理或简单加热的方法使病毒失去在宿主体内生长复制的能力，但仍保留了病毒的免疫原性，在宿主体内生长复制的能力，但仍保留了病毒的免疫原性，接种人体后能产生对此病毒的抵抗力，这种将病毒杀灭后接种人体后能产生对此病毒的抵抗力，这种将病毒杀灭后制备的疫苗被称为灭活疫苗。制备的疫苗被称为灭活疫苗。常用甲醛为灭活剂，灭活病毒核酸而不影响其抗原性。例常用甲醛为灭活剂，灭活病毒核酸而不影响其抗原性。例如：流行性乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗、流感灭活疫苗。如：流行性乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗、流感灭活疫苗。减毒活疫苗：减毒活疫苗：减毒活疫苗：减毒活疫苗：采用自然法或人工法通过动物传代或细胞传采用自然法或人工法通过动物传代或细胞传代筛选对人毒性低的变异株病毒。常见的有脊髓灰质炎疫代筛选对人毒性低的变异株病毒。常见的有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗（如麻疹、疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗（如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗）。腮腺炎、风疹联合疫苗）。5555pptppt课件课件病毒灭活疫苗病毒灭活疫苗病毒需要在敏感细胞中才能增殖。通过动物细胞培养繁殖病毒需要在敏感细胞中才能增殖。通过动物细胞培养繁殖病毒。病毒。大致步骤：大致步骤：1.1.找到病毒敏感细胞找到病毒敏感细胞2.2.进行病毒的分离进行病毒的分离3.3.3.3.病毒生产病毒生产病毒生产病毒生产4.4.动物实验动物实验5.I5.I、IIII、IIIIII期临床实验期临床实验6.6.灭活疫苗制品灭活疫苗制品5656pptppt课件课件病毒生产方法病毒生产方法1.1.1.1.动物接种动物接种动物接种动物接种：例如狂犬病毒，采用鼠、兔脑内接种后收取：例如狂犬病毒，采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。脑组织制成悬液。2.2.2.2.鸡胚、鸭胚接种：鸡胚、鸭胚接种：鸡胚、鸭胚接种：鸡胚、鸭胚接种：如马脑炎病毒采用如马脑炎病毒采用10D10D龄鸡胚接种，龄鸡胚接种，收获全胚体液。收获全胚体液。3.3.3.3.细胞培养法：细胞培养法：细胞培养法：细胞培养法：不同的病毒采用相应的敏感细胞，接种一不同的病毒采用相应的敏感细胞，接种一定量的病毒，培养一段时间，冻融细胞，离心收获上清。定量的病毒，培养一段时间，冻融细胞，离心收获上清。5757pptppt课件课件一般流程：一般流程：流行性乙型脑炎病毒灭活疫苗制备工艺流行性乙型脑炎病毒灭活疫苗制备工艺地鼠肾地鼠肾剪碎，胰酶消化剪碎，胰酶消化地鼠肾细胞悬浮地鼠肾细胞悬浮液液培养培养接种病毒感染细胞接种病毒感染细胞培养培养2-32-3天天收获病毒液收获病毒液甲醛灭活（甲醛灭活（2222，8 8天）天）灭活灭活病毒液病毒液安全及效力实验安全及效力实验半成品半成品分装分装成品成品5858pptppt课件课件文献讨论文献讨论狂犬病毒（狂犬病毒（狂犬病毒（狂犬病毒（Rabies VirusRabies VirusRabies VirusRabies Virus）疫苗生产）疫苗生产）疫苗生产）疫苗生产5959pptppt课件课件狂犬病是由狂犬病毒（狂犬病是由狂犬病毒（狂犬病是由狂犬病毒（狂犬病是由狂犬病毒（Rabies VirusRabies VirusRabies VirusRabies Virus）引起的人畜共患的传染病引起的人畜共患的传染病引起的人畜共患的传染病引起的人畜共患的传染病狂犬病毒属于弹状病毒科弹状病毒属。外形呈弹状，核衣狂犬病毒属于弹状病毒科弹状病毒属。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNARNA。是引起。是引起狂犬病的病原体。狂犬病的病原体。人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病。感染者发病时呈高度兴奋状态，并伴有发热、头痛、犬病。感染者发病时呈高度兴奋状态，并伴有发热、头痛、恐怖不安、惊风怕声、肢体发麻、吞咽困难，一旦喝水即恐怖不安、惊风怕声、肢体发麻、吞咽困难，一旦喝水即引起严重痉挛等症状，出现恐水现象，故又称引起严重痉挛等症状，出现恐水现象，故又称“恐水症恐水症”（hydrophobiahydrophobia）。）。6060pptppt课件课件6161pptppt课件课件6262pptppt课件课件http:/.hk/search?q=%E4%B8%99%E5%86%85%E9%85%AF&btnG=%E6%90%9C%E7%B4%A2&hl=zh-CN&source=hp&aq=f&aqi=&aql=&oq=6363pptppt课件课件6464pptppt课件课件三三 动物细胞培养生产相关药物动物细胞培养生产相关药物6565pptppt课件课件干扰素（干扰素（干扰素（干扰素（InterferonInterferonInterferonInterferon，IFNIFNIFNIFN）是一种细胞因子，是真核细胞对是一种细胞因子，是真核细胞对各种刺激反应后形成的一组复杂的蛋白质（主要是糖蛋白）。各种刺激反应后形成的一组复杂的蛋白质（主要是糖蛋白）。生理作用生理作用生理作用生理作用主要有：（主要有：（1 1）广谱的抗病毒作用；（）广谱的抗病毒作用；（2 2）抑制某些）抑制某些细胞的生长，例如：抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞细胞的生长，例如：抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和造血细胞的增殖；（和造血细胞的增殖；（3 3）免疫调节作用；（）免疫调节作用；（4 4）抑制和杀伤）抑制和杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞。天然干扰素主要用人白细胞、类淋巴细胞、成纤维细胞或天然干扰素主要用人白细胞、类淋巴细胞、成纤维细胞或T T淋淋巴细胞诱生，提取和纯化后获得。巴细胞诱生，提取和纯化后获得。6666pptppt课件课件类淋巴细胞干扰素制备类淋巴细胞干扰素制备类淋巴细胞干扰素制备类淋巴细胞干扰素制备19751975年，美国的斯爵德（年，美国的斯爵德（StranderStrander）等发现）等发现NamalvaNamalva细胞细胞（BurkittBurkitt淋巴瘤）具有高效的干扰素诱生能力。淋巴瘤）具有高效的干扰素诱生能力。培养基用培养基用RPMI1640RPMI1640加加3%3%（v/vv/v）小牛血清和）小牛血清和0.75%0.75%的（的（w/vw/v）的）的PrimatonePrimatone(一种动物组织的可溶性消化物一种动物组织的可溶性消化物)。待细胞密度达。待细胞密度达10106 6/mL/mL细胞浓度时开始进行干扰素诱生。细胞浓度时开始进行干扰素诱生。盐酸酸化至盐酸酸化至pH2.0pH2.0，44存放，仙台病毒灭活存放，仙台病毒灭活2 2天、天、NDV-FNDV-F病毒灭病毒灭活活5 5天。氢氧化钠中和至天。氢氧化钠中和至pH7.0pH7.0得到类淋巴细胞干扰素粗品。得到类淋巴细胞干扰素粗品。干扰素粗品的纯化采用干扰素粗品的纯化采用3%3%三氯醋酸沉淀三氯醋酸沉淀,去除上清，沉淀溶于去除上清，沉淀溶于0.1m0.1m磷酸钾缓冲液中（磷酸钾缓冲液中（pH8.0pH8.0）（内含）（内含0.5%TritonX-1000.5%TritonX-100），用），用ACA54ACA54柱超滤胶分离，再经三氯醋酸沉淀后去上清，沉淀溶于磷柱超滤胶分离，再经三氯醋酸沉淀后去上清，沉淀溶于磷酸缓冲液（酸缓冲液（pH8.0pH8.0）中，回收率可达）中，回收率可达80%80%。分装。分装-20-20冻存，纯度冻存，纯度为为2 210108 8IU/mgIU/mg蛋白。蛋白。6767pptppt课件课件补充文献（课后阅读）补充文献（课后阅读）PAI-1（I型纤溶酶原激活物抑制剂）、tPA（组织型纤溶酶原激活剂）是血浆纤血浆纤溶活性的重要溶活性的重要调节因子调节因子6868pptppt课件课件四四 动物细胞大规模培养生产药物存在问动物细胞大规模培养生产药物存在问题与发展方向题与发展方向（1 1）细胞密度低，产物浓度低细胞密度低，产物浓度低细胞密度低，产物浓度低细胞密度低，产物浓度低。（2 2）大规模、长时间）大规模、长时间培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物活性易降低活性易降低活性易降低活性易降低。（3 3）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵昂贵昂贵昂贵。因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力。因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力。（4 4）目前对目前对细胞代谢和生长动力学细胞代谢和生长动力学细胞代谢和生长动力学细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。的研究比较欠缺。（5 5）在线监测水平技术不完善在线监测水平技术不完善在线监测水平技术不完善在线监测水平技术不完善，限制了优良培养系统的开发。，限制了优良培养系统的开发。6969pptppt课件课件今后应重点开展的工作今后应重点开展的工作（1 1）细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面的理论研细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面的理论研究。究。（2 2）开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。（3 3）开发细胞生长性能优良、细胞解离容易，并能重复开发细胞生长性能优良、细胞解离容易，并能重复使用的新型廉价的微载体。使用的新型廉价的微载体。（4 4）研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌生物研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌生物反应器培养系统与工艺、先进的在线检测、分析与自动控反应器培养系统与工艺、先进的在线检测、分析与自动控制技术等。制技术等。（5 5）基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。）基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。7070pptppt课件课件本节回顾本节回顾单克隆抗体单克隆抗体病毒疫苗病毒疫苗动物细胞培养主要是提供一个载体增殖的支撑技动物细胞培养主要是提供一个载体增殖的支撑技术，需要其他技术配合，才能高效制备相关产品术，需要其他技术配合，才能高效制备相关产品7171pptppt课件课件思考题1.1.1.1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？提示：提示：提示：提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。动物细胞融合是两个体细胞直接融合。7272pptppt课件课件2.2.2.2.制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用B B B B淋巴细胞和骨髓瘤细淋巴细胞和骨髓瘤细淋巴细胞和骨髓瘤细淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？胞融合形成杂交瘤细胞？胞融合形成杂交瘤细胞？胞融合形成杂交瘤细胞？提示：提示：提示：提示：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B B淋巴细胞，淋巴细胞，淋巴细胞，淋巴细胞，B B淋淋淋淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种程中，每一种程中，每一种程中，每一种B B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B B淋巴细胞大量增殖。淋巴细胞大量增殖。淋巴细胞大量增殖。淋巴细胞大量增殖。B B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖。淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖。淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖。淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖。骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。产生抗体。产生抗体。产生抗体。因此，把一种因此，把一种因此，把一种因此，把一种B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性胞，它会兼有两个亲本细胞的特性胞，它会兼有两个亲本细胞的特性胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，在体外培养条件下能不断增殖，在体外培养条件下能不断增殖，在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。同时能产生出某种特异性的抗体。同时能产生出某种特异性的抗体。同时能产生出某种特异性的抗体。7373pptppt课件课件3.3.3.3.为什么不用两个而用多个细胞为什么不用两个而用多个细胞为什么不用两个而用多个细胞为什么不用两个而用多个细胞进行细胞融合？进行细胞融合？进行细胞融合？进行细胞融合？提示：提示：提示：提示：就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是还是生物的方法，其融合率都不可能是100%100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个可多达百万种以上，但是每一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含仅取一个脾细胞（含B B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。7474pptppt课件课件4.4.4.4.杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？提示：提示：融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用用“有限稀释法有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3 34 4次，次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。的克隆化培养。7575pptppt课件课件扩展学习文献扩展学习文献7676pptppt课件课件下节内容下节内容转基因生物反应器生物制药转基因生物反应器生物制药预习思考题：预习思考题：预习思考题：预习思考题：转基因生物反应器的优势与问题是什么？转基因生物反应器的优势与问题是什么？7777pptppt课件课件