资源描述
第第 七七 章章 亲亲 和和 层层 析析物质分离纯化的依据物质分离纯化的依据 利用各分离物质理化特性的差异性利用各分离物质理化特性的差异性 但由于分离方法的特异性不强，导致分离纯化的收得率但由于分离方法的特异性不强，导致分离纯化的收得率较低；为了解决这一问题，一种有效的分离方法应运而生较低；为了解决这一问题，一种有效的分离方法应运而生亲和层析亲和层析亲和层析的概念亲和层析的概念 利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法第一节第一节 基基 本本 原原 理理一、基本原理一、基本原理1.1.亲和层析载体的组成亲和层析载体的组成配体配体L以共价键结合到活化的基质以共价键结合到活化的基质M上，构成固相载体上，构成固相载体2.2.原原 理理首先待分离物质首先待分离物质S借助静电引力、范得华力及结借助静电引力、范得华力及结构互补效应等作用吸附于固相载体上，与其它物构互补效应等作用吸附于固相载体上，与其它物质分离；然后通过改变起始缓冲液的质分离；然后通过改变起始缓冲液的pH值，或值，或增加离子强度，或加竞争性抑制剂等方法使待分增加离子强度，或加竞争性抑制剂等方法使待分离物从固相载体上脱离下来离物从固相载体上脱离下来二、分二、分 类类特异性配体亲和层析：特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子物配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异性强，结合力大性强，结合力大通用性配体亲和层析：通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者附容量，但分辨率不及前者三、特三、特 点点优点：优点：上样量大，分辨率高，操作步骤少，被分离物质的活上样量大，分辨率高，操作步骤少，被分离物质的活性不易丧失性不易丧失缺点：缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将其制备每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将其制备成固相载体成固相载体第第 二二 节节 操操 作作一、基质的选择一、基质的选择一种理想的亲和层析基质应满足的条件一种理想的亲和层析基质应满足的条件特异性强（非特异性吸附少）特异性强（非特异性吸附少）高度的亲水性高度的亲水性性质稳定性质稳定具有大量容易被活化的基团，且容易与配体结合具有大量容易被活化的基团，且容易与配体结合适当的孔径和筛孔数目适当的孔径和筛孔数目常用亲和吸附剂采用的基质常用亲和吸附剂采用的基质 一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。琼脂糖以及多孔玻璃珠等。商品纤维素：商品纤维素：具有非特异吸附性，且本身结构不均一具有非特异吸附性，且本身结构不均一聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后，多孔性会大大与配体结合后，多孔性会大大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之间引入间隔物间引入间隔物玻璃珠：玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也有一定的吸附力有一定的吸附力 目前使用最广泛的是目前使用最广泛的是Sepharose 4B，它是有，它是有D-半乳糖和半乳糖和3，6-脱水脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量较大分子物质，且吸附容量较大二、配体的选择二、配体的选择 通常可供选择的配体有抑制剂、效应物、酶的辅助因通常可供选择的配体有抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体及其他物质（如凝集素、子、类似底物、抗体及其他物质（如凝集素、polyA、polyU、染料和金属等）等、染料和金属等）等1.与被纯化物质有适宜的亲和力与被纯化物质有适宜的亲和力 一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是不利的不利的如：如：用抗生物素蛋白（亦称亲和素）作为配体纯化含生物素的用抗生物素蛋白（亦称亲和素）作为配体纯化含生物素的羧化酶时，由于抗生物素蛋白羧化酶时，由于抗生物素蛋白-生物素解离常数接近生物素解离常数接近110-15molmol，要其分离，必须在，要其分离，必须在6mol/Lmol/L盐酸胍溶液，盐酸胍溶液，pH1.5的剧的剧烈条件下才能使羧化酶释放出来，而在此条件下，羧化酶的活烈条件下才能使羧化酶释放出来，而在此条件下，羧化酶的活性大部分已发生不可逆性丧失性大部分已发生不可逆性丧失2.2.具有与基质共价结合的基团具有与基质共价结合的基团 该基团和基质结合后，对配体与待纯化物质的亲合该基团和基质结合后，对配体与待纯化物质的亲合力没有影响或影响不明显力没有影响或影响不明显三、亲和吸附剂的制备三、亲和吸附剂的制备偶联方法偶联方法物理方法物理方法 包埋法包埋法和和吸附法吸附法等等化学方法化学方法偶联法偶联法：利用：利用CNBr、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜、亚胺二烯酸等化学试剂使配体与活化的基质偶联烯砜、亚胺二烯酸等化学试剂使配体与活化的基质偶联或形成螯合物或形成螯合物交联法交联法：即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试剂交联基质：即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试剂交联基质与配体与配体 CNBr是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤结合配体、配体结合量的测定等步骤1.1.活活 化化将一定量的贮存基质用布氏漏斗抽干，然后加入等量的将一定量的贮存基质用布氏漏斗抽干，然后加入等量的D.W和和2mol/L 2mol/L 溶液（溶液（pH11pH111212），混匀），混匀称取适量固体称取适量固体CNBr（5050300mg/g300mg/g贮存胶），溶于二甲基甲酰贮存胶），溶于二甲基甲酰胺溶液中胺溶液中活化活化：将溶好的：将溶好的CNBr溶液加入琼脂糖悬浮液中活化溶液加入琼脂糖悬浮液中活化洗涤：将冷却的反应液转入布氏漏斗中，用洗涤：将冷却的反应液转入布氏漏斗中，用1020倍体积的倍体积的预冷水及预冷水及0.07mol/L 0.07mol/L 溶液（溶液（pH8.5）洗涤）洗涤u边加边搅拌边加边搅拌u反应液应始终保持反应液应始终保持pH11pH111212u反应会放热，要用水浴中加碎冰的方法控制温度在反应会放热，要用水浴中加碎冰的方法控制温度在20维持维持8 810min10min后，再加入大量碎冰使反映体系快速冷后，再加入大量碎冰使反映体系快速冷却至却至4或更低温度或更低温度u整个活化过程越快越好：因为活化的整个活化过程越快越好：因为活化的SepharoseSepharose在碱性在碱性条件下不稳定条件下不稳定注意注意2.2.偶偶 联联 向已经活化和洗涤的基质中加入等体积的向已经活化和洗涤的基质中加入等体积的0.20.25 mol/L 缓冲液（含缓冲液（含0.5 mol/L NaCl和和110mol/ml）混合，缓慢搅拌（室温）混合，缓慢搅拌（室温2h;4过夜）至配过夜）至配体与基质充分偶联体与基质充分偶联注意：注意：对于偶联极牢固（如多结合位点）会失活的大分子物对于偶联极牢固（如多结合位点）会失活的大分子物质配体，则应质配体，则应 在低在低pH（6.06.5）缓冲液中反应；或将活）缓冲液中反应；或将活化的基质事先置化的基质事先置pH8.3的碱性溶液中部分水解，适当降低其的碱性溶液中部分水解，适当降低其偶联活性；从而提高配体的活性偶联活性；从而提高配体的活性3.3.洗洗 涤涤 在基质和配体偶联后的溶液中加入用在基质和配体偶联后的溶液中加入用HCl调调pH9.0的乙醇的乙醇胺溶液，在搅拌下反应胺溶液，在搅拌下反应15min，或在弱碱溶液中放置过夜，或在弱碱溶液中放置过夜，或在或在Tris-HCl溶液，溶液，pH8.0，放置，放置2h；然后室温条件下分别；然后室温条件下分别用用NaHCO3溶液、溶液、Na2B4O7溶液溶液、NaCl溶液洗涤吸附剂，除溶液洗涤吸附剂，除去过剩的配体和乙醇胺去过剩的配体和乙醇胺4.配体结合量的测定配体结合量的测定 配体结合量是表示吸附剂中束缚的配体浓度的指标，配体结合量是表示吸附剂中束缚的配体浓度的指标，通常作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。一般用每毫升通常作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。一般用每毫升或每克贮存胶束缚的配体量来表示，如或每克贮存胶束缚的配体量来表示，如 mg/ml 其测定方法有直接测定法和间接测定法其测定方法有直接测定法和间接测定法（1）直接测定法）直接测定法2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验三硝基苯磺酸钠的颜色试验 在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的匀浆液中加入在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的匀浆液中加入1ml饱和的硼饱和的硼酸钠溶液，酸钠溶液，3滴滴3%的的2,4,6-三硝基苯磺酸盐水溶液，室温反三硝基苯磺酸盐水溶液，室温反应应2h。不同的亲和吸附剂具有不同的颜色：。不同的亲和吸附剂具有不同的颜色：未被配体取代的基质呈黄色未被配体取代的基质呈黄色配体为脂肪族氨基衍生物的呈橙色配体为脂肪族氨基衍生物的呈橙色配体为芳香族氨基衍生物的呈橙红色配体为芳香族氨基衍生物的呈橙红色未取代的肼衍生物呈深红色未取代的肼衍生物呈深红色 然后根据各种显色物质的吸光度值计算配体的含量（比色然后根据各种显色物质的吸光度值计算配体的含量（比色法）法）根据配体的特性进行测定根据配体的特性进行测定 首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下，种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下，用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计算出配体的含量）算出配体的含量）（2）间接测定法）间接测定法推算法推算法 将偶联过程中加入配体的量减去偶联后洗脱出来的配体量，将偶联过程中加入配体的量减去偶联后洗脱出来的配体量，除以沉积胶的量，即可推算出配体的结合量（如除以沉积胶的量，即可推算出配体的结合量（如mg/gmg/g沉积胶）沉积胶）根据亲和吸附剂对被吸附物的操作容量计算配体的结合量根据亲和吸附剂对被吸附物的操作容量计算配体的结合量 将亲和吸附剂装入柱中，加入待分离大分子物质，使其结合量达到将亲和吸附剂装入柱中，加入待分离大分子物质，使其结合量达到最大，先用适当的洗涤剂洗去杂质，然后用特异性洗脱剂洗出待分离最大，先用适当的洗涤剂洗去杂质，然后用特异性洗脱剂洗出待分离的大分子物质，根据分离出的大分子物质的量，计算配体的结合量的大分子物质，根据分离出的大分子物质的量，计算配体的结合量 将少量纯品大分子物质陆续加入到亲和层析柱中，直至饱和平衡，将少量纯品大分子物质陆续加入到亲和层析柱中，直至饱和平衡，然后根据上样量推算出配体的结合量然后根据上样量推算出配体的结合量四、特异性吸附四、特异性吸附 当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物的浓度越来越大，呈恒定增加。的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在，使样品中有效成分的移动由于配体的存在，使样品中有效成分的移动受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不同，所以可得到分离和纯化同，所以可得到分离和纯化 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力亲合力有关有关外，还与样品的外，还与样品的pH值、离子强度值、离子强度和和反应时间反应时间有关有关例例1 图图7-6，Sepharose-氨基乙酰氨基乙酰-D色氨酸甲酯亲和层析研究发现色氨酸甲酯亲和层析研究发现 在高在高pH条件下，吸附剂对条件下，吸附剂对-胰凝乳蛋白酶的吸附量大胰凝乳蛋白酶的吸附量大 在高离子强度条件下，吸附剂对在高离子强度条件下，吸附剂对-胰凝乳蛋白酶的吸附量小胰凝乳蛋白酶的吸附量小例例2 用用Con.A-Sepharose亲和层析柱分离亲和层析柱分离-球蛋白时，上样后反应球蛋白时，上样后反应1h比比3h得率高得率高五、分离大分子物质五、分离大分子物质 上样后，可用大量平衡液（即起始缓冲液）洗去无亲和力的杂蛋上样后，可用大量平衡液（即起始缓冲液）洗去无亲和力的杂蛋白，有时也可用不同的缓冲液洗涤，使柱子上只剩下专一吸附的大分白，有时也可用不同的缓冲液洗涤，使柱子上只剩下专一吸附的大分子物质；最后用相应的洗脱剂洗脱有效成分，其具体操作方法可根据子物质；最后用相应的洗脱剂洗脱有效成分，其具体操作方法可根据配体与有效成分的亲合力决定配体与有效成分的亲合力决定亲合力较小时，可用大体积的平衡液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰亲合力较小时，可用大体积的平衡液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰亲合力一般时，主要靠改变缓冲液的性质（如改变亲合力一般时，主要靠改变缓冲液的性质（如改变pH或离子强度或者或离子强度或者同时改变同时改变pH和离子强度），降低复合物之间的亲合力而解离洗脱和离子强度），降低复合物之间的亲合力而解离洗脱注意：注意：用酸性或碱性用酸性或碱性pH值洗脱是，可得到十分集中的蛋白峰，但洗脱收值洗脱是，可得到十分集中的蛋白峰，但洗脱收集的蛋白质液应立即中和、稀释或透析，以免造成有效成分活性丧失集的蛋白质液应立即中和、稀释或透析，以免造成有效成分活性丧失亲合力较强时，可用与配体竞争的溶液或用蛋白质变性剂洗脱亲合力较强时，可用与配体竞争的溶液或用蛋白质变性剂洗脱竞争性洗脱剂竞争性洗脱剂 专一性强，并能洗脱出和配体特异性结专一性强，并能洗脱出和配体特异性结合的大分子物质；但洗脱需要的洗脱液较多合的大分子物质；但洗脱需要的洗脱液较多剧烈的洗脱条件剧烈的洗脱条件 如用盐酸胍、尿素等变性剂配制的溶液如用盐酸胍、尿素等变性剂配制的溶液洗脱蛋白质等生命大分子物质时洗脱液须及时处理恢复有洗脱蛋白质等生命大分子物质时洗脱液须及时处理恢复有效成分的活性；如透析法等效成分的活性；如透析法等六、亲和层析柱的再生六、亲和层析柱的再生 用过的亲和层析柱应连续用大量的洗脱液或高浓度用过的亲和层析柱应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，并用平衡缓冲液重新平衡层的盐溶液彻底洗涤柱子，并用平衡缓冲液重新平衡层析柱析柱第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量影响吸附剂操作容量的因素影响吸附剂操作容量的因素配体的性质配体的性质配体在吸附剂中的含量配体在吸附剂中的含量配体与吸附物结合时的位阻效应大小配体与吸附物结合时的位阻效应大小基质的多孔性基质的多孔性操作条件操作条件一、在配体和基质间引入一、在配体和基质间引入“手臂手臂”1.原理原理 在配体和基质间引入在配体和基质间引入“手臂手臂”，使配体离开基质的，使配体离开基质的骨架，减小基质的立体（空间）位阻效应，增加配骨架，减小基质的立体（空间）位阻效应，增加配体的活动度和伸入溶液的深度，提高吸附剂的操作体的活动度和伸入溶液的深度，提高吸附剂的操作容量（特别使用于小分子配体）容量（特别使用于小分子配体）例例用对氨基苯硫代吡喃作为配体，用对氨基苯硫代吡喃作为配体，Sepharose4B为基为基质纯化质纯化-半乳糖苷酶时，如果将配体直接连接在基质半乳糖苷酶时，如果将配体直接连接在基质上，则不能吸附上，则不能吸附-半乳糖苷酶，而当在基质和配体之间引入半乳糖苷酶，而当在基质和配体之间引入3,3-二氨基二丙胺琥珀酰胺手臂时，则可有效吸附二氨基二丙胺琥珀酰胺手臂时，则可有效吸附-半乳糖苷酶半乳糖苷酶注意：注意：并非手臂越长越好，因为太长可能折叠弯曲，反而降低并非手臂越长越好，因为太长可能折叠弯曲，反而降低吸附容量吸附容量2.吸附剂衍生物的制备吸附剂衍生物的制备琼脂糖活化琼脂糖活化将氨基化合物（如将氨基化合物（如1,6-己二胺己二胺;6-氨基己酸等）共价结氨基己酸等）共价结合于活化的琼脂糖上制成稳定的琼脂糖衍生物合于活化的琼脂糖上制成稳定的琼脂糖衍生物在碳二亚胺存在下，基质通过手臂与含羧基或氨基的任在碳二亚胺存在下，基质通过手臂与含羧基或氨基的任何化合物结合成固相载体何化合物结合成固相载体将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反应后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，应后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生成一系列具有不同长度即可生成一系列具有不同长度“手臂手臂”的亲和吸附剂的亲和吸附剂二、增加配体取代的程度二、增加配体取代的程度 对于解离常数较大的配体而言，增加配体在基质中的浓度也对于解离常数较大的配体而言，增加配体在基质中的浓度也是增加吸附剂结合量的有效方法是增加吸附剂结合量的有效方法 在配体量一定时，可通过在配体量一定时，可通过提高基质活化时的提高基质活化时的pH值和增加值和增加CNBr的用量的用量，增加基质活性基团的数量，从而增加基质对配体，增加基质活性基团的数量，从而增加基质对配体的偶联量的偶联量 当基质活化度一定时，可通过当基质活化度一定时，可通过提高偶联反应液的提高偶联反应液的pH值或值或增加配体浓度增加配体浓度来增加配体的偶联量来增加配体的偶联量三、配体与基质以最小的键连接三、配体与基质以最小的键连接 配体以较少的共价键连接到载体时，有利于保持蛋白质、配体以较少的共价键连接到载体时，有利于保持蛋白质、多肽类配体自身的高级结构状态，保持其生物活性。蛋白质多肽类配体自身的高级结构状态，保持其生物活性。蛋白质一般以非质子化形式的游离一般以非质子化形式的游离-NH-NH2 2与活化的基质反应，当偶连与活化的基质反应，当偶连反应在反应在pHpH9.59.5条件下进行时，配体的大量游离氨基都会与基条件下进行时，配体的大量游离氨基都会与基质连接，而质连接，而在相对不利的在相对不利的pHpH条件下（如条件下（如pHpH7.07.0）进行时，就）进行时，就能减少配体与基质连接的键能减少配体与基质连接的键 例：在例：在pH6.0pH6.06.56.5条件下偶联的抗体衍生物较条件下偶联的抗体衍生物较pH9.5pH9.5偶联的偶联的衍生物对抗原的吸附量高得多衍生物对抗原的吸附量高得多四、基质多孔性的影响四、基质多孔性的影响 亲和层析的基质多用生物胶（聚丙烯酰胺凝胶）和琼脂糖亲和层析的基质多用生物胶（聚丙烯酰胺凝胶）和琼脂糖凝胶，但生物胶在偶联配体后会导致凝胶，但生物胶在偶联配体后会导致多孔性降低，致使结合多孔性降低，致使结合物（被分离组分）不能渗透到凝胶筛孔中与配体结合物（被分离组分）不能渗透到凝胶筛孔中与配体结合；而琼；而琼脂糖多孔性的稳定性较生物胶好，故多选择琼脂糖作为基质脂糖多孔性的稳定性较生物胶好，故多选择琼脂糖作为基质提高吸附剂的吸附容量提高吸附剂的吸附容量五、其他五、其他 样品浓度、样品浓度、pHpH值、离子强度、上样速度等因素也会对值、离子强度、上样速度等因素也会对提高操作容量产生影响提高操作容量产生影响第第 四四 节节 应应 用用 实实 例例一、纯化大分子物质一、纯化大分子物质1.抗原抗原、抗体及其结合物、抗体及其结合物 由于由于SPASPA（金黄色葡萄球菌蛋白（金黄色葡萄球菌蛋白A A）能与）能与IgGIgG结合，结合，且且IgGIgG结结合合SPASPA后吸附抗原的特性不变，所以利用后吸附抗原的特性不变，所以利用SPA-SepharoseCl-4BSPA-SepharoseCl-4B固固相载体可以分离相载体可以分离AgAg、AbAb、Ag-Ag-AbAb2.2.糖蛋白糖蛋白 目前用于纯化糖蛋白的亲和配体主要是凝集素目前用于纯化糖蛋白的亲和配体主要是凝集素（lectinlectin），即以），即以lectin-Sepharose-4Blectin-Sepharose-4B为载体分离各为载体分离各种糖蛋白。种糖蛋白。如如 Con.ACon.A用于分离含甘露糖和葡萄糖苷的糖蛋白用于分离含甘露糖和葡萄糖苷的糖蛋白 云扁豆凝集素（云扁豆凝集素（lenlillenlil）用于分离甲状腺球蛋白）用于分离甲状腺球蛋白 反过来，用糖蛋白作为配体，也可用于分离纯化反过来，用糖蛋白作为配体，也可用于分离纯化相应的凝集素相应的凝集素3.3.含巯基蛋白含巯基蛋白 用活化的用活化的-SH-Sepharose-4B-SH-Sepharose-4B（容量低）或（容量低）或巯基丙酰巯基丙酰-Sepharose-6BSepharose-6B（容量高）作吸附剂可用于分离含（容量高）作吸附剂可用于分离含-SH-SH的蛋白的蛋白质、肽、酶和核苷酸等（洗脱剂用含质、肽、酶和核苷酸等（洗脱剂用含L-L-CysCys的缓冲液，即可的缓冲液，即可洗脱被分离的巯基化合物）洗脱被分离的巯基化合物）4.核酸核酸用用PolyU-SepharosePolyU-Sepharose吸附剂可分离吸附剂可分离mRNAmRNA用用PolyA-SepharosePolyA-Sepharose吸附剂可分离束缚吸附剂可分离束缚mRNAmRNA的蛋白质、的蛋白质、束缚束缚PolyAPolyA的的RNARNA、依赖、依赖DNADNA的的RNA-RNA-polpol等等5.其他其他 直接利用基质与某些化合物之间的亲合力来分离有效成直接利用基质与某些化合物之间的亲合力来分离有效成分。如用葡聚糖凝胶或酸化的琼脂糖凝胶分离凝集素分。如用葡聚糖凝胶或酸化的琼脂糖凝胶分离凝集素二、研究酶的结构与功能二、研究酶的结构与功能 在对酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学在对酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学试剂改变酶的功能团。但这种操作往往会使酶的活力试剂改变酶的功能团。但这种操作往往会使酶的活力发生不完全丧失，那么剩余的酶活力到底是发生不完全丧失，那么剩余的酶活力到底是残留的酶残留的酶的活力呢，还是的活力呢，还是酶活力降低后酶活力降低后的活力呢？用高亲和力的活力呢？用高亲和力的层析法可分离开的层析法可分离开 如：葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，可导致如：葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，可导致酶活力下降酶活力下降83%，剩余，剩余17%。那么酶活力下降是由什。那么酶活力下降是由什么原因导致的呢？研究表明，标记物与葡萄球菌核酸么原因导致的呢？研究表明，标记物与葡萄球菌核酸酶是通过酶活性中心的酶是通过酶活性中心的TyrTyr结合的。那么用酶的底物作结合的。那么用酶的底物作为配体，用亲和层析法可将其分开（因为失去活性中为配体，用亲和层析法可将其分开（因为失去活性中心的酶与吸附剂无亲合力）心的酶与吸附剂无亲合力）三、实例三、实例
展开阅读全文