第七章体内药物浓度法(已修改)课件

第二章第二章 体内药物浓度法体内药物浓度法第一节第一节 体内药物浓度测定样本与实验动物体内药物浓度测定样本与实验动物 种属的选择种属的选择第二节第二节 建立中药体内药物浓度测定方法的建立中药体内药物浓度测定方法的 技术要求技术要求第三节第三节 常用的中药体内药物浓度测定方法常用的中药体内药物浓度测定方法 第一节第一节 测定样本与实验动物种测定样本与实验动物种属的选择属的选择对于有效成分明确且有效成熟的定量分析方法测定的中药，可采用此法。一、测定样本一、测定样本 常用的测定样本有：血液血液（血浆、血清、全血）、尿液尿液、唾液唾液、泪液泪液（眼用制剂）、乳汁乳汁（乳汁排除药物对乳儿的影响）、脏器匀浆等脏器匀浆等.二、实验动物的选择二、实验动物的选择1、尽可能与药理学、毒理学研究一致，以便联系药效学进行分析讨论。2、最好从同一只动物多次采样，采样时间采样时间为自变自变量量，必须准确，操作迅速。3、小鼠、大鼠、兔（口服不用）、犬较为常用。第二节第二节 测定方法的技术要求测定方法的技术要求一、一、灵敏度高 血药浓度常在ng/mlng/ml级。二、二、专一性强 能排除排除药物代谢产物及机体 内源性物质的干扰干扰。三、三、准确度高，精密度高四、四、快速、简便 第三节第三节 常用的中药体内药物常用的中药体内药物浓度测定方法浓度测定方法 一、分光光度法一、分光光度法 （一）（一）紫外分光光度法紫外分光光度法 （二）（二）荧光分光光度法荧光分光光度法 （三）（三）原子吸收光谱法原子吸收光谱法 二、色二、色 谱谱 法法 （一）薄层层析（一）薄层层析（TLCTLC）法）法 （二）高效液相（二）高效液相（HPLCHPLC）法）法 （三）气相色谱（三）气相色谱（GCGC）法）法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是在经典液相色谱和气象色谱的理论与技术上发展起来的一种现代化色谱分析方法。该法由于采用高效固定相、高压输液泵、高灵敏检测器等新技术，从而成为色谱法中应用最为广泛的一种分析方法。具有样品适用范围广，预处理简单，快速，灵敏，专一等优点。1.HPLC法的选择法的选择高效液相色谱法的种类较多，包括液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相或反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法、凝胶色谱法。选择色谱方法必须考虑所分离化合物的化学结构和溶解度。关于选择各类高效液相色谱法的原则见下图。样品分子量 10000凝胶色谱2.检测器的分类及选择检测器的分类及选择 紫外检测器紫外检测器（UVDUVD）：主要有以下几种类型：固定波长型固定波长型：用得较多的是波长为254nm的紫外光。因大多数芳香族、芳杂环、稠芳环等在此处均有吸收。可调波长型可调波长型：相当于一台紫外可见分光光度计。由于波长可任意调整，可以选择试样的最大吸收波长进行检测，提高灵敏度。扫描型扫描型：不仅可选择波长，还有快速扫描装置，记录组分的吸收光谱，使定性分析更方便。光电二极管阵列型光电二极管阵列型：一次操作可获得包括波长、吸收值和时间在内的三维谱图，还可得到难分离组分重叠峰的有关信息。荧光检测器（荧光检测器（FLDFLD）：）：相当于一台荧光光度计。基于某些荧光物质吸收一定波长紫外光后发射出荧光，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSDELSD）：）：其基本原理是样品气化后，溶质粒子的散射光强度与其浓度成正比。此外还有视差折光检测器视差折光检测器、电化学检测器电化学检测器等等。3.3.样品预处理技术（1 1）试样的预处理：）试样的预处理：生物样品中含有蛋白质和其它干扰物质，处理不好直接影响柱子的寿命和柱效。另外体液中药物及代谢产物含量很低，还需尽可能加以浓缩。除去蛋白质等其它干扰物质，加入沉淀剂改变蛋白质等电点溶剂提取法 酸性物质酸化 然后用与水不相溶的溶剂 碱性物质碱化 提取 表（7-16）列出了一般药品的提取方法。表7-16一般药品提取方法样品性质 提取方法 水溶性样品 1.酸性药物及其盐 有机溶剂提取杂质后调成酸性,再加入有 机溶剂提取,或在N2流吹下,用适当溶剂溶 解后进样。2.碱性药物及其盐 有机溶剂提取杂质后调成碱性，再加入有 机溶剂提取，可直接进样，或在N2流下吹干，用适当溶剂溶解后进样。3.中性药物 有机溶剂提取后，直接用反相色谱法分析。脂溶性样品 有机溶剂提取后，或进样，或在N2流下吹 干，用适当溶剂溶解后进样。薄层色谱或预柱色谱分离活性碳氧化铝填充剂离子交换树脂等膜过滤法：以一定大小孔径的微孔膜，除去一定分子量以上的物质如蛋白质、细胞等。（2 2）衍生物制备：）衍生物制备：对于无紫外和荧光吸收的药物可采用化学衍生法。将样品经过简单的处理，引入对紫外或荧光吸收性强的发色团，使其生成在紫外区有强吸收或能发射荧光的衍生物，提高检测灵敏度和选择性。包括柱前和柱后衍生。柱前衍生：柱前衍生：将样品制备成衍生物后再进样，此法不改变仪器结构，但分离度较差；柱后衍生：柱后衍生：色谱柱流出液与反应液柱后混合，反应后再进入检测器。此法需改变仪器结构，但分离度高。例如：例如：a.十二烷基硫磺酸钠作胶束试剂使延胡索乙素的荧光强度增大5.5倍。b.-CD包合物增敏荧光法可降低秦皮甲、乙素的最低检出浓度，进行微量痕量检测。4.4.常见定量法常见定量法（1 1）归一化法：）归一化法：将样品中所有出峰组分含量之和作为100%，求出其中某一组分含量百分数的方法。计算公式为：其中C Ci i%：i组分的重量百分含量f fi i：i组分的校正因子（由于检测器对各组分的灵敏度不同，同样浓度在色谱图上呈现的面积并不相同，因此应校正。fi可通过有关手册查到。）归一化法优优点点：方法简便，结果比较准确，定量结果与进样量无关，操作条件变化对结果影响较小。缺点缺点：所有组分都必须在在操作时间内流出色谱柱，且检测器对它们都产生信号。（2 2）内标法：）内标法：是指向样品溶液中准确加入一定量的纯物质作内标物进行液相分析，根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积之比，求出待测组分含量。测定方法：测定方法：准确称量样品M克，取一纯物质（内标物）适量Ms，加入样品中，混匀，进样。根据待测组分i的峰面积（Ai）及内标物的峰面积（As），依据下列关系可求出样品中i组分的百分含量Ci%。因为所以 对内标物的要求：对内标物的要求：内标物在结构上或官能团类型上与被测组分相似，但应为原样品中所不含有的组分，否则会使峰重叠而无法准确测量内标物的峰面积。内标物的保留时间应与待测组分相近，但能完全分开。内标物必须是纯度合乎要求的纯物质。内标法具备归一化法的优点，只要被测组分与内标物产生信号即可定量，结果比较准确，不需准确进样，很适合于中草药及其复方某些有效成分的血药浓度测定。缺点：每次分析都要准确称量样品和内标物的重量，而且理想的内标物不易寻找。（3 3）外标法：）外标法：内标物不易选定时，可用外标法。外标法又分工作曲线法分工作曲线法与外标一点法外标一点法等。工作曲线法：工作曲线法：配制欲定量组分对照品一系列浓度的标准溶液，准确进样，测量其峰高或峰面积。以峰高或峰面积对标准液的浓度绘制工作曲线。然后再按相同操作条件进行样品测定，测出待测组分的峰高或峰面积，利用工作曲线定量。外标一点法：外标一点法：工作曲线法计算含量时会出现两种情况：标准曲线过原点，截距为零；标准曲线不过原点，截距不为零，说明系统存在误差。当截距为零时，可用外标一点法定量。CCAA定义：定义：用已知浓度的标准溶液，同量进样多次，算出峰面积平均值，然后取样品溶液在相同条件下操作，所测得的峰面积按下式计算含量：外标一点法要求进样量准确及测试条件恒定。实例实例1 兔血浆中丹皮酚的高效液相色谱法测定兔血浆中丹皮酚的高效液相色谱法测定 按按 本例采用HPLC内标测定法，请注意内标物苯乙酮选择的基本要求苯乙酮选择的基本要求：其在化学结构上与被测物质丹皮酚丹皮酚相似，但又非原样品中所含有的组分，两者的保留时间相近，但又能完全分开。因丹皮酚丹皮酚具有挥发性，故在血样处理时采用了乙腈沉淀法。结果较为满意，可供类似成分药物动力学研究参考。1.1.实验部分实验部分 1.11.1标标准准曲曲线线制制备备 精密称取丹皮酚4mg置25ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度(0.16mg/ml)。分别吸取5、10、20、40、80、120l置具塞离心管中，分别加入苯乙酮溶液15l；加兔血浆1ml，乙腈5ml，补加蒸馏水至8ml，混匀，离心(2000r/min)15min。上层液通过SPE C18，取收集液进样20l，测量峰高，计算丹皮酚与苯乙酮的峰高比。用最小二乘法回归，得得浓浓度度对对峰峰高比的回归方程高比的回归方程为：1.2兔血浆中丹皮酚浓度的测定兔血浆中丹皮酚浓度的测定 丹皮酚溶液的制备：称取丹皮酚300mg，以无水乙醇10ml溶解，再加1,2-丙二醇7ml混合。此液逐渐加到灭菌蒸馏水中至30ml，过滤。滤液于100，30min灭菌即得。Y=15.151X-0.00382 (n=6)，r=0.9973 选择体重在2.5kg以上New Zaland兔3只，按30mg/kg由耳静脉注射丹皮酚溶液耳静脉注射丹皮酚溶液，然后在2、5、15、20、30、45、60、90、120、180、240和360min时取取血血，并立即离心(2000 r/min)10min，分离血浆。分别取上述各时间的血浆1ml，置具塞离心管中，加乙腈5ml，苯乙酮溶液15l，混合后补加蒸馏水至8ml，混合。其余操作同标准曲线项下。测定丹皮酚与内标物的峰高比，代入回归方程计算血药浓度（见表7-18），并绘制药-时曲线（见图7-9）。对3只家兔静注后6h体内丹皮酚血浆浓度测定的数据用计算机按两室模型进行处理，得药物动力学参数（见表7-19）。表表7-18 静注后不同时间兔血浆中丹皮酚浓度静注后不同时间兔血浆中丹皮酚浓度 浓度（ug/ml血浆）时间（min）No1No2No3平均233.0332.6031.2032.48518.8017.5313.9216.751016.3016.9911.9415.081512.9911.199.1511.112010.838.298.459.19309.208.027.288.17458.537.766.417.56606.706.245.756.17903.793.973.293.621203.353.232.763.111801.251.311.211.262400.900.980.970.953600.780.870.820.82表表7-197-19 静脉注射丹皮酚溶液兔体内药物动力学参数静脉注射丹皮酚溶液兔体内药物动力学参数 K12 K21 K10T1/2（）T1/2（）V Q AUC（h-1）（h-1）（h-1）（h）（min）（L）（L/h）（hg/ml）10.59030.63820.95122.114122.4516.225.3223.1321.67810.34071.03115.779814.1953.726.4418.6330.62960.58650.81142.558123.6721.965.8520.52平均0.9660.52180.93123.48420.1030.635.8720.762.2.讨论讨论 通过残数平方和与拟合度计算，丹皮酚静脉注射给药为双室模型。分布半衰期仅20min，说明该药进入体内很快分布到有关器官和组织，迅速发挥药效。消除半衰期是3.5h左右，表明在体内停留时间不长。从药物动力学参数可以看出，丹皮酚在兔体内动力学参数存在一定的个体差异。实例实例2 2 三三维维HPLCHPLC等等四四谱谱研研究究川川芎芎伍伍用用丹丹参参煎煎剂剂对对川芎嗪药物动力学的影响川芎嗪药物动力学的影响中药复方成分复杂，特异性是其浓度测定方法的难点，本例选用多种先进分析仪器，较好的地决了这一问题。对比分析图（7-10）A、B、C所示各峰形，结合结果部分文字说明，体会实验方案设计的思路。其中关于如何判断样品预处理去除蛋白的效果，以及关于四谱鉴定样品来源的确认都具有一定的启迪作用。1.实验方法(略)2.实验结果2.1 TMP和内标安眠酮的保留时间分别为3.992min和6.223min，见图（7-10）。空白血清色谱图为A部分；灌胃川芎煎剂后取血清经处理色谱图见C部分；说明样品预处理去蛋白效果好，血清中TMP和内标没有杂峰干扰（B部分）；灌胃川芎煎剂后图中的1号蜂为TMP，与未知的6、7峰较好分离（C部分）；灌胃川丹合剂后在5与6号峰之间增加一新的峰（未列图）。空白双蒸水与川芎煎剂的三维色谱图（体外）比较后表明：TMP一个峰出现在保留时间（Rt）为2.98min、紫外吸收波长（UV）为280nm处；另一峰出现在Rt 2.98min、UV 210nm处并与杂峰重叠。空白血清、川芎煎剂（体外）与川芎煎剂（30g/kg）灌胃大鼠后1m1血清样品三维色谱图比较表明：TMP峰Rt和UV一致，但峰形较低；B峰（Rt 18min，UV 220nm，从图上分析该处至少有2个峰，但难以分开）降低后另外出现一峰（Rt 2.2min，UV300nm）；A与C峰则消失。2.2 2.2 四谱鉴定结果：四谱鉴定结果：紫外：紫外：maxH2O288nm；红红外外光光谱谱：3000，1455，1420，1370，1240，1210，1195，1005，815cm-1；核磁共振氢谱：核磁共振氢谱：呈现甲基峰2.45（单峰）；质质 谱谱：（分 子 离 子 峰 136）主 要 碎 片 有m/e95（CH3CNCCH3=CCH3），m/e54（CH3CCCH3+），m/e42（CH3CNH+），m/e39（CH3CC+）综合分析以上数据，与文献报道的TMP基本符合，证明大鼠灌胃川芎煎剂后血清中所提取的1号组分即为TMP，其他组分还待进行解析。2.32.3 健康Wister 大鼠灌胃川芎煎剂与川丹合剂后不同时间血清药物浓度，见表（7-20）；药物动力学参数（一级吸收速率常数（Ka），半吸收期（T1/2Ka），血药-时曲线下面积（AUC）见表（7-21）。表表7-20川芎煎剂和川丹合剂灌胃大鼠后不同时间川芎煎剂和川丹合剂灌胃大鼠后不同时间血清药物含量比较（s）血清药物含量（ug/ml）组 别0.08h0.25h0.50h0.75h1.00h1.50h2.00h3.00h5.00h川芎煎剂0.6520.8740.5920.4750.3630.2990.2430.1480.053s0.4870.1800.2710.2480.2620.1030.1120.0790.031川丹煎剂0.4680.5710.3920.3300.2350.1780.1660.0880.034s0.0810.231*0.1840.1780.1250.061*0.0830.0610.013注：两组各6只大鼠；与川芎煎剂比较*P0.05表表7-21 健康大鼠一次川芎煎剂、川丹合剂灌胃健康大鼠一次川芎煎剂、川丹合剂灌胃川芎嗪川芎嗪药物动力学参数比较（s）Ka K10K12 K21T1/2Ka t1/2t1/2AUC Vc/F 组别（h-1）（h）（ugh/ml）（L/kg）川芎煎剂 1.9280.47919.5801.0900.4700.8470.0360.3541.4481.273 9.665 s 0.7190.2054.1390.5020.1600.2470.0240.1010.8800.2551.810川丹煎剂 2.3280.47911.5080.7380.2051.5110.0600.2981.4470.8367.390s 0.7190.2892.821*0.2550.0920.471*0.0200.2230.9010.168*1.089*注：两组各6只大鼠；与川芎煎剂比较*P0.05，*P0.013.3.讨论讨论3.13.1 传统二维HPLC法研究单体化合物时，仅以对照品与样品色谱峰是否保留时间一致及峰形重叠来定性，是严谨，因为一个峰也可能是分离不开的两个化合物；川芎煎剂成分复杂，更造成定性错误。本实验采用二极管阵列的3D-HPLC和四谱方法鉴定，更加科学和精确。3.2 3.2 川川芎芎汤汤剂剂体体内内外外化化学学成成分分分分析析：3D-HPLC测定时较2D-HPLC的测定结果多一个未知化合物，说明三维多信息检测的优势，且川芎汤剂的化学成分在体内外有所变化。在川芎煎剂给大鼠灌胃后血清样品的三维色谱图中少一种组分，可能是由于三氯甲烷萃取时丢失所致。所以仍需进一步完善样品预处理方法以更真实地反映血中川芎煎剂化学成分的变化。3.3 3.3 川芎煎剂与川丹合剂比较川芎煎剂与川丹合剂比较：（1）0.25h:血药浓度 1.53倍倍 AUC值 1.52倍倍，说明川川丹丹合合剂剂生生物物利利用用度度低低，是是丹丹参参干干扰扰拮拮抗抗导导致致“相恶相恶”效应。效应。（2）Ka、t1/2Ka值川芎煎剂川丹合剂组，由由于于丹丹参参伍伍用用导致导致TMPTMP吸收减慢。吸收减慢。这有助于解释临临床床较较少少以以川川芎芎单单独独伍伍用用丹丹参参的的原原因。因。以上为我们提出的“复方药物动力学”假说提供了初步实验依据。这种伍用丹参“相恶相恶”效应，一方面是共煎时川丹合剂中TMP与川芎煎剂相比仅仅81.52%81.52%溶出溶出，即这种“相恶”发生于体外体外；另一方面则是由于增加丹参等于增加了多种化学成分在体内干扰体内干扰，其机制十分复杂，有待进一步探讨。机制十分复杂，有待进一步探讨。三、免疫法三、免疫法 免疫法是七十年代发展起来的新的检测技术，免疫法是七十年代发展起来的新的检测技术，用于体内药物的分析具有以下特点用于体内药物的分析具有以下特点:取样量小，取样量小，专一性强，专一性强，灵敏度高。灵敏度高。常有以下两种方法：常有以下两种方法：放射放射免疫法（免疫法（RIARIA）酶酶免疫法（免疫法（EMIAEMIA），），它们的它们的检测限可达检测限可达0.001ng0.001ng。放射免疫法放射免疫法 含含义义：一种将放射性同位素技术与免疫化学技术相结合的体外测定超微量（10-9_10-10g）物质的新技术。它兼有这两种技术的特征：同位素技术的高灵敏度、精确性 抗原抗体免疫反应的专一性 这一分析技术已发展成为一门独立的方法学学科，在蛋白质、多肽激素以及某些非激素、癌相关抗原等的测定方面有广泛的应用。基本原理：基本原理：是一种竟争性结合反应。将高度纯化的待待测测药药物物标标准准品品作为抗抗原原（AgAg）免疫动物，使其产生特异性抗体（抗体（AbAb），），然后将待测药物标准品用放射性同位素（3H、131I、125I、13C等）标记成标记抗原（标记抗原（*AgAg），），再将*AgAg、待测药物AgAg（为非标记抗原）混合培育混合培育，和抗体AbAb 使竞竞争争性性结结合合反反应应达到平平衡衡。其基本反应如下：*Ag *Ag-Ab+*Ag Ag Ag-Ab+Ag *Ag和Ab的量保持恒定（人为控制），当*Ag与Ag之和大于Ab上有效结合点数目时，Ag和*Ag 就要争夺Ab来结合成相应的*Ag-Ab（结合标记抗原）和Ag-Ab（结合非标记抗原）。+Ab 反应达到平平衡衡时，反应产物中*Ag-AbAg-Ab量量的多少随随着着AgAg（样样品品中中待待测测物物的的浓浓度度）的的量量而而改改变变的。Ag量越大，竞争Ab的机率比*Ag 竞争Ab的几率越大，形成*Ag-Ab量就越少。Ag量越小，竞争Ab的几率也相应减少，形成*Ag-Ab的量就越多。将Ag量与*Ag-Ab量之间的数量关系作成曲线竞争结合曲线，就是放射免疫分析定量的基础。竞争结合曲线的表示方法：竞争结合曲线的表示方法：B:B:*Ag-Ab F:F:*Ag 纵坐标纵坐标标记抗原*Ag的结合率结合率B/FB/F（结合状态放射性B与游离状态放射性F的比值），或结合百分率结合百分率B%B%（结合状态的放射性B占总放射性（B+F）的百分数）；横坐标横坐标待测药物（非标记抗原Ag）的对数浓度。样品的测定：样品的测定：测定未知样品中Ag含量时，a.用待测药物标准品配制一系列Ag，作出标准结合曲线；b.根据未知样品得到的B/F或B%从标准曲线上查出相应待测样品中Ag的量。使用放射免疫法（使用放射免疫法（RIARIA）的必需条件：）的必需条件：（1）高纯度比放射性同位素标记抗原抗原；（2）特异性抗体抗体；（3）有效的分离方法分离方法:结合标记抗原（*Ag-AbAg-Ab）与 分离(以分别计数)非结合标记抗原（*AgAg）实例实例 黄夹次苷甲和次苷乙的放射免黄夹次苷甲和次苷乙的放射免疫测定及其药物动力学疫测定及其药物动力学 结结合合本本例例，可可将将放放射射免免疫疫法法研研究究药药动动学学的的主主要要步步骤总结如下：骤总结如下：（1）准备待测药物标准品、放射性同位素，配制专用测定试剂；a.a.标记抗原标记抗原：用氚爆射法将3H标记在黄夹次苷乙上；b.b.制制备备特特异异性性抗抗体体：在家兔上注射活卡介苗，两周后注射抗原乳化液，使生成特异性抗体（抗血清）。（2）实验动物给药给药（黄夹次苷乙），不同时间点采集血样采集血样；（3）将抗体、动物血浆、放射性标记抗原混合，在一定条件下培育，使竞争性结合反应竞争性结合反应完全；（4）分离分离结合标记抗原和游离标记抗原，测定放射性，计算计算，即得。其流程简述如下：待测Ag样品液（即待测血样）标准Ag液（标准品黄夹次苷乙+空白血样）加入抗体Ab加标记抗*Ag分离 测定放射性 绘制标准曲线，求回归方程 由标准曲线或回归方程求含量 求算药物动力学参数 1.1.实验方法实验方法(略略)2.2.实验结果实验结果 2.1 2.1 抗体鉴定抗体鉴定 2.1.1 2.1.1 抗抗体体滴滴度度和和标标准准曲曲线线：免疫三个月后兔体内已产生抗体，六个月后滴度达1:800左右。用此抗体作标准曲线，如图7-20所示。2.1.2 2.1.2 抗体的特异性和测定灵敏度：抗体的特异性和测定灵敏度：类似化合物间的交叉反应按下式计算：Y50和E50分别为两个化合物的半数抑制量如图7-21所示，抗体与次苷乙的交叉反应率约为100%，与单乙酰次苷乙的交叉反应率较小（20%），与地高辛的交叉反应率仅为0.4%，与皮质酮的交叉反应率则低于0.2%。2.2 2.2 测定条件测定条件2.3 2.3 黄夹苷成分的生物利用度黄夹苷成分的生物利用度 将豚豚鼠鼠随机分为6组（每组34只）,静脉注射或灌胃次苷甲、次苷乙或强心灵后的血药时程见图7-22和7-23。由图可见，次次苷苷甲甲和次次苷苷乙乙在动物体内的动力学行为符合线性二二室室模模型型，药物动力学参数如表7-28所示。表表7-28 豚鼠单次静注或灌胃次苷甲、次苷乙后的药动学参数豚鼠单次静注或灌胃次苷甲、次苷乙后的药动学参数(180ug/kg)次苷甲次苷乙参数静注口服静注口服A(ng/ml)321.2312.34221.989.22B(ng/ml)25.6920.75(h-1)5.233.73(h-1)0.330.10T1/2(h)0.130.230.190.09T1/2(h)2.132.556.797.04K12(h-1)2.392.51K21(h-1)4.873.41Ke(h-1)2.470.270.900.10Ka(h-1)3.067.76V1(L/kg)0.520.77Vd(L/kg)3.9416.016.7819.76AUC(ug/h/kg)140.3841.40260.0492.50CL(L/kg/h)1.284.350.691.95Tm(h)0.870.57Cm(ng/ml)8.888.61 Lag time(min)0.000.023.3.讨论讨论 实验表明，所制备的抗体特异性较高，和地高辛及皮质酮的交叉反应小，与单乙酰次苷乙的交叉反应仅为20%，此抗体对次苷甲和次苷乙均呈特异性结合，交叉反应率100%，这是由于次苷甲与次苷乙有区别的C在连接牛血清白蛋白时被占据，而其它部分二者完全相同所致。此法的优点为此法的优点为:能分别测定次苷甲和次苷乙;还能测定强心灵中含量达80%的起主要强心效力的次苷甲及次苷乙之和。本研究观察到口服次苷甲、乙和强心灵吸收较快，次苷甲的血药浓度在52min达高峰，次苷乙在34min。次苷甲、乙和强心灵的生物利用度都较低生物利用度都较低（2735%），这是由于吸收不完全，还是首过效应所致，有待进一步研究。大鼠大鼠口服次苷乙生物利用度较高生物利用度较高，与本实验结果不一致，这可能是由于种属差异种属差异所致。四、微生物法及其它生物测定法四、微生物法及其它生物测定法 具抗菌活性抗菌活性的中药复方制剂，如 黄连解毒汤、清瘟败毒饮、大黄牡丹皮汤等 可选择适宜试试剂剂菌菌株株，利用微微生生物物法法测定体体液液样样品品的的浓浓度度，然后拟合模型计算药物动力学参数。基本原理：基本原理：抗菌成分在琼脂平板中对细菌产生抑菌环抑菌环大小与其浓度对数成线性关系，大小与其浓度对数成线性关系，借用对照品的浓度与抑菌环大小的标准曲线，可测知待测样品的浓度。d d=A AloglogC C+B B C：抗生素浓度，d：抑菌圈直径，A、B为常数。优点：优点：1)简便、易行2)菌株合适，灵敏度灵敏度可达1.0ug/ml3)体内(血、尿）用量小用量小（3-5ug)，不必分离分离提取，测定的指标直接反映药效。直接反映药效。例例：微微生生物物法法测测定定家家兔兔体体内内鹿鹿蹄蹄草草素素药药动学参数动学参数 鹿鹿蹄蹄草草抑菌的有效成分为鹿蹄草素（甲基氢醌），选用鹿蹄草素最最敏敏感感的金黄色葡萄球菌作指示菌。方法方法 1 1、标准曲线的制备、标准曲线的制备 0.3%金黄色葡萄球菌混悬液10m1加入琼脂平皿中打孔。将30，40，50，70，100，144g/m1标准血清液201加入各孔中372培养810h 准确测定抑菌圈直径d 以d对标准血清浓度对数lgC回归得回归方程：得回归方程：lglgC C0.3666+0.14620.3666+0.1462d d ，r r0.9967 0.9967 2.血清中药物浓度的测定血清中药物浓度的测定各时间点采血将血样10个和标准血药样（CS）加入同一平板的孔中培养（同标线的制备）量取样品和标准品的抑菌圈直径 d用标准曲线法求算被测样品的血药浓度C CT T C CT T=C CS SC Ct t/C CSSSS CS:标准血药样（浓度已知）减少误差,起校正作用 CSS:标准品的血药浓度实验值 Ct:样品血药浓度实验值