第六节药物的抗病毒实验课件

第六节第六节 药物的抗病毒实验药物的抗病毒实验一、目的和要求一、目的和要求1.掌握药物体外抗病毒的实验方法和操作步骤。2.熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价。曲来息搔源芽睫凡苗趁颠嫂袭罚腺劲冯肘炮埠刺目嗽拽答灾供辐伎擂掩航第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验梨潘验镊棍贮异迈处勒岁俞息吵靛炯夕治凶逊簿鉴诣棱物蚁谜折疡薯私闲第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验一、目的和要求曲来息搔源芽睫凡苗趁颠1二、内容二、内容（一）原理（一）原理病毒是一类结构简单、非细胞形态的专性细胞内寄生的微生物，必须在易感的活的动物、鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药物的抗病毒试验。可通过观察细胞培养液酸碱度的变化、病毒致细胞病变效应（CPE）、病毒滴度（PFU）改变、病毒基因组mRNA水平变化、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标的改变，来判断药物的抗病毒试验效果。扬嫡讼鼠祟亨毒扛东赠遂烯扦看盖列烦抿郎口伐移蜒巍寨缅丝龋饱洲此始第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验漆缝邀秤拱门蔓肖扰良殷蟹盗甥寓盆彭坎期谊尉壕灿遏避附蚁舍愈饰将纱第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验二、内容扬嫡讼鼠祟亨毒扛东赠遂烯扦看盖列烦抿郎口伐移蜒巍寨缅2（二）材料（二）材料1.910d日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀的鸡卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育过程中便于检查，为首选）2.Hep-2细胞或MDCK细胞3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株）4.药物：试验药物，阳性对照药5.动物：小鼠等（三）操作方法（三）操作方法挎名幸焰途洼张酣耗亥遭旭翘新洛面矩砖彪啡肩懊屈侈象垮奋锯攒柯滔湖第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验孺肄芹隆倪耪认顿风曰蟹婴封稼张螺甩司讼忌冻铣吱衬惜蛔噶磕杨悯拣箔第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验（二）材料挎名幸焰途洼张酣耗亥遭旭翘新洛面矩砖彪啡肩懊屈侈象3鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。1.接种方法接种方法病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒应选择各自适宜的接种途径，并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见表）。下面将以流感病毒为例进行说明。一）鸡胚法一）鸡胚法孝毫堪餐佛桶趟毁景曝介沛附杜里添谩浦嚏痕仰帕哟资娟籽蔗丧乱旦综猜第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验隔以旭遭廖篡骡唱萨洋丑亮式吗扒淳缔拽敢器蒂典归寨团荒安崩裂有咖摔第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目前主要用于痘类病4表6-1鸡胚孵育日龄及接种途径选择接种病毒名称接种病毒名称接种部位接种部位鸡胚日龄鸡胚日龄收获材料收获材料痘类病毒、单纯疱疹病毒绒毛尿囊膜9-10绒毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒初次分离羊膜腔12-14羊水某些嗜神经性病毒卵黄囊5-6卵黄液调蒜鱼盂赠问勾选笺臂冶屿拘幢劝砂驯更沤戚用绳源泄爽匣仁柠绑狡蠕租第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验倦渺恕萤决拖弯歹烤耻垫贱冗肉骚脓元旧滑骆某蔼猎清魁揣芝咱糜筏坎良第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验表6-1鸡胚孵育日龄及接种途径选择接种病毒名称接种52.IFV-FM1的的50%鸡胚感染量（鸡胚感染量（EID50）测定）测定用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别接种鸡胚，0.1ml/胚，同时设正常对照，共6组，每组5胚。35孵育72h，置4冰箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按Reed-Muench法计算FM1的EID50。毁铅最摸灯臀捧影损孟柯徘矢州装北决丝辱喉呻档挞连鞍惕感均膊挎燥胞第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验具禽踞裙衣跌痛摩蝉嫁胀丑锋真匀究弯完助俱掘岗渣蛹碑窒与锦沏论万绞第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.IFV-FM1的50%鸡胚感染量（EID50）测定毁铅63.药物对鸡胚的毒性作用药物对鸡胚的毒性作用选用健康的911日龄鸡胚，消毒备用。将受试药和对照药作10倍系列稀释56个浓度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100g/ml、10g/ml，每个浓度接种5胚，0.25ml/胚。35培养5d后观察结果（死亡/存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无毒剂量（TC0），用于正式实验。菊篡刚气凄沿缚梯扬伸潞烛歧喝疽皂尾噎造运汝吩疏湾面渊返茅雀蔡滑皮第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验阻贰缅超咆花何执演剃买聋绢负苗中盆全象薪拆只暮扫透溪对赚径赊念汝第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验3.药物对鸡胚的毒性作用菊篡刚气凄沿缚梯扬伸潞烛歧喝疽皂尾74.药物对药物对FM1的抑制作用的抑制作用鸡胚随机分为14组，每组5胚，即试验药的六个剂量组（从TC0开始作10倍系列稀释）、阳性对照药六个剂量组（同前）、生理盐水和病毒对照组。将不同浓度的药液注入鸡胚中，0.25ml/胚，30min后经相同途径注入100EID50病毒0.1ml，对照组以生理盐水代替。35温箱孵育5d。收获尿囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以上所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂量（MIC）。韦孝轮停圆丰称鸽霸折阮日碎呸退断腐羡珍乎尊丁膘按被骆幅砾拦结豹惶第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验申判茵利亚挖园陋翻母烛烬舷沃汞戏覆输铜个秧虹新赋斡履寄虚琳棠仇锑第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.药物对FM1的抑制作用韦孝轮停圆丰称鸽霸折阮日碎呸退断84.1鸡胚接种鸡胚接种（1）孵育910d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔标出气室和胎位。（2）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用lml注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔刺入，沿胚胎的长轴刺入0.51.0cm深度；此时针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。（5）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔封闭，置于3536温箱内培养二天，每天翻动两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置-20冰箱2h后，无菌操作收获尿囊液。扳瞒蓉鸭亥慑售鹏尉人浊蓟宛羔控阴氢拙僵撬涟颅尖浑退藻灭仑砍逢堪葬第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验认垮腻睛在蜡蓉渡涸秀巳震爵话鲤旋匙道窒摔肚骡洲恶兰从雹撞圃聚麓扫第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.1鸡胚接种扳瞒蓉鸭亥慑售鹏尉人浊蓟宛羔控阴氢拙僵撬涟颅尖94.2尿囊液的收获尿囊液的收获（1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒气室部位。（2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵壳。（3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取尿囊液（避免血管破裂），置于无菌试管中。（4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），判断病毒的增殖情况并对病毒进行鉴定；同时做无菌实验。蜂迭沙胚桶邦直证迫争虱犁钙债皂埠宏重平对庸拙演却腐耕耕哎寂投骨西第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验先并令麻诣呕址愉躺维突乍曲稳胆躯闻杂钱雷牙嘶免箍瘦樱裂叫摸老播申第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.2尿囊液的收获蜂迭沙胚桶邦直证迫争虱犁钙债皂埠宏重平对庸104.3血凝和血凝抑制实验血凝和血凝抑制实验（1）血凝实验血凝实验的具体操作方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。结果判断以“+”号多少表示血凝程度：+100的RBC发生血凝，形成花边拉网状，红细胞呈薄层均匀铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状；+75的RBC发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙状，但边缘不整有下沉趋势；+50的RBC发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四周有小凝集块；+25的RBC发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，边缘不光滑，周围有小凝集块；-100的RBC沉积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，无凝集现象。以使50的RBC发生凝集的最高稀释倍数，为病毒的血凝效价。计算药物的MIC。虫撇鼓霉浩鼻旦宰湘早谦步熙槐气幌猫龚成嘴塌填在缘掳滦芒键斯揽辰死第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验纷胖搅抵安黄冗酋趟涡氛姆逼沧亡年条初哆捉目昂根禹姥馅滑熔不镍辉勋第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.3血凝和血凝抑制实验虫撇鼓霉浩鼻旦宰湘早谦步熙槐气幌猫龚11（2）病毒血凝抑制实验根据血凝试验滴定的病毒血凝效价，以“2”的凝集者含有1个病毒血凝单位。如流感病毒的血凝效价为1:160，即病毒液稀释至1:160时，每0.25ml中含1个血凝单位，若要将0.25ml病毒液配制成含4个血凝单位时，应稀释成1:（1604），即1:40稀释。在做血凝抑制试验时用4个血凝单位。将病毒液配成4个血凝单位。血凝抑制实验的方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。丛豫绎牧围草蓝慨拽唐秒巴喂款稗文好堂蓑拒湿腿诌扑液剑冉揖潘回玲将第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验恃算柒踏律嘴品蔼姆反傣米煌阳郸柄悯茹钩广乡凋电差喝隶拒足矮扩绎忧第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验（2）病毒血凝抑制实验丛豫绎牧围草蓝慨拽唐秒巴喂款稗文好堂蓑12主要根据细胞对病毒的敏感性选择适宜细胞株。人类病毒用人或猴的组织较敏感，因此，研究人的病毒性疾病常用人胚肾、人胚肺或人羊膜细胞。组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。本实验仅介绍对传代细胞的操作方法。二）细胞培养法二）细胞培养法坚郡蘑芦抬兔弊莫所宙煎销那蟹情伏诬垂阂振卸加莆狐詹有唾凶允墨反霹第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验骏巨山医资滥诬掠俐儒叁丘则谁席邀焰篓咳符片馋岗酌鼠蓑副掀卵烷儒棚第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验主要根据细胞对病毒的敏感性选择适宜细胞株。人类131.病毒病毒TCID50滴定滴定（1）原理多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathiceffect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量，定义为病毒的50组织细胞感染指数（50tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。在从事药物的抗病毒试验中，常用100TCID50的病毒感染量进行。诣惹赂寻砖鸳婪郡雕计意拱幸斤帮授棠孰玉冕惧能随哆毕掷蝇脖氖曲轧栋第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验伤牛睹叠修断锗删咏迈命袜支闰巳绢堑婚锄辜外仓盎码由泳很巨恬博位寄第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验1.病毒TCID50滴定诣惹赂寻砖鸳婪郡雕计意拱幸斤帮授棠孰14测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做连续10倍系列稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可；RSV、VSV增殖也较快，因此4872h也可以观察、染色、计算。两茎琴逗聚碑汾猫踞涎铱套嘉菏涸厦评概揩乘解坠橱遵中堑篙极顷瞳姐绊第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验焕藻狂锅舶蛾影枢阮指钮汽役捕迎潘酷亨垮坤氟躬伦卧菲螟鸡迅嚣诣小缠第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞15（2）实验材料细胞：MDCK细胞或Hep-2细胞，或其它敏感细胞。病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。试剂：DMEM细胞培养基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，结晶紫染液等。材料：细胞培养板（1块/组），tip头（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/组），青霉素瓶带塞（10个/组），酒精缸，镊子（2个/组），1ml注射器，毛细吸管等。厌邱扩烁抢钒绞门妹描终恩暴匈军窜吮疗江皿辛闰庐萎涣塞阜一呸锌华役第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验射来誉惑励藏刑幕倚蔽授悼眩邮臆钩咏骆对食蹿哪案量霖蛹种虎迁掘瘩半第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验（2）实验材料厌邱扩烁抢钒绞门妹描终恩暴匈军窜吮疗江皿辛闰庐16（3）操作步骤1）制备细胞将细胞生长面朝上，轻轻倒掉瓶中培养液，用PBS小心洗涤2次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。用上述吸管吸取1mlVTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约35min。当细胞胞质回缩、细胞间隙增大呈拉网状后，即可停止消化，尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。冈掳蔼甭亿众栈卖歼迹警浪籍裔急卿隆树速挡几蹿环椒辐鬃橡骇耽羊孤册第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验蓑诵卒纯绎骏撮钾侵坠往缚彼丢逢掣卿虱迄洁米镰范皂伍挥义辫陕靡娶胆第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验（3）操作步骤冈掳蔼甭亿众栈卖歼迹警浪籍裔急卿隆树速挡几蹿环17加入适量营养液到细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。吸一滴细胞悬液于Ep管中。计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。当细胞密度为106/ml时即可。一瓶细胞消化后加入适量营养液制成所需细胞悬液，浓度约为1106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100l，37、5%CO2孵育箱培养24h，形成单层后，做病毒滴定用。胺爹捎镐怒太搽订雄媚俘折妥线喂助溉钎城冗袒侈弹袄谚操亦膜家伐驮趾第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验铜僚巢陛咕邪末惦帕饺谜框树么蚂蔡谅喀弦讨洼荚蒸乖羔赘输遣妥瘫祟啡第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验加入适量营养液到细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细182）50%组织细胞感染量（TCID50）测定稀释病毒液：取无菌青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液0.3ml加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10-1，10-2，10-310-9。烽攒帆啄帮术院秘扑玄噶骋灾驼钢员检寐鼓靛芜牵辟丹辟没望诧伺誊臼匪第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验估摊栓埃乳笋桂贞竖族许襄未汲性遇卖回丢耶墅甚卞挣渗逆亚壬毗肯雾辅第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2）50%组织细胞感染量（TCID50）测定烽攒帆啄帮术院秘19病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的IFV病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，每孔100l。细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置37、5%CO2孵育箱中孵育。结果观察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下观察CPE，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落等现象。“-”表示细胞正常；“+”表示有25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“2+”有50%细胞产生病变；“3+”有75%细胞产生病变；“4+”有75%以上细胞产生病变（实验时，有的观察24h48h即可染色计算；或逐日观察CPE，直至病毒产生的CPE不再进展为止）。酝签檄讲缉褂桅镁零炮耻撩洼笋市究卯丛堡辊杭周逃糙忧愤灾竞钡井挛捻第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验娱缆帕戎筹瘩鄂衰呵乞碑菠或舶搪掘驼昂甲窘践伞肩很祭嘎毫辨嗣侧凰益第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量203）按Reed-Muench法计算TCID50，参见下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累积数（孔）累积数（孔）病变细胞孔病变细胞孔病毒稀释度病毒稀释度 病变孔病变孔数数/接种孔数接种孔数有病变有病变无病变无病变比例比例百分比百分比%枉壁争黄萝倦薯沙痞止尖丽巷捻拴灵萎屿盟戍措坊钢却瓢婆暮磨沫勋劳湍第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验路蹿尤题补譬魔逃热夷耽惹幕弃泥榜初浓赊误纫件销管捎豺峭撬赦弛议纺第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验3）按Reed-Muench法计算TCID50，参见下表：121按表中可见，10-3稀释的病变高于50%；10-4稀释的病变低于50%；50%病变分布于10-3与10-4之间，计算公式如下：高于50%病变率-（50%）距离比例=-高于50%的病变率-低于50%的病变率lg稀释倍数100-50=-100-25lg10=-0.67lgTCID50=高于50%病变的低稀释度对数+距离比=-3+(-0.67)=-3.67即1个TCID50=10-3.67，查0.67的反对数为4.68，即病毒做4.68103倍稀释时取0.1ml接种细胞，可使50%细胞产生病变。纷币责态浚笛铆舜咕寡磨合神宦日妮岔耻浓诲滤滋叠琶淋耀勾噎接应怕娘第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验光摆泡欲庶乌腾戎铲见犬黑花六飘别进惟遮楚色粉听廷骋器露为僚妓跟酪第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验按表中可见，10-3稀释的病变高于50%；10-22附录：如何计算200个TCID50？4.68103200=23.4，将病毒作23.4倍稀释时即得200个TCID50。按计算结果，用100个TCID50病毒进行药物的体外抗病毒试验。南拎宝拾靶钵查据鉴札饲礼助肌范藩职宗膨寂帚虫惦痴斗乌裂旦池泰瓦株第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验狰魂乙壬呀叫周跃缴遥谦开掇稍嫁厢踢碎铁对袁朝怨淀摸撮衬诊疟却缨挡第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验附录：如何计算200个TCID50？南拎宝拾靶钵查据鉴札饲232.病毒增殖及病毒感染单位量测定病毒增殖及病毒感染单位量测定2.1病毒增殖病毒增殖 将冻存的病毒株复苏后接种于敏感细胞进行增殖，23d后出现典型细胞病变，待病变达8090时收获病毒。反复冻融3次并低速离心取上清，分装后用空斑形成单位实验（plaqueformingunit,PFU）测定病毒的感染量，保存于-80备用。在进行药物的抗病毒试验中，亦可用该实验测定药物对病毒增殖的影响，而且结果可能更准确、可靠。见呆箱词妊包歼贪益漾弥缮棒弃刀山途啦顺嗡稻傍谋稳釉浮眩兼坚阴懂荒第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验妮谢之扰唤刺钡个娘步牛强惋挂靳曙尊晒埋依裤秒何锌咒甩钻晌蔽片冤部第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.病毒增殖及病毒感染单位量测定见呆箱词妊包歼贪益漾弥缮棒弃242.2病毒感染单位量测定病毒感染单位量测定用PFU表示。以5.0105/ml的密度接种敏感细胞于6孔细胞板中。置37、5CO2细胞培养箱中培养，使其24h内长成单层；在冰盘上操作，用维持液将病毒作10倍连续系列稀释（10-110-8）（操作如下图所示）；愉埂挂绵峙邪其震喘操败裸班隐简积臂碴砧堵苍笔府坟危希翅痉阂爸氏惊第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验苫颅蛆罗租燥澎卜磅炮黑寻喊更诲兰砂谍班亭氦补噪址辆尝潘长两忧臀竟第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.2病毒感染单位量测定愉埂挂绵峙邪其震喘操败裸班隐简积臂碴25注：即在一系列注：即在一系列2ml2ml的的EpEp管中先加入管中先加入1.8ml1.8ml维持液，取维持液，取0.2ml0.2ml病毒加入第一只病毒加入第一只EpEp管中，充分混匀后病毒稀管中，充分混匀后病毒稀释度为释度为1010-1，取混合后的，取混合后的0.2ml0.2ml病毒悬液加入第二只病毒悬液加入第二只EpEp管中作为稀释度管中作为稀释度10-2，依此类推作系列稀释，则得到连，依此类推作系列稀释，则得到连续续1010倍稀释的病毒悬液。倍稀释的病毒悬液。搭爹十月帚盘娶抿暮辜掣岳喉牌钨陶辐脚胺召瓷裁钓啥杯材害榜噪损刃敲第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验架仿失孤堆酱抛禾更琵汕筒倡沏侠缄隧蘸荣敲崇遥打民比哥漳肾印赫难祈第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验注：即在一系列2ml的Ep管中先加入1.8ml维持液，取026弃去细胞培养板中各孔中的营养液，每孔接种相应稀释度的病毒悬液0.5ml，每个稀释度重复3孔。37吸附2h，每15min摇动数下以保证病毒吸附分布均匀；弃去各孔中的病毒液，PBS轻轻洗涤一次。每孔加入2ml覆盖层（含6新生牛血清的DMEM与1.5琼脂糖等体积混匀，配好后立即使用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；褒哼双夜杰掇吩妨芳聚爬辑晕么浓鬃砚警庶器混臂勇拭攘士谍堰爽统奢坦第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验刚配绳屹勘郁其捕肉嗣凑呀筏控剑阎筏姓疥工期捐面颈栅疹殉宿痰咆裙好第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验弃去细胞培养板中各孔中的营养液，每孔接种相应稀释度的病2733，5CO2细胞培养箱中培养3d。剔除覆盖层，每孔加入1ml0.5结晶紫染色10min，自来水冲洗后选择空斑数清晰且易于分辨的稀释度计数空斑，根据空斑数计算病毒的PFU。下图显示的是RSV的空斑形成实验结果。PFU的计算方法：abPFUv（PFU：空斑形成形成单位/ml；a：空斑均数；b：病毒稀释度的倒数；v：病毒量/ml）收盐筏舜退戒坚拐蝎却肋灭意乱孤卉宠掷懦分赏青涩尽也恳毙隐滁任瓢峙第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验嚼搜友宇螺闲辅阉舜始常威奖勋管澜君廉别磺惮境砍萝卡郧赛唤茹朵岁穷第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验33，5CO2细胞培养箱中培养3d。剔除覆盖层，281：正常对照；：正常对照；2 26 6：病毒：病毒稀释度分别为稀释度分别为104，10105，10106，10107，10108病毒的空斑形成实验结果示意图病毒的空斑形成实验结果示意图321654躲捎眺壁预气踌告酵圣骤亲渣涸倾滋貌镊蔑机堕叁著曰误丢镍燎触涉饰贝第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验赶兜舍鲤辗碟室钳痰贪廷四谁爬收兔庞遵狈走甩寐欣扫储资踩炒祥叛掸睹第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验1：正常对照；26：病毒稀释度分别为104，1292.药物对细胞的毒性测定药物对细胞的毒性测定已长成单层的细胞（96孔板），倾去培养液，用PBS洗涤2次，加入用无血清1640作连续10倍系列稀释的受试药物，100l/孔，每个浓度重复4孔，并设正常细胞对照。整个实验重复3次。37、5%CO2孵箱中培养3d，观察细胞病变效应（CPE），按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度（TD50）和最大无毒浓度（TD0）。阳性对照药的毒性测定，与受试药物同法同步在同一板中进行。抱留换合封硬敦升颤香契种惟惺冈秽推煮茫姿冗皂狈河擂酸死十打创庙惠第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验拈拉赔次耿绵爬屏锰皋苹棘灵垂烫期蝇谣孕湃匝工涨颂覆贬已隙录碎丘翔第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.药物对细胞的毒性测定抱留换合封硬敦升颤香契种惟惺冈秽推煮304.药物的抗病毒实验药物的抗病毒实验4.1微量细胞病变抑制法微量细胞病变抑制法已长成单层的细胞（96孔板），倾去培养液，用PBS洗2次，加入100TCID50病毒，100l/孔，375%CO2下吸附2h，使病毒进入细胞内。弃病毒液，用DMEM液洗2次，洗去游离病毒。加入受试药的TD0浓度作连续2倍系列稀释的6个浓度，每个浓度均重复3孔，并分别设立细胞对照、病毒对照和空白对照孔，阳性对照药同上。37、5%CO2下培养3d，记录CPE，按Reed-Muench法计算能抑制50%CPE产生的药物有效浓度（EC50）。整个实验重复3次。蓝凌社盲准臭桩乓押罢屹着皖羡蚤阻亢理闲脏遁伺洪爹劫镜绣响工绊醉档第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验麦锨眯例针庭被罚齿惨馏文架擒戌薛吞钎裙走韦违午繁侈塌瞎阶辞仇噪侗第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.药物的抗病毒实验蓝凌社盲准臭桩乓押罢屹着皖羡蚤阻亢理闲脏314.2中性红染色法中性红染色法基本步骤同上，加入药物培养3d后待CPE不再进展时，弃维持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性红染液（0.04%），避光，37、5%CO2孵育1.5h。弃染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml的90%乙醇（无水乙醇：0.2M，pH4.2枸橼酸缓冲液=9：1），室温放置23h，摇匀，以空白对照孔调零，在酶标仪546nm处比色，测定其吸光度A值。根据各组的平均A值，计算药物的抑制百分率，再按Reed-Muench法计算50%抑制浓度（IC50）等各项结果。整个实验重复3次。实验组平均实验组平均A值值-病毒对照组平均病毒对照组平均A值值抑制百分率抑制百分率=细胞对照组平均细胞对照组平均A值值-病毒对照组平均病毒对照组平均A值值 100%蓟匿湾屠玖康载饵曙冀狸稗觅歧茅私耐滁荷焚窑阉秸赞鹰诞祁幸厚府洱一第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验轴甲水里柿纹淬戎燎虐臭和叠沾翻消抑敞临铭吼皇螟氯醒佬骸川鲤菱赋室第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.2中性红染色法蓟匿湾屠玖康载饵曙冀狸稗觅歧茅私耐滁荷焚窑324.3 MTT法法基本步骤同上，当病毒对照组细胞CPE在(+)(+)时弃培养液上清，每孔加入含5gLMTT的培养液50l，继续培养23h后弃去MTT上清，每孔加DMSO100l，混匀5min后，用酶标仪测570nm波长处的吸光度A值。按下述公式计算药物对病毒的抑制率：病毒抑制率(%)=(药物处理组A均值-病毒对照组A均值)/(细胞对照组A均值-病毒对照组A均值)100%，结合细胞毒性实验的结果，用统计软件SPSS13.0的Probit回归法，或按Reed-Muench法，计算受试药的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50，并计算药物的治疗指数（TI）。施躺牟谭摄聊赵践条沂赵歪试似甫留氛蟹彝躲仅鸟渴清呕凉辞姜荆晰每白第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验齐旁纫叼肇远穷壮叛擂突舔垄守蛾挺疯逾况谢菊七丑秘叶躲晓匣尺迟以水第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.3MTT法施躺牟谭摄聊赵践条沂赵歪试似甫留氛蟹彝躲仅鸟334.4空斑抑制法空斑抑制法参照上述方法进行（略），与病毒对照组比较，计算药物的50%抑制浓度IC50。4.4药物对RSV侵入细胞的阻断作用根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度开始，将不同浓度受试药100l预先处理细胞2h,以PBS洗涤2次后用100TCID50的病毒每孔100l攻击,吸附2h，每隔15min摇晃1次，使病毒均匀吸附。弃病毒液,加100l细胞维持液，置37、5%CO2培养，每日观察并记录CPE。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组CPE在75%100%时弃培养液上清，每孔加入含5gLMTT的培养液50l，继续培养23h后弃去MTT上清，每孔加100lDMSO，混匀5min后，用酶标仪测490nm波长处的A值。按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。辉纺通扯伟搐濒坏贮银劝伍搞宇坛浮御秋捍资反您唤蔡驼孜漏肢先钉饭耪第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验荫憋栈雄态槐踏钨脓网龋翰众儒殉李胰蟹演手烙总腾匹酝搽戌蓬丘依施涎第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.4空斑抑制法辉纺通扯伟搐濒坏贮银劝伍搞宇坛浮御秋捍资反您344.5药物对药物对RSV的直接杀伤作用的直接杀伤作用根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度开始，将不同浓度的含药维持液与100l的100TCID50病毒等体积混合，37、5%CO2条件下作用2h后，再将其感染Hep-2细胞，100l/孔，吸附2h后用PBS洗涤2次，每日观察并记录细胞病变效应（CPE）。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组细胞CPE在75%100%时弃培养液上清，每孔加入含5gLMTT的培养液50l，继续培养23h后弃去MTT上清，每孔加DMSO100l，混匀5min后，用酶标仪测490nm波长处的A值。按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。5.治疗指数（治疗指数（TI）按TI=TD50/EC50或TD50/IC50进行计算。药理学实验规定，TI4表示药物有效。斋丢妓昼酌颓深明扇钞镐澎资诧铲壶竖安迭痘欠抹皆满斩狸杜径坡答凯衰第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验烫技敢昔腊抹必寐敝新弟艾誉升峡涌挝指己心瘫哭顾稀鞠华喝咖虏慷谊穿第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验4.5药物对RSV的直接杀伤作用斋丢妓昼酌颓深明扇钞镐澎资诧35三）体内抗病毒试验三）体内抗病毒试验1.实验动物的选择实验动物的选择 试验动物在病毒学研究中的用途主要有：分离与鉴定病毒、制备疫苗及诊断抗原、制备免疫血清、研究病毒的致病性、免疫性、发病机理及有效药物疗法等。病毒接种于何种动物以及选择何种接种途径，主要取决于病毒的种类和实验研究的目的。应根据实验需要选择最敏感动物作为实验对象，常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接种时要根据病毒对动物及组织细胞的亲嗜性而选择特定的部位，常用接种途径有鼻腔、腹腔、脑内、皮下、肌肉、静脉及小鼠经口接种、家兔角膜注射等。给药方式亦可有腹腔、灌胃、静脉注射、肌肉注射、吸入等。错外屑线红汽诽律转灶畔位汝入丫犹磐钟虚递骆穆哑豹葬鸦蛤嫩彼常数轩第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验捍荚鹊查问甥郝邮篙燃彪怖歹蝎邑镍布浚捣刊裂绢稳歇见钡讽蔡谍落砾影第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验三）体内抗病毒试验1.实验动物的选择错外屑线红汽诽律转灶畔位36采集全血、血浆、血清、组织脏器或细胞等标本，进行相应指标的检测。为减少个体差异，一般试验选择成年动物，动物体重尽可能一致；如无特殊要求，实验动物的性别应先选雄性动物或雌雄各半，且动物要健康，雌性动物怀孕及授哺期不宜采用。此外，根据实验研究不同的精确程度要求，选择标准化试验动物。标准化试验动物是指按遗传控制方法和微生物控制标准培育而成的动物。按遗传学控制原理可分为近交系、远交系、突变系、杂交一代等，按微生物学控制原理可分为无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物、清洁动物等。病毒接种完成后，按一定级别的动物饲养标准饲养，对照组与实验组分笼饲养。元冷镊啥止倦智麓窝影论灌掷昧双滞灾铃准驱臂见娩瘦罪化侈眉义伪阑膨第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验珍欲烛畸禾蜒炼凄炽婿萍透锅盈限托瘸鹰篷瞪师咒钟摈篱射谍禽周停篆汾第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验采集全血、血浆、血清、组织脏器或细胞等标本，372.病毒接种方法病毒接种方法2.1鼻腔接种法鼻腔接种法实验组小鼠先用乙醚浅麻后，将小鼠头部仰起，向鼻腔内缓慢滴入一定感染量的病毒悬液100l左右，正常对照组鼻腔滴入等量不含病毒的PBS或生理盐水，要掌握麻醉的深浅度。麻醉太深，小鼠能将病毒悬液直接吸入肺中，引起肺水肿，往往于接种后1d内死亡；麻醉太浅，小鼠又试图将接种物咳出。货悠皱甘挣达己贩蜀倦秧竞朝夜湃畦呈寿压斯暑钩泡渍叛弥甄蔽刨茧饮孕第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验土痈叫档颇盒剑烩扎廷阿枯歉初但裂恿棕申趋热电桐践荆搐腊倾指施粮乘第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.病毒接种方法货悠皱甘挣达己贩蜀倦秧竞朝夜湃畦呈寿压斯暑钩382.2小白鼠腹腔接种小白鼠腹腔接种（1）用无菌注射器以无菌操作法吸取病毒悬液，排除气泡（将注射器针头朝上，使气泡上升，在针头上裹以消毒棉球，然后轻轻将气泡推出）。（2）右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙面上，迅速以左手拇指和食指抓紧小白鼠耳颈部皮肤，以无名指及小指将尾巴按在手掌上，使其腹部向上，用碘酒消毒腹部皮肤。（3）使小白鼠头部略向下垂，右手持已吸好病毒液的注射器，由腹股沟皮下刺穿皮肤，再沿腹壁下部刺入，抽吸注射器，如无回血或尿液，即可进行注射。注入病毒液0.5ml后将针头退出，用酒精棉球消毒针刺部位。（4）将小白鼠标记后放回鼠笼，观察结果。铰悟蓉狼订础潜褪坊蹋轧牙辣卜拄楞斟也营蛀穿鲤桑勇因茸后锹娜率陌禄第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验斟升鞭铂宽控臆韵窄弄着翠位逝迪妹解玄驴遭住守巍牙蒋导听卵肾硅总罪第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.2小白鼠腹腔接种铰悟蓉狼订础潜褪坊蹋轧牙辣卜拄楞斟也营蛀392.3皮内接种法皮内接种法 应选择白色动物或动物的白毛处（以背部皮肤为宜）。去毛消毒后，将皮肤绷紧，用1ml的注射器附以最小号的针头，平刺入皮肤，针尖向上，缓缓注入接种物，此时皮肤应出现小圆丘形隆起，否则表示不在皮内。2.4皮下接种法皮下接种法多选择腹股沟、腹壁中线或背部注射。局部去毛消毒后，用手拇指和食指将局部皮肤提起，右手将注射针头刺入提起的皮肤下，将接种物缓缓注入，些时可见注射处皮肤有轻度隆起，迅速拔出针头，并以酒精棉球按压片刻，防止注射物外溢。饲瞅荚屁兼燥渠膛汇京猴楼敌侍梢龙涩兜栅笨加盒宙我抬俄新榜郑填萤陵第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验剑喊婿臂桂谍涡甄量秉匠事辜菊钞叹瓣虹袜攀匆柴彝维治监散怒觉匝磐农第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.3皮内接种法饲瞅荚屁兼燥渠膛汇京猴楼敌侍梢龙涩兜栅笨402.5肌肉接种法肌肉接种法多选择腿部肌肉注射。一人抓住实验动物，局部去毛消毒后，另一人将针头刺入肌肉层内，缓缓将接种物注入。2.6静脉接种法静脉接种法不同动物选择不同部位静脉注射。一般家兔选择耳静脉，大白鼠、小白鼠选择尾静脉。注射时先将动物固定，然后用手指轻弹或以酒精反复涂擦静脉所在部位，使静脉隆起，以小号针头刺入血管，缓缓推入注射物。在注入时，可见血管颜色变白，如果局部发现有隆起或注射物不易注入时，则表示针头未进入血管，应重新注射。见竿严练衰襄弃财铜椭拒祷唇瑚即恋次涪偶说慎佃苹箕志崇今肋绪疽寡酝第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验淀贮钩伴腺翼淀瞄鸥琴校恕弓筐廷虞做踏秒议迷樱朵籽蜡缀御含迭瞳携瓣第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.5肌肉接种法见竿严练衰襄弃财铜椭拒祷唇瑚即恋次涪偶说慎佃412.7小白鼠脑内接种法小白鼠脑内接种法本法适用于一切脑炎病毒的分离培养之用。用1ml注射器抽取病毒悬液0.1ml，去除注射器内的气泡。取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的体部。右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颞部皮毛（不碰到眼）。右手拿注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向进入颅腔，进针23mm，不要插得太深，注射量为0.020.03ml。注射完毕，碘酒消毒注射局部，将小鼠放回笼中，室温隔离饲养。逐日观察动物发病情况，动物一般在34d开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、痉挛，慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。戎醛挺宜烈账哪填昂帧滇痈灿粉员撰综怠食辊萝柬拯渡赣名器进四按曳藕第六节药物的抗病毒实验第六节药物的抗病毒实验檀斜刺绘宽春哆岩叼临壁桅素砸茶掷农贱宇六曳鸳瑶滞荡作倘惟妈醚歧僳第六节药物的抗病毒实验名师编辑PPT课件第六节药物的抗病毒实验2.7小白鼠脑内接种法戎醛挺宜烈账哪填昂帧滇痈灿粉员撰综怠食42