第二十章-高效液相色谱法--课件

分析化学教程 第二十章 高效液相色谱法 1ppt课件20.1 概述20.2 高效液相色谱法的分类与基本原理 20.2.1 高效液相色谱法的分类 20.2.2 基本原理20.3 各类高效液相色谱法 20.3.1 液固吸附色谱法 20.3.2 液液分配色谱法 20.3.3 化学键合相色谱法 20.3.4 其他色谱法2ppt课件20.4 固定相 20.4.1 液固色谱固定相 20.4.2 化学键合相 20.4.3 其他固定相20.5 流动相（溶剂系统）20.5.1 分离方程式 20.5.2 Snyder溶剂分类 20.5.3 正相洗脱与反相洗脱 20.5.4 洗脱方式3ppt课件 20.5.5 流动相最优化方法简介20.6 高效液相色谱仪 20.6.1 输液泵 20.6.2 色谱柱与进样器 20.6.3 检测器 20.6.4 超高效液相色谱仪20.7 定性、定量分析方法 20.7.1 定性分析方法 20.7.2 定量分析方法4ppt课件高效液相色谱法概述5ppt课件 高效液相色谱法 HPLC （high performance liquid chromatograph）高压输液泵 高效固定相 高灵敏度检测器6ppt课件高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 见表7ppt课件8ppt课件9ppt课件高效液相色谱法与GC的比较 见表10ppt课件11ppt课件12ppt课件 高效液相色谱法的 分类与基本原理13ppt课件20.2.1 高效液相色谱法的分类按固定相的聚集状态：LLC和LSC按分离机制：分配、吸附、离子交换（IEC）、空间排阻（SEC）、亲合（AC）、手性（CC）、胶束（MC）、电色谱法（EC）。14ppt课件HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狭）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（亲和）MC（胶束）CC（手性）15ppt课件20.2.2 高效液相色谱法的基本原理HPLC的范氏方程：16ppt课件讨论：涡流扩散项：填料和填充均匀程度高效液相色谱柱的装填17ppt课件纵向扩散项18ppt课件传质阻力项19ppt课件温度一般为室温 选甲醇、乙腈粘度小的溶剂粒径20ppt课件流速分析型HPLC一般流量为1mL/min。21ppt课件各类高效液相色谱法22ppt课件20.3.1 液固吸附色谱法固定相 硅胶、氧化铝、高分子多孔微球、分子筛、聚酰胺等。分离机理 溶质分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面吸附活性中心，靠溶质分子的分配系数（容量因子）不同而分离。23ppt课件影响容量因子的因素 溶质分子的极性 溶剂的极性 硅胶的活性若以硅胶为固定相：洗脱剂：以烷烃为底剂，加适量极性调整剂组成的二元或三元流动相。流动相应该不含水。24ppt课件25ppt课件20.3.2 液液分配色谱法分离机理 靠样品组分溶入固定相与流动相达到“平衡”后分配系数的差别而分离。l正、反相液液色谱法 注意流出顺序。目前，物理涂渍的液液色谱几乎已被化学键合相所取代。26ppt课件20.3.3 化学键合相色谱法 将固定液的官能团键合在载体表面，就构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（bonded phase chromatograph，BPC）27ppt课件化学键合相的优点 均一、化学性能稳定，在pH28的溶液中不变质；热稳定性好，一般在70C以下稳定；不易流失，使用周期长；载样量大，比硅胶约高一个数量级；柱效高；重现性好；适于梯度洗脱。28ppt课件反相键合相色谱法（RBPC或RHPLC）固定相：在载体表面键合含弱极性或中等极性的基团，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（CH3）、苯基等。29ppt课件流动相：以水做主体，加适量的极性调节剂增加选择性如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。分离机理：疏溶剂理论30ppt课件31ppt课件出峰顺序：极性强的组分先出柱，极性弱的组分后出柱。分析对象：分离非极性至中等极性的各种分子型化合分子型化合物。物。32ppt课件影响保留时间的因素：溶质的分子结构：溶质的极性越弱，其疏水性越强，保留时间越长。在同系物中，碳数越多，则极性越弱，分子中非极性部分的总表面积越大，k越大。引入极性取代基，降低溶质分子的疏水性，k值变小。如：2，4-二硝基苯酚比苯酚先出柱。33ppt课件流动相的表面张力、介电常数和pH值：对于二元或多元体系改变溶剂的配比可改变流动相的表面张力和介电常数。通常，流动相中有机溶剂含量增加，k变小。或20406080206040800.51.01.5甲醇的体积百分数图：甲醇-水的表面张力、介电常数和黏度与组成的关系曲线34ppt课件正相键合相色谱法 固定相：在载体表面键合含中等极性或较强极性的基团，如氰基（CN）、氨基（NH3）、或二羟基等。流动相：以非极性或弱极性的溶剂如己烷、庚烷等为主体，加适量的极性调节剂增加选择性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。35ppt课件分离机理：定向力、诱导力或氢键作用力。出峰顺序：极性弱的组分先出柱，极性强的组分后出柱。适应范围：分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。36ppt课件影响保留时间的因素：键合相的种类、流动相的强度、试样的性质。流动相的极性增强，洗脱能力增加，保留时间缩短。37ppt课件反相离子对色谱法（RPIC）38ppt课件写成通式：39ppt课件表：反相离子对色谱的离子对试剂序号反离子种类主要应用对象1季铵盐（如四丁基铵磷酸盐TBA、溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）强酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氢化可的松及其盐2叔铵（如三辛铵）磺酸盐、羧酸等3烷基磺酸盐（如甲基、戊基、己基、庚基、樟脑磺酸盐）强碱、弱碱、儿茶酚胺、鸦片碱等4高氯酸胺5烷基磺酸盐（如十二烷基磺酸盐、正庚烷基磺酸钠（PICB7)与3类似，选择性不同40ppt课件离子对色谱法的适用对象：用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。41ppt课件离子抑制色谱法 （ion suppression chromatograph，ISC）在反相色谱法中，通过向流动相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及乙酸盐）来调节流动相的pH，抑制样品组分的离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。42ppt课件调节pH范围：27.5 pH8.0 使载体硅胶溶解 pH8）不稳定；在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效；硅胶表面上的剩余硅羟基对分离有影响。56ppt课件 近年，对硅胶载体进行了许多改进，如在硅胶基质内键合桥式乙烷，制成硅-碳杂化硅胶，它的机械强度提高了，能耐更高pH，柱效更高。57ppt课件主要掌握正相和反相键合相：键合的基团的极性及适用情况。58ppt课件表：反相HPLC常用的化学键合相类型牌号名称官能团粒度/m形状说明长链YWG-C18H37C18硅烷10非球形Partisil ODSC18硅烷5，10非球形5CZprbax ODSC18硅烷6球形15C短链LiChrosorb RP-8C8硅烷5，10非球形1314CYWG C6H6苯基硅烷10非球形7CLiChrosorb RP-2二甲基硅烷5，10非球形5C59ppt课件键合相的性质和特点 含碳量：指键合在硅胶表面上的烷基所含碳的质量分数，随链长增长，从322。覆盖度：指硅胶被键合后，在硅胶中的有效羟基与硅烷试剂反应的程度，在键合后有时还用短链的硅烷试剂（如三甲基氯硅烷）与剩余和新产生的羟基反应，使羟基全部被“帽盖”（即封尾）而不起作用。60ppt课件流动相（溶剂系统）61ppt课件HPLC对流动相的要求：不与固定相反应；对试样有适宜的溶解度，k在110之内，最好在25之间；与检测器相适应；纯度高，粘度小。使用前滤过，脱气。62ppt课件20.5.1 分离方程式 讨论：n主要由固定相及色谱柱填充质量决定；主要受溶剂种类的影响；在溶剂组成确定后，k主要由溶剂的配比所左右。63ppt课件20.5.2 Snyder溶剂分类 Snyder选择了3个参考物质，用于检验溶剂的3种分子间作用力，分别用Xe、Xd、Xn表述。表：参考物与被检溶剂间的作用力参考物乙醇（质子给予体）二氧六环（质子受体）硝基甲烷（强偶极）被检溶剂的作用力类型质子受体作用力(Xe)质子给予体作用力(Xd)强偶极作用力(Xn)64ppt课件 描述溶剂极性用Snyder提出的溶剂极性参数P来衡量。表：常用溶剂的极性参数和选择性参数溶剂PXeXdXn正戊烷0.0-乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.3165ppt课件 可将81种色谱溶剂，按选择性系数Xe、Xd、Xn在三角形坐标图上的相邻关系分为8类。选择不同组别的溶剂，分子作用力不同，容易使改变，利于分离。66ppt课件20.5.3 正相洗脱与反相洗脱 溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力,它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中,“溶剂洗脱强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大,洗脱能力越小。67ppt课件 反相键合相色谱法的溶剂强度用另一强度因子S表示。表：反相色谱常用溶剂的强度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇异丙醇四氢呋喃03.03.23.43.53.64.24.568ppt课件混合溶剂的强度参见书上P534的例题69ppt课件20.5.4 洗脱方式等度洗脱：在一个分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少、性质差别不大的试样。70ppt课件梯度洗脱（程序洗脱）在一个分析周期内程序程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，可使一个复杂样品中性质差异很大的组分，能在各自适宜的分离条件（容量因子k适宜）下分离。梯度洗脱能缩短分析时间、提高分离度、改善峰形、提高检测灵敏度。71ppt课件溶剂系统选择原则 1）首选溶剂 根据溶剂选择性分组，选具有显著选择性差异的溶剂。反相：水为底剂，甲醇、乙腈和四氢呋喃为选择性溶剂。正相：已烷或戊烷为底剂，乙醚、氯仿和二氯甲烷为选择性溶剂。2）多元溶剂系统的组成 多元溶剂必须由不同组别的纯溶剂与底剂组成。3）洗脱能力 正相用P，反相用S衡量。72ppt课件4）溶剂系统对样品的洗脱能力用重点组分的k衡量，以25合适5）替代溶剂系统 以具有相同P或S的不同溶剂系统替代原系统，观察分离情况是否改善。6）在反相色谱中有时需要加1%的弱酸或弱碱，抑制离解。73ppt课件20.5.5 流动相最优化方法简介 混合液设计统计技术 首先：根据溶剂选择性分组，选具有显著选择性差异的溶剂。反相：水为底剂，甲醇、乙腈和四氢呋喃为选择性溶剂。正相：已烷或戊烷为底剂，乙醚、氯仿和二氯甲烷为选择性溶剂。第二：以一种选择性溶剂和底剂系统实验，获得合适的k，得到溶剂。74ppt课件第三：计算另两种选择性溶剂和底剂要获得合适k值的配比，得到溶剂和。第四：以溶剂、和为溶剂选择三角形得三个顶点A、B、C。在三边上任何一点，可组成三元混合溶剂流动相。在三角形内任一点，可组成四元溶剂流动相。第五：选择7个或10个流动相进行实验，分析结果，以优化流动相。75ppt课件高效液相色谱仪76ppt课件总 图77ppt课件78ppt课件高压泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性恒流泵：柱塞往复泵采用并联或串联的双泵79ppt课件梯度淋洗装置 高压梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。80ppt课件81ppt课件进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：82ppt课件高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径24.6 mm，柱长1025 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。有分析型柱和制备型柱。83ppt课件液相色谱检测器 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围宽；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱；波长可选，易于操作；。（参照书P539：截止波长 水：190；甲醇：210；乙腈：210）84ppt课件紫外吸收检测器的类型：固定波长型（基本淘汰）可变波长型 光电二极管阵列检测器（DAD）85ppt课件86ppt课件87ppt课件荧光检测器（FD）灵敏度比紫外检测器高，选择性好，但只能适合于能产生荧光的物质（或通过衍生化能产生荧光的物质）的检测。88ppt课件电化学检测器：包括极谱、库仑、安培和电导检测器。电导检测器主要用于离子检测。安培检测器应用最广，可检测具有氧化还原活性（能发生电极反应）的物质，灵敏度高。89ppt课件中心挖空的聚四氟乙烯垫片90ppt课件蒸发光散射检测器（ELSD）：是通用型的检测器。它适合于检测挥发性低于流动相的组分，主要用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等的检测。91ppt课件高纯N2形成气溶胶高纯N2 灵敏度较低。此外，流动相必须是挥发性的，不能含缓冲盐。92ppt课件示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；93ppt课件定性、定量分析方法94ppt课件定性分析方法 色谱鉴定法：保留值和相对保留值 非色谱鉴定法化学鉴定法 两谱联用鉴定法95ppt课件定量分析方法 与GC类似，但少用归一化，常用外标法（外标标准曲线法）和内标法（内标对比法）。96ppt课件 HPLC分离方法的选择分离方法的选择相对分子量1000溶于有机溶剂（较弱或中等极性）溶于水（较强极性）液-固吸附色谱反相色谱正相色谱硅胶C18 C8-CN NH2有机溶剂甲醇，乙腈，四氢呋喃有机溶剂非离子型可离子化离子型反相色谱反相离子对色谱离子交换色谱C18 C8C18 C8-SO3H，-NR3Cl水（缓冲液），甲醇，乙腈水（离子对），甲醇，乙腈缓冲液溶于水溶于有机溶剂凝胶过滤色谱凝胶渗透色谱多孔微珠有机凝胶水溶液有机溶剂试样97ppt课件