第三章第三节-园艺植物的离体快繁教材课件

第三节第三节 园艺植物的离体快速繁殖园艺植物的离体快速繁殖 离体快繁是指通过无菌操作，将外植体接种于培养基离体快繁是指通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境条件下进行培养，使其在较上，在人工控制的营养和环境条件下进行培养，使其在较短的时间内快速地再生出大量完整植株的方法。是工厂化短的时间内快速地再生出大量完整植株的方法。是工厂化育苗的技术基础。育苗的技术基础。一、离体快速繁殖的意义：一、离体快速繁殖的意义：1.可用于繁殖稀缺或急需的良种作物，可用于繁殖稀缺或急需的良种作物，如新选育或新引进的如新选育或新引进的优良品种由于数量少而急需大量种苗时，可以采用组织培养优良品种由于数量少而急需大量种苗时，可以采用组织培养的方法繁殖。如香蕉、苹果、马铃薯等。的方法繁殖。如香蕉、苹果、马铃薯等。2.离体快速繁殖可用于无病毒苗木的快速繁殖，离体快速繁殖可用于无病毒苗木的快速繁殖，利用茎尖分利用茎尖分生组织培养并检测无病毒后进行离体快繁，可以获得大量的生组织培养并检测无病毒后进行离体快繁，可以获得大量的无病毒苗木。草莓、柑橘、球根花卉等。无病毒苗木。草莓、柑橘、球根花卉等。3.离体快速繁殖可以用于自然界无法用种子繁殖或难以保持离体快速繁殖可以用于自然界无法用种子繁殖或难以保持后代的三倍体、单倍体及基因工程植株的快速繁殖，后代的三倍体、单倍体及基因工程植株的快速繁殖，如无子如无子西瓜、石刁柏雄株。西瓜、石刁柏雄株。4.离体快速繁殖技术可以用于拯救濒危植物，离体快速繁殖技术可以用于拯救濒危植物，可以避免灭绝。可以避免灭绝。5.离体快繁可以用于种质保存与交换。离体快繁可以用于种质保存与交换。二、离体快繁的方法：二、离体快繁的方法：（一）无菌培养体系的建立：（一）无菌培养体系的建立：1.母株和外植体的选取母株和外植体的选取2.尽管所有组织和器官均可作为外植体，但具体采用何种尽管所有组织和器官均可作为外植体，但具体采用何种组织或器官快繁因植物种类而有所不同，通常木本植物、较大组织或器官快繁因植物种类而有所不同，通常木本植物、较大的草本植物采用茎尖、茎段或腋芽作为快繁的外植体，草本植的草本植物采用茎尖、茎段或腋芽作为快繁的外植体，草本植物或茎短缩的类型，可以采用叶片、叶柄、花瓣、花梗等外植物或茎短缩的类型，可以采用叶片、叶柄、花瓣、花梗等外植体。体。3.2.无菌培养物的获得无菌培养物的获得4.选取幼嫩、生活力强的外植体，保持新鲜，迅速带回实验选取幼嫩、生活力强的外植体，保持新鲜，迅速带回实验室，流水冲洗后在超净工作台上表面灭菌，然后接种于诱导培室，流水冲洗后在超净工作台上表面灭菌，然后接种于诱导培养基上。养基上。3.外植体的启动培养外植体的启动培养 细胞分裂素和生长素浓度最为重要，细胞分裂素通常细胞分裂素和生长素浓度最为重要，细胞分裂素通常0.5-1.0mg/L，生长素，生长素0.01-0.1mg/L;诱导不定芽分化是采诱导不定芽分化是采用高浓度细胞分裂素，诱导愈伤组织时需提高生长素浓用高浓度细胞分裂素，诱导愈伤组织时需提高生长素浓度并添加一定浓度的细胞分裂素。度并添加一定浓度的细胞分裂素。（二）茎芽增殖的途径：（二）茎芽增殖的途径：1.茎芽增殖的途径茎芽增殖的途径（1）侧芽增殖途径：指利用茎尖及侧芽培养直接获得芽苗）侧芽增殖途径：指利用茎尖及侧芽培养直接获得芽苗或丛生芽的方法。通过添加细胞分裂素促进侧芽萌发而形或丛生芽的方法。通过添加细胞分裂素促进侧芽萌发而形成丛生芽。成丛生芽。（2）不定芽途径：除了利用顶芽和侧芽等固定芽之外，由）不定芽途径：除了利用顶芽和侧芽等固定芽之外，由根、茎、叶等外植体直接或经脱分化形成愈伤组织后再分根、茎、叶等外植体直接或经脱分化形成愈伤组织后再分化不定芽的过程进行增殖。化不定芽的过程进行增殖。（3）体细胞胚途径：由外植体直接或间接（先形成愈伤）体细胞胚途径：由外植体直接或间接（先形成愈伤组织）形成胚状体的途径进行快速繁殖。如百合鳞片可组织）形成胚状体的途径进行快速繁殖。如百合鳞片可直接形成胚状体；胡萝卜、芹菜先形成愈伤组织，然后直接形成胚状体；胡萝卜、芹菜先形成愈伤组织，然后形成胚状体。形成胚状体。（4）原球茎途径：兰科花卉的种子萌发形成原球茎，由）原球茎途径：兰科花卉的种子萌发形成原球茎，由茎尖、叶片等外植体可诱导形成类原球茎，并可快速增茎尖、叶片等外植体可诱导形成类原球茎，并可快速增殖。殖。大花蕙兰原球茎增殖与植株再生大花蕙兰原球茎增殖与植株再生2.影响茎芽增殖的因素：影响茎芽增殖的因素：（1）植物种类：）植物种类：草本植物速度快，木本植物增殖慢。草本植物速度快，木本植物增殖慢。（2）外植体的生理状态：）外植体的生理状态：生长旺盛组织增殖快。生长旺盛组织增殖快。（3）表面灭菌时的受伤害程度）表面灭菌时的受伤害程度:表面灭菌剂对外植体伤害轻，表面灭菌剂对外植体伤害轻，启动快，伤害重，启动慢。启动快，伤害重，启动慢。（4）培养基组成及激素配比）培养基组成及激素配比:选择适宜的基本培养基，草本选择适宜的基本培养基，草本植物选用植物选用MS等，木本植物选用等，木本植物选用WPM等培养基。激素和生长等培养基。激素和生长调节剂浓度比例需注意在不同培养阶段进行合理使用。调节剂浓度比例需注意在不同培养阶段进行合理使用。三、离体快繁中常见的问题：三、离体快繁中常见的问题：（一）污染（一）污染1.污染发生的原因：污染发生的原因：2.（1）培养基和接种用具灭菌不彻底；（）培养基和接种用具灭菌不彻底；（2）外植体灭菌）外植体灭菌不彻底；（不彻底；（3）操作时人为带入；（）操作时人为带入；（4）接种室环境不洁）接种室环境不洁净；（净；（5）超净工作区域不洁净。）超净工作区域不洁净。3.2.控制污染的措施：控制污染的措施：4.（1）灭菌时充分排净锅内冷空气；（）灭菌时充分排净锅内冷空气；（2）接种器具充分）接种器具充分灼烧；（灼烧；（3）污染外植体及时挑出，灭菌后倒掉。外植体）污染外植体及时挑出，灭菌后倒掉。外植体材料少可二次处理；（材料少可二次处理；（4）接种时用）接种时用75%乙醇擦拭双手和乙醇擦拭双手和培养容器，操作区不放置过多的培养容器；培养容器，操作区不放置过多的培养容器；5.(5)接种室定期熏蒸或消毒液处理；并采用紫外灯进行空接种室定期熏蒸或消毒液处理；并采用紫外灯进行空气杀菌；（气杀菌；（6）超净工作台定期清洗过滤网。）超净工作台定期清洗过滤网。（二）遗传稳定性（二）遗传稳定性1.影响遗传稳定性的因素：影响遗传稳定性的因素：2.（1）基因型；（）基因型；（2）继代次数；如香蕉继代不超过）继代次数；如香蕉继代不超过1年。年。3.（3）器官发生方式；茎尖茎段培养较稳定。）器官发生方式；茎尖茎段培养较稳定。4.2.降低遗传变异的措施：降低遗传变异的措施：5.（1）选用不易变异的基因型；）选用不易变异的基因型；6.（2）缩短继代时间、限制继代次数，继代一定时间后，）缩短继代时间、限制继代次数，继代一定时间后，重新建立无性系；重新建立无性系；7.（3）采用不易变异的途径增殖；）采用不易变异的途径增殖；8.（4）采用适当的激素和生长调节剂。）采用适当的激素和生长调节剂。（三）玻璃化（三）玻璃化1.玻璃化苗发生的原因：玻璃化苗发生的原因：2.（1）琼脂和蔗糖浓度与玻璃化呈负相关；）琼脂和蔗糖浓度与玻璃化呈负相关；3.（2）培养温度过高；（）培养温度过高；（3）生长调节剂浓度过高，如细）生长调节剂浓度过高，如细胞分裂素过高；（胞分裂素过高；（4）培养瓶乙烯浓度过高；（）培养瓶乙烯浓度过高；（5）光照）光照过强或与高温同时作用；（过强或与高温同时作用；（6）培养基含氮量高，尤其）培养基含氮量高，尤其是銨态氮。是銨态氮。2.防治玻璃化的措施：防治玻璃化的措施：（1）提高培养基硬度；（）提高培养基硬度；（2）提高培养基蔗糖含量或加入）提高培养基蔗糖含量或加入渗透剂；（渗透剂；（3）选用透气瓶盖改善通气状况；（）选用透气瓶盖改善通气状况；（4）降低）降低生长调节剂和含氮化合物的浓度；（生长调节剂和含氮化合物的浓度；（5）适当降低温度；）适当降低温度；（6）一些添加物或抗生素可降低玻璃化，如马铃薯汁、）一些添加物或抗生素可降低玻璃化，如马铃薯汁、活性炭、活性炭、PP333，CCC等。等。（四）褐化现象：（四）褐化现象：1.影响褐化发生的因素：影响褐化发生的因素：2.（1）植物种类和基因型，如木本植物褐化严重；）植物种类和基因型，如木本植物褐化严重；（2）外植体年龄、大小和取材时间；（）外植体年龄、大小和取材时间；（3）外植体损伤；）外植体损伤；（4）光照过强；（）光照过强；（5）温度过高；（）温度过高；（6）培养时间过长；）培养时间过长；（7）培养基成分，无机营养和细胞分裂素含量过高。）培养基成分，无机营养和细胞分裂素含量过高。3.2.防治褐化的措施：防治褐化的措施：4.（1）春季取材，（）春季取材，（2）选择适宜的培养基，调整激素）选择适宜的培养基，调整激素用量；（用量；（3）适当控制温度和光照；（）适当控制温度和光照；（4）培养基中添加）培养基中添加抗氧化剂或吸附剂，如抗坏血酸、抗氧化剂或吸附剂，如抗坏血酸、PVP、活性炭等。、活性炭等。（5）及时转接至新鲜培养基。）及时转接至新鲜培养基。（五）黄化：（五）黄化：1.黄化发生的原因：黄化发生的原因：2.（1）培养基成分：缺铁，矿质营养不均衡；激素配比不）培养基成分：缺铁，矿质营养不均衡；激素配比不当，蔗糖用量不足；当，蔗糖用量不足；3.（2）培养条件：通气不良，乙烯含量高，温度不适，光）培养条件：通气不良，乙烯含量高，温度不适，光照不足等；照不足等；4.（3）pH值变化过大；（值变化过大；（4）抗生素影响，培养中添加不）抗生素影响，培养中添加不适宜浓度的抗生素。适宜浓度的抗生素。5.2.控制黄化发生的措施：控制黄化发生的措施：6.（1）检查培养基制作过程，保证各成分正确添加；）检查培养基制作过程，保证各成分正确添加；（2）调节培养基组成和）调节培养基组成和pH；（；（3）控制培养室温度，增）控制培养室温度，增加光照，使用透气性的瓶盖；（加光照，使用透气性的瓶盖；（4）减少或不使用抗生素。）减少或不使用抗生素。马铃薯的脱毒与快繁 马铃薯马铃薯 微型薯 危害有危害有1717种之多，如种之多，如X X病毒、病毒、S S病毒、病毒、Y Y病毒、病毒、M M病毒、病毒、A A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。马铃薯病毒可使块茎产量减少马铃薯病毒可使块茎产量减少50%80%50%80%。马铃薯病毒的种类全国现有马铃薯播种面积全国现有马铃薯播种面积300300多万公顷，每多万公顷，每年需合格种薯年需合格种薯4545亿公斤，脱毒原种亿公斤，脱毒原种4 4亿公斤，亿公斤，脱毒小薯或微型薯脱毒小薯或微型薯4545亿粒。亿粒。我国的马铃薯平均单产仅为我国的马铃薯平均单产仅为13.6013.60吨吨/公顷，公顷，是世界单产最高国瑞士（是世界单产最高国瑞士（48.8048.80吨吨/公顷）公顷）的的1/41/4。最主要的因素就是种薯质量差，品。最主要的因素就是种薯质量差，品种布局不合理。种布局不合理。我国马铃薯栽培现状我国马铃薯栽培现状 微茎尖组织培养微茎尖组织培养-诱导出苗诱导出苗-联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定-脱毒试管基础苗。脱毒试管基础苗。固体、液体培养基相结合固体、液体培养基相结合-扩扩繁基础苗繁基础苗-在防虫网室栽植或封闭温室在防虫网室栽植或封闭温室扦插扦插-原原种（或称脱毒小薯）。原原原原种（或称脱毒小薯）。原原种种-原种原种1 1代代-原种原种2 2代代-良种良种1 1代代-良种良种2 2代。代。1脱毒种薯生产程序（1）茎尖消毒一般在室内发芽，芽经热处理（一般在室内发芽，芽经热处理（3838）2 2周。周。然后取然后取1 1厘米的茎尖，水洗干净，无菌条件厘米的茎尖，水洗干净，无菌条件下先用下先用7070的酒精浸组织的酒精浸组织15-2015-20秒，再用秒，再用2 2次氯酸钠溶液浸泡次氯酸钠溶液浸泡4-5min4-5min，然后用无菌然后用无菌水冲洗水冲洗3 3次。次。2茎尖培养脱毒 把消毒芽在解剖镜下逐层剥去幼叶，露出把消毒芽在解剖镜下逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，留圆滑的生长点，留1-21-2个叶原基，个叶原基，0.20.30.20.3毫米，毫米，随即接种于随即接种于MSMS液体培养基上，每升加液体培养基上，每升加0.1mgNAA 0.1mgNAA、1mgBA 1mgBA、0.2mgGA30.2mgGA3，2%2%蔗糖，蔗糖，p Hp H值值5.85.8。（2）取材和接种取材和接种温度温度：21252125光照度光照度：2000-3000 lx2000-3000 lx光照时间光照时间：12h/d12h/d 2-3 2-3周长愈伤，周长愈伤，4-54-5周长绿点，周长绿点，3-3-6 6月长成月长成2-32-3厘米小芽。厘米小芽。（3）培养条件：）培养条件：培养成功的马铃薯脱毒苗，经培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISAELISA（试试剂盒）鉴定后（试管苗应每剂盒）鉴定后（试管苗应每3 3月检测一次，每年月检测一次，每年4 4次）采用固体、液体培养基相结合方法扩繁。次）采用固体、液体培养基相结合方法扩繁。取试管苗单节切段扦插在（或平放）固体取试管苗单节切段扦插在（或平放）固体培养基上，每瓶可插培养基上，每瓶可插2020个左右茎段，经个左右茎段，经20d20d左右左右发育成发育成510cm510cm高小植株，继续进行切段繁殖，此高小植株，继续进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖法速度快，每月可繁殖5858倍，试管苗多节接种倍，试管苗多节接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。（4）继代和生根MS+MS+2.0 mg/L6BA2.0 mg/L6BA+0.2 mg/L0.2 mg/L NAANAA+3%+3%蔗糖；蔗糖；20-2520-25，3000-4000LX3000-4000LX，14-16hr14-16hr光照；光照；每每3 3周继代一次，单芽茎段约周继代一次，单芽茎段约1 1厘米；厘米；原则试管苗用原则试管苗用2 2年年33年。年。马铃薯继代培养基：马铃薯继代培养基：马铃薯试管苗马铃薯试管苗炼苗室温度：炼苗室温度：白天白天23272327，夜间不低于，夜间不低于1414。炼苗具体方法炼苗具体方法：移植前：移植前7d7d左右，将长有左右，将长有3535片叶、片叶、高高23cm23cm的试管苗，在不开瓶口的状态下，从培养的试管苗，在不开瓶口的状态下，从培养室移至温室排好。为防止强光、高温灼伤试管苗，室移至温室排好。为防止强光、高温灼伤试管苗，在温室顶上加盖一层黑色遮阳网。在温室顶上加盖一层黑色遮阳网。(5)驯化 1 1、指示植物鉴定、指示植物鉴定在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定是最常在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定是最常用的方法，病毒、病毒和纺锤块状病毒用的方法，病毒、病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种。很容易通过汁液来接种。2 2、鉴定寄主的准备、鉴定寄主的准备马铃薯常用的鉴定马铃薯常用的鉴定指示植物指示植物有苋科的千日有苋科的千日红，茄科的洋酸浆、毛曼佗罗等。寄主植物红，茄科的洋酸浆、毛曼佗罗等。寄主植物应在无虫网室中培养。应在无虫网室中培养。（三）、马铃薯无病毒苗的鉴定三）、马铃薯无病毒苗的鉴定 叶片洗净后。在消毒的研钵中研成糊状，用叶片洗净后。在消毒的研钵中研成糊状，用纱布滤出汁液，再用蒸馏水稀释倍作为接种纱布滤出汁液，再用蒸馏水稀释倍作为接种物物(混入目的金刚砂混入目的金刚砂)。用左手心紧靠在鉴定寄主植物的背面，用左手心紧靠在鉴定寄主植物的背面，以右手指蘸取接种液，均匀的在叶背面擦过，以以右手指蘸取接种液，均匀的在叶背面擦过，以不造成叶片产生伤痕为度，最后把叶面上多余的不造成叶片产生伤痕为度，最后把叶面上多余的接种物用清水洗净，放置在的防虫室接种物用清水洗净，放置在的防虫室中，一般天可发病。中，一般天可发病。.接种液制备及接种接种液制备及接种（）（）直接块茎繁殖直接块茎繁殖（）（）扦插繁殖扦插繁殖（）（）组织培养切段繁殖组织培养切段繁殖 A A：继代培养继代培养 B B：低温保存低温保存（四）、马铃薯无病毒株的繁殖2010312